Estudio comparativo sobre los componentes químicos y el contenido de Cistanche Tubulosa (Guanhua Roucongrong) y sus productos procesados

Abstracto

Objetivo:Investigar la variación (patrones de cambio) en el contenido de constituyentes químicos de los productos procesados ​​decistanche tubulosa(Guanhua Roucongrong).
Métodos:Se seleccionaron cinco tipos de piezas de decocción, incluidas rodajas crudas, rodajas cocidas al vapor con vino, rodajas cocidas al vapor, rodajas procesadas con frijoles negros y rodajas procesadas con jugo de frijoles negros. Se estableció un método de huellas dactilares de HPLC y se combinó con evaluación de similitud, análisis de conglomerados (CA) y análisis de componentes principales (PCA) para detectar y confirmar componentes diferenciales entre el producto crudo y los productos procesados. Se emplearon métodos quimiométricos y HPLC para determinar y comparar las diferencias en los contenidos de glucósidos feniletanoides totales, polisacáridos, flavonoides totales y cuatro glucósidos feniletanoides totales entre las muestras crudas y procesadas.
Resultados:Huellas dactilares HPLC decistanche tubulosa and its processed products were established. With Mark peak matching, 9 common peaks were assigned for raw slices, whereas 11 common peaks were assigned for the other four processed products. Peaks No. 2 and No. 7 were differential chromatographic peaks. By comparison with reference standards, four chromatographic peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Fingerprints of the processed products showed similar profiles with the same number of common peaks; similarity values were all >0.9. Utilizando el equinacósido como pico de referencia, la RSD de los tiempos de retención relativos de los picos comunes entre diferentes productos procesados ​​osciló entre el 0,11% y el 0,82%, mientras que la RSD de las áreas relativas de los picos osciló entre el 15,46% y el 76,07%. Cuando la distancia entre clases se estableció en 10, CA clasificó las lonchas crudas y los productos procesados ​​en tres categorías. PCA indicó diferencias de composición entre muestras crudas y procesadas: las 11 variables máximas se redujeron a tres componentes principales; diferentes componentes principales correlacionados con diferentes picos cromatográficos. Con base en la matriz de componentes y la ponderación lineal, las puntuaciones integrales mostraron que las rebanadas procesadas con jugo de frijol negro y las rebanadas cocidas al vapor con vino amarillo y con agua al vapor obtuvieron calificaciones más altas. Los contenidos en las muestras crudas y procesadas fueron los siguientes: glucósidos feniletanoides totales 3,80% –7,07%, polisacáridos totales 5,85% –6,70%, flavonoides totales 14,16% –24,26%; equinacósido 4,11% –5,99%, acteosido 0,67%–1,34%, cistanósido A 0,06%–0,36% e isoactósido 0,25%–1,66%. Existían diferencias considerables entre los productos elaborados.
Conclusión:El método de huellas dactilares HPLC establecido tiene una gran especificidad y distingue eficazmente las rodajas crudas de los productos procesados.cistanche tubulosa, y es adecuado para el análisis cualitativo y cuantitativo de echinacósido, acteósido, cistanósido A e isoactósido en el fármaco crudo y los productos procesados. Los perfiles comparativos y los cambios de contenido entre diferentes muestras pueden proporcionar una base científica para la identificación y el control de calidad decistanche tubulosay sus diversos productos elaborados.

Palabras clave: cistanche tubulosa; tratamiento; constituyentes químicos; huella dactilar; cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

 

1 Introducción

cistanche tubulosa(Schenk) Wight (Guanhua Roucongrong) es una hierba perenne de Orobanchaceae y es una fuente oficial de Cistanches Herba en la Farmacopea de la República Popular China (en adelante, la "Farmacopea China"). La parte medicinal es el tallo carnoso seco con hojas escamosas. Es de naturaleza cálida, de sabor dulce y salado, y ingresa a los meridianos del riñón y del intestino grueso, con funciones de tonificar el yang del riñón, beneficiar la esencia y la sangre y humedecer los intestinos para aliviar el estreñimiento [1]. Los estudios farmacológicos modernos han confirmado múltiples actividades, como la antienvejecimiento, la mejora del sistema inmunológico, los efectos tonificantes y afrodisíacos de los riñones, los efectos laxantes y la actividad antihipertensiva.

cistanche tubulosaes rico en glucósidos feniletanoides, iridoides y sus glucósidos, lignanos, ésteres de oligosacáridos, polioles, polisacáridos, flavonoides y otros constituyentes [2]. Entre ellos, los glucósidos feniletanoides son los principales componentes activos y los compuestos más abundantes; también son los componentes marcadores para la determinación del contenido en la farmacopea y exhiben diversas bioactividades, como efectos antioxidantes, promoción metabólica, mejora del aprendizaje y la memoria y mejora de la función sexual [3].

cistanche tubulosaPrefiere tierras salino-álcalis y regiones desérticas de Gobi, parasita las raíces deTamarixspp., y se distribuye principalmente en Mongolia Interior, Xinjiang y Gansu en China [4]. Las áreas geoauténticas silvestres y cultivadas incluyen el condado de Minfeng, Yutian, Pishan y Moyu en la prefectura de Hotan, Xinjiang. Su procesamiento se desarrolla principalmente en trozos de decocción en rodajas, materiales herbales crudos, extractos, productos para la salud y alimentos funcionales; entre estos, las piezas de decocción comerciales siguen siendo comunes. Sin embargo, en el mercado, los diferentes productos procesados ​​(como lonchas crudas, lonchas procesadas con vino, lonchas inactivadas con enzimas a alta temperatura y lonchas cocidas al vapor con agua) a menudo se mezclan y son difíciles de distinguir.

La elaboración de Cistanches Herba ha ido evolucionando con el tiempo, desde registros antiguos comoTaiping Shenghui Fang, Zhenglei Bencao, ycolmillo puji[5–7] (p. ej., lavar con vino, sofreír con vino, cocinar al vapor/hornear con vino, remojar/hornear en seco con vino, hervir en agua, cocinar al vapor tres veces y freír con mantequilla) hasta métodos modernos como la maceración del vino (cocer al vapor), la cocción al vapor simple, "cuatro cocciones al vapor y cuatro soles" y el procesamiento de frijoles negros [8]. Diferentes métodos de procesamiento pueden afectar el contenido de componentes activos, la seguridad y la actividad biológica. Cai Hong et al. [9] encontraron que la inactivación enzimática de material fresco con agua caliente a 70 grados durante 6 minutos dio como resultado que los contenidos de equinacósido y acteósido fueran 7,3 veces y 6,5 veces mayores que los del secado directo al sol, respectivamente. Tie Xiaoyan et al. [10] informaron que el procesamiento con vapor mejoró notablemente la calidad de las piezas de decocción en comparación con los materiales frescos. Chen Weijun et al. [11] observaron que el contenido de betaína disminuía después del procesamiento del vino, la sal y el vapor en comparación con los productos frescos. Zhang Chao et al. [12] mostraron que durante la cocción al vapor del vino, con un tiempo de cocción más prolongado, el equinacósido, el acteósido, el cistanósido A y el 2′-acetilactósido disminuyeron gradualmente, mientras que el isoactósido aumentó significativamente.

La actual edición de 2025 de la Farmacopea China solo establece límites para el echinacósido y el acteósido en rodajas crudas y en rodajas cocidas al vapor con vino, pero no especifica componentes marcadores para otros productos procesados ​​y carece de métodos eficaces de control del contenido. Por lo tanto, analizar y comparar componentes característicos y explorar patrones de cambios de composición son particularmente importantes para la identificación cualitativa y el control cuantitativo de productos crudos y procesados.

La toma de huellas dactilares de la medicina tradicional china (MTC) es una representación holística de los componentes químicos. Con ventajas de integridad, especificidad y rica información, se usa ampliamente en la evaluación del control de calidad de medicamentos y preparaciones crudos, alineación con estándares internacionales, identificación de autenticidad, monitoreo del proceso de fabricación e investigación sobre sustancias farmacodinámicas [13]. Con base en las huellas dactilares de HPLC, este estudio seleccionó echinacósido, acteósido, cistanósido A e isoactósido como marcadores de calidad, y empleó análisis de similitud, CA y PCA combinados con determinación de contenido para comparar constituyentes químicos y patrones de cambio de contenido entre diferentes productos procesados, proporcionando una base científica para la identificación y el control de calidad.

 

2 Instrumentos y Materiales

2.1 Instrumentos

sistema HPLC U3000 (Thermo Fisher); UPL-111-20R sistema de agua ultrapura (Sichuan Youpu); balanza electrónica AB 265-S (Mettler Toledo); KQ-5200DA extractor/limpiador ultrasónico (Kunshan Ultrasónico); Horno de secado eléctrico GZX-9240MBE (Shanghai Boxun); UV-2600 Espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu, China).

2.2 Fármacos y reactivos

Frescocistanche tubulosa(Lote No. 20241008) fue suministrado por Xinjiang Congrongtang Biotechnology Co., Ltd. y autenticado por el investigador Wang Guoping (Instituto de Materia Médica de la Región Autónoma Uygur de Xinjiang) como el tallo carnoso decistanche tubulosa(Schenk) Wight (Orobanchaceae).

Sustancias de referencia: D-glucosa anhidra (Lote No. 361810, 100,00%, Shenzhen Jinhui Biotechnology Co., Ltd.); echinacósido (N.º de lote . 111670-201907), rutina (N.º de lote . 100080-202012), acteósido (N.º de lote . 11530-202315), cistanósido A (N.º de lote . 313512) e isoactósido (N.º de lote . 313413), con una pureza del ensayo de HPLC mayor o igual a 91,8 %, 92,2 %, 97,6 %, 98,06 % y 98,09%, respectivamente, de los Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos (China).(Nota: una línea de pureza está truncada en el texto proporcionado; lo anterior sigue a la parte legible).

Vino de arroz amarillo (tipo semiseco, alcohol 16%; Zhejiang Guyuelongshan Shaoxing Wine Co., Ltd.); metanol y acetonitrilo (grado HPLC, Fisher Scientific, EE. UU.). Otros reactivos eran de calidad analítica.

3 métodos y resultados

3.1 Preparación de Rebanadas Crudas y Productos Procesados ​​decistanche tubulosa

Se utilizaron los siguientes métodos para preparar rebanadas crudas y productos procesados, cada uno en 6 lotes.

Rebanadas crudas:FrescocistancheSe cortó en rodajas de 3 mm y se secó a 60 grados.

Método de cocción al vapor:Según la literatura [14], se mezclaron 20 g de rodajas limpias con 6 ml de agua destilada en un recipiente sellado, se humedecieron durante 4 h [12], se cocieron al vapor sobre agua durante 12 h, se enfriaron y se secaron a 60 grados.

Método de elaboración del vino:Elaborado según el método de guisado o vapor de vino (Regla General 0213, Farmacopea China).

Procesamiento revuelto con frijoles negros:Preparado segúnMateria Médica China(Zhonghua Bencao) bajo Cistanches Herba; Se agregaron frijoles negros a razón de 1 kg por 10 kg decistanchematerial.

Procesamiento de jugo de frijol negro:Las rodajas se mezclaron con jugo de frijol negro y luego se procesaron mediante el método de cocción al vapor anterior; la dosis de frijoles negros fue la misma que la anterior.

3.2 Determinación de los ítems de inspección

La humedad se determinó mediante secado en horno (Regla General 0832, Farmacopea China); ceniza total por Regla General 2302; extractivos solubles en alcohol por el método de maceración en frío según Norma General 2201. Los resultados se muestran en el Cuadro 1.

 

3.3 Análisis comparativo de huellas dactilares HPLC decistanche tubulosay sus productos procesados

3.3.1 Condiciones cromatográficas

Columna Waters Xterra RP18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm). Fase móvil: acetonitrilo (A)–0,1% de ácido fórmico (B) con elución en gradiente: 0–12 min, 14% A → 17% A; 12 a 30 min, 17 % A → 19 % A; 30–35 min, 19 % A → 14 % A; 35–50 min, 14 % A. Caudal: 1,0 ml·min⁻¹. Temperatura de la columna: 30 grados. Longitud de onda de detección: 330 nm. Volumen de inyección: 10 µL.

3.3.2 Preparación de soluciones

Soluciones de referencia:Las sustancias de referencia de echinacósido, acteósido, cistanósido A e isoactósido se pesaron con precisión y se disolvieron en metanol al 50 % en matraces volumétricos de 10 ml para obtener soluciones de 1,1301, 0,2294, 0,2255 y 0,2109 mg·mL⁻¹, respectivamente; Se filtra para obtener soluciones finales.

Soluciones de muestra:Se pesaron con precisión 0,5 g de polvo de malla 80 de muestras crudas y procesadas, se extrajeron con metanol al 50 % en un matraz volumétrico de 25 ml, se sometieron a ultrasonidos (200 W, 40 kHz) durante 40 minutos, se enfriaron, se mezclaron, se dejaron reposar y se filtraron a través de una membrana de 0,22 µm; se utilizó el filtrado.

3.3.3 Validación del método (huella digital)

3.3.3.1 Precisión

Se inyectó la misma solución de muestra seis veces consecutivas. Utilizando equinacósido como pico de referencia, la RSD de los tiempos de retención relativos de los picos comunes fue<0.48% and the RSD of relative peak areas was <2.86%, indicating good instrumental precision.

3.3.3.2 Repetibilidad

Se prepararon seis soluciones de muestra paralelas a partir del mismo lote (corte crudo S1). Usando echinacósido como pico de referencia, la RSD de los tiempos de retención relativos fue<0.07% and the RSD of relative peak areas was <2.77%, indicating good method repeatability.

3.3.3.3 Estabilidad

La misma solución de muestra se analizó a las 0, 3, 6, 9, 12 y 24 h. Usando echinacósido como pico de referencia, la RSD de los tiempos de retención relativos fue<0.11% and the RSD of relative peak areas was <2.33%, indicating stability within 24 h.

3.3.4 Establecimiento de huellas dactilares

Treinta lotes decistanche tubulosay se analizaron los productos procesados. Se utilizó el “Sistema de Evaluación de Similitud para Huellas Dactilares Cromatográficas de la Medicina Tradicional China” (edición 2012). La rebanada cruda S1 y la rebanada J1 cocida al vapor con vino amarillo se utilizaron como huellas dactilares de referencia; Se aplicaron el método medio y un ancho de ventana de tiempo de 0,1 min para la corrección multipunto y la coincidencia de picos Mark para generar huellas dactilares (Figuras 1-2), y se obtuvieron cromatogramas superpuestos con estándares de referencia mixtos (Figura 3).

Los resultados mostraron que los cuatro productos procesados ​​tenían perfiles de huellas dactilares similares a los de las rebanadas crudas. Las rebanadas crudas tuvieron 9 picos comunes, mientras que las rebanadas procesadas con vino al vapor, cocidas al vapor, procesadas con frijoles negros y procesadas con jugo de frijoles negros tuvieron 11 picos comunes. Ambos compartían nueve picos comunes. Los picos No. 2 y No. 7 fueron picos característicos que distinguían las rebanadas crudas de los productos procesados. Los perfiles de huellas dactilares entre los cuatro productos procesados ​​fueron similares y no reflejaron claramente diferencias entre ellos.

3.3.5 Análisis de similitud

Using J1 as the reference fingerprint, similarity analysis was performed for different processed products (Table 2). Similarities were all >0,9, lo que indica características similares de huellas dactilares entre diferentes productos procesados.

3.3.6 Identificación de picos comunes

Al comparar los tiempos de retención con estándares de referencia mixtos y el cromatograma de corte sin procesar, se identificaron cuatro picos cromatográficos: pico 4, echinacósido; Pico 9, cistanósido A; Pico 10, actósido; Pico 11, isoacteósido (Figura 2). Con el pico 4 (equinacósido) como pico de referencia, los valores de RSD de los tiempos de retención relativos de los picos comunes entre diferentes lotes de los cuatro productos procesados ​​oscilaron entre el 0,11 % y el 0,82 %, y los valores de RSD de las áreas relativas de los picos oscilaron entre el 15,46 % y el 76,07 %.

3.3.7 Análisis de conglomerados

Se utilizó SPSS 27.0 para el análisis de conglomerados de lonchas crudas y productos procesados. Se aplicó el enlace entre grupos y se utilizó la distancia euclidiana al cuadrado (Figura 4). Cuando la distancia entre clases era<5, water-steamed slices and wine-steamed slices clustered together. When the inter-class distance was 10, raw slices and the four processed products were classified into three categories: raw materials (S1–S6) as one category; black-bean-juice-processed slices (H1–H6) as one category; and wine-steamed slices (J1–J6) together with water-steamed slices (Q1–Q6) and stir-processed-with-black-beans slices (C1–C6) as one category. When the inter-class distance was between 15 and 25, black-bean-juice-processed slices formed a separate cluster from the other samples.

3.3.8 Análisis de componentes principales

Después de la estandarización de las áreas de los picos, la PCA se realizó utilizando SPSS 27.0. El valor de KMO fue 0,679 y la significancia de la prueba de Bartlett fue<0.001, indicating suitability for PCA. With eigenvalues >1, se extrajeron tres componentes principales con valores propios 6,815, 1,987 y 1,105. Las tasas de contribución de la varianza fueron 61,954%, 18,063% y 10,047%, respectivamente, con una tasa de contribución de la varianza acumulada del 90,064% (Tabla 3). Esto indica que el primer componente principal es el indicador más importante para la puntuación integral.

La matriz de componentes mostró que en el primer componente principal, los coeficientes absolutos de las variables del área de los picos para los picos 2 a 9 y el pico 11 fueron relativamente grandes, lo que sugiere una fuerte influencia en F1. El segundo componente principal se correlacionó con la información de los Picos 1 y 10, y el tercer componente principal se correlacionó con el Pico 1. La matriz de componentes se muestra en la Tabla 4; el gráfico de pedregal y el gráfico de carga se muestran en las Figuras 5 y 6. Utilizando las puntuaciones de los tres componentes principales y sus tasas de contribución a la varianza como ponderaciones para la ponderación lineal, se calcularon puntuaciones integrales (Tabla 5), ​​lo que indica que las rebanadas procesadas con jugo de frijol negro, las rebanadas cocidas al vapor con agua y las rebanadas cocidas al vapor con vino obtuvieron calificaciones más altas.

 

3.4 Determinación por HPLC de múltiples constituyentes encistanche tubulosay sus productos procesados

3.4.1 Condiciones cromatográficas y especificidad

Las condiciones cromatográficas fueron las mismas que las utilizadas para la toma de huellas dactilares. Se inyectaron cada una de las soluciones de muestra, soluciones de referencia y soluciones en blanco negativas (vino de arroz amarillo, agua purificada, jugo de frijol negro) (10 µL). Se compararon los tiempos de retención. Las soluciones en blanco negativas no mostraron interferencia con echinacósido, cistanósido A, acteósido e isoactósido.[falta texto en la fuente]

3.4.2 Linealidad

Se pipetearon con precisión soluciones de referencia de echinacósido, acteósido, cistanósido A e isoactósido en concentraciones de 1,1301, 0,2294, 0,2255 y 0,2109 mg·mL⁻¹ a 1, 2, 4, 8, 10 y 16 µL y se inyectaron. Se realizó una regresión lineal con el área del pico XXX frente a la concentración inyectada YYY (mg·mL⁻¹). Las ecuaciones lineales y los rangos se muestran en la Tabla 6.

3.4.3 Precisión

Se inyectó la misma solución de muestra seis veces consecutivas. Los valores de RSD de los contenidos para los cuatro analitos (equinacósido, cistanósido A, acteósido, isoactósido) fueron 0,23 %, 2,71 %, 0,53 % y 2,08 %, respectivamente (Tabla 7), todos<3%, indicating good instrumental precision.

3.4.4 Repetibilidad

Se prepararon seis soluciones de muestra paralelas a partir del mismo lote (corte crudo S1). Los valores de RSD de los contenidos para los cuatro analitos fueron 0,22 %, 2,46 %, 0,50 % y 2,46 %, respectivamente (Tabla 7), todos<3%, indicating good repeatability.

3.4.5 Estabilidad (Intradiaria)

La misma solución de muestra se analizó a las 0, 3, 6, 9, 12 y 24 h. Los valores de RSD de los contenidos para los cuatro analitos fueron 0,80 %, 1,62 %, 1,72 % y 1,49 %, respectivamente (Tabla 7), todos<2.0%, indicating stability within 24 h.

3.4.6 Estabilidad (entre días)

Se analizó la misma solución de muestra durante cinco días consecutivos. Los valores de RSD de los contenidos para los cuatro analitos durante cinco días fueron 2,80 %, 2,53 %, 3,53 % y 2,88 %, respectivamente (Tabla 7), lo que indica estabilidad dentro de cinco días.

3.4.7 Recuperación

Una cantidad apropiada decistanche tubulosaSe pesó la muestra y se agregaron estándares de referencia de equinacósido, acteósido, cistanósido A e isoactósido en una proporción de 1:1. Se prepararon y analizaron seis soluciones de muestra paralelas (inyección de 10 µl). Las recuperaciones medias fueron 99,29%, 98,75%, 99,45% y 96,13% (n=6), con valores de RSD de 2,51%, 0,38%, 1,71% y 0,49%, respectivamente.

3.4.8 Resultados de la determinación

Para cada muestra, se pesaron con precisión 0,5 g de polvo; Se inyectaron 10 µL para determinar y calcular el contenido porcentual de los cuatro constituyentes. Los resultados se muestran en las Figuras 7 a 10.

 

3.5 Determinación de glucósidos feniletanoides totales, polisacáridos totales y flavonoides totales

3.5.1 Determinación de glucósidos feniletanoides totales

3.5.1.1 Preparación de la solución de referencia

Se pesó con precisión una cantidad adecuada de sustancia de referencia de echinacósido y se disolvió en metanol en un matraz volumétrico de 10 ml para obtener una solución con una concentración de 0,32 mg·ml⁻¹. Según la literatura [15], se pipetearon 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 y 1,2 ml de la solución de referencia, se diluyeron a 10 ml con metanol y se midió la absorbancia (A) a 333 nm. La ecuación de la curva estándar ajustada fue Y=24.7596X+0.0147Y=24.7596X + 0.0147Y=24.7596X+0.0147, R2=0.9995R^2=0.9995R2=0.9995, con un rango lineal de 0,0029 a 0,0359 mg·mL⁻¹.

3.5.1.2 Preparación de la solución de muestra

Se pesaron con precisión 100 mg de muestra en polvo (pasados ​​a través de un tamiz de malla 100), se extrajeron ultrasónicamente con metanol durante 30 minutos (200 W, 40 kHz), se diluyeron a 10 ml y se filtraron a través de una membrana de 0,22 µm. Luego se diluyeron adicionalmente 0,2 ml de filtrado hasta 10 ml con metanol y se mezclaron para el análisis.

3.5.1.3 Determinación

Para cada muestra, se usaron 100 mg de polvo para preparar la solución de muestra. Se midió la absorbancia a 333 nm y se calculó el contenido porcentual de glucósidos feniletanoides totales (Tabla 9).

Ecuación (1):
Contenido (%) =C×V×Dm×100%= \\dfrac{C \\times V \\times D}{m} \\times 100\\%=mC×V×D​×100%
donde CCC es la concentración del analito en la solución de muestra, VVV es el volumen de dilución, DDD es el factor de dilución y mmm es la masa de la muestra (mg).

3.5.2 Determinación de polisacáridos totales

3.5.2.1 Preparación de la solución de referencia

Se pesó con precisión una cantidad adecuada de sustancia de referencia anhidra de D-glucosa, se disolvió en agua purificada y se diluyó a 10 ml para obtener una solución de 0,190 mg·ml⁻¹. Después de mezclar y filtrar (0,22 µm), se pipetearon 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 ml. El desarrollo del color se realizó mediante el método de antrona-ácido sulfúrico [16]. La absorbancia se midió a 625 nm. La ecuación de la curva estándar ajustada fue Y=35.1316X−0,0079Y=35.1316X - 0.0079Y=35.1316X−0,0079, R2=0.9957R^2=0.9957R2=0.9957, con un rango lineal de 0,0038 a 0,0190 mg·mL⁻¹.

3.5.2.2 Preparación de la solución de muestra

Se pesaron con precisión 40 mg de muestra en polvo, se disolvieron ultrasónicamente en agua purificada durante 30 minutos (200 W, 40 kHz), se diluyeron a 10 ml y se filtraron a través de una membrana de 0,22 µm.

3.5.2.3 Determinación

Para cada muestra, se usaron 40 mg para preparar la solución de muestra. Luego se pipetearon 0,1 ml de filtrado y se suplementaron con agua purificada hasta 2,00 ml. Después del desarrollo del color mediante el método de antrona-ácido sulfúrico, se midió la absorbancia y se calculó el contenido porcentual de polisacáridos totales (Tabla 8).

3.5.3 Determinación de flavonoides totales

3.5.3.1 Preparación de la solución de referencia

Se pesó con precisión una cantidad adecuada de sustancia de referencia de rutina, se disolvió en etanol al 70% y se diluyó hasta 25 ml; Se filtró a través de una membrana de 0,22 µm. Luego se pipetearon 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 y 4,0 ml. El desarrollo del color se realizó mediante el método de nitrito de sodio, nitrato de aluminio e hidróxido de sodio [17]. La absorbancia se midió a 510 nm. La ecuación de la curva estándar ajustada fue Y=11.5699X+0.0684Y=11.5699X + 0.0684Y=11.5699X+0.0684, R2=0.9989R^2=0.9989R2=0.9989, con un rango lineal de 0,0097 a 0,07386 mg·mL⁻¹.

3.5.3.2 Preparación de la solución de muestra

Se pesaron con precisión 50 mg de polvo, se disolvieron ultrasónicamente en etanol al 70% durante 30 minutos (200 W, 40 kHz), se diluyeron a 10 ml y se filtraron a través de una membrana de 0,22 µm.

3.5.3.3 Determinación

Para cada muestra, se usaron 50 mg para preparar la solución de muestra. Luego se transfirieron 0,5 ml de filtrado a un matraz volumétrico de 10 ml y se agregaron reactivos de color en la secuencia anterior. El agua purificada sirvió como blanco. Se midió la absorbancia y se calculó el contenido porcentual de flavonoides totales (Tabla 8).

 

4 Discusión

En este estudio, las huellas digitales HPLC decistanche tubulosa and its various processed products were established. Peak matching across different batches confirmed 9 common peaks in raw slices and 11 common peaks in processed products. By comparison with reference standards, four common peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Similarity analysis showed that similarity values among four processed products were all >0,9, y los perfiles generales de huellas dactilares fueron similares, lo que indica que sus tipos constituyentes eran similares. Sin embargo, las grandes diferencias en la RSD de las áreas de pico relativas sugieren diferencias notables en los contenidos de los constituyentes.

En comparación con las rebanadas crudas, los cuatro productos procesados ​​exhibieron dos picos adicionales (picos 2 y 7), lo que indica que los componentes químicos cambiaron después del procesamiento de vino al vapor, agua al vapor o frijoles negros. Se supone que estos picos recién generados se forman durante el procesamiento; la caracterización de sus componentes se abordará en estudios posteriores.

Los resultados de CA mostraron que cuando la distancia entre clases era<5, wine-steamed and water-steamed slices clustered together, suggesting similar chemical composition and content. At an inter-class distance of 10, raw slices could be separated from black-bean-juice-processed slices, stir-processed-with-black-beans slices, and wine/water-steamed slices. At inter-class distances of 15–25, differences between black-bean-juice-processed slices and other samples became more prominent. PCA results indicated that three principal components had substantial influence on comprehensive evaluation.

Los diferentes métodos de procesamiento afectaron directamente los niveles de diversos componentes. Con base en la determinación quimiométrica, los glucósidos feniletanoides totales se clasificaron como: procesados ​​con jugo de frijol negro > rebanadas crudas > cocidos al vapor con agua > cocidos al vapor con vino > procesados ​​con frijoles negros. Los polisacáridos totales se clasificaron como: cocidos al vapor con agua > cocidos al vapor con vino > procesados ​​con frijoles negros > procesados ​​con jugo de frijoles negros > rodajas crudas. Los flavonoides totales se clasificaron como: procesados ​​con jugo de frijoles negros > cocidos al vapor con agua > procesados ​​con frijoles negros > cocidos al vapor con vino > rodajas crudas. En comparación con las rodajas crudas, el procesamiento del jugo de frijol negro aumentó los glucósidos feniletanoides totales, mientras que otros métodos de procesamiento los disminuyeron; los cuatro métodos de procesamiento aumentaron significativamente los polisacáridos totales y los flavonoides totales. Entre los dos métodos de frijol negro, el procesamiento del jugo de frijol negro produjo mayores aumentos en los glucósidos feniletanoides totales y en los flavonoides totales que el procesamiento por agitación con frijoles negros, con diferencias estadísticas.

 

Tabla 8. Resultados de la determinación de glucósidos feniletanoides totales, polisacáridos totales y flavonoides totales encistanche tubulosay sus productos procesados

Producto elaborado (trozos de decocción)	Glucósidos feniletanoides totales (%)	Polisacáridos totales (%)	Flavonoides totales (%)
Rebanadas crudas	6.81 ± 0.06	5.85 ± 0.10	14.16 ± 0.24
Rebanadas al vapor de vino	5.10 ± 0.05***	6.61 ± 0.05***	20.84 ± 0.33***
Rebanadas al vapor de agua	5.23 ± 0.05***	6.70 ± 0.15***	21.59 ± 0.37***
Salteado con rodajas de frijoles negros	3.80 ± 0.02***	6.56 ± 0.09***	21.02 ± 0.35***
Rebanadas procesadas con jugo de frijol negro	7.07 ± 0.09****	6.09 ± 0.03****	24.26 ± 0.18****

Notas: En comparación con rodajas crudas: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; en comparación con rodajas procesadas con frijoles negros: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

El echinacósido, el acteósido, el cistanósido A y el isoactósido son glucósidos feniletanoides clave que contribuyen a los efectos tonificantes de los riñones y beneficiosos para la esencia decistanche tubulosa. La comparación por HPLC de estos cuatro constituyentes mostró que las diferencias en el área de los picos entre picos comunes podrían servir como base para distinguir diferentes productos procesados. En comparación con las rodajas crudas, el echinacósido, el cistanosido A y el isoacteosido aumentaron en diversos grados en los productos procesados, con aumentos más pronunciados en los productos de jugo de frijoles negros. El actósido disminuyó en tres productos procesados, pero aumentó en productos procesados ​​por agitación con frijoles negros. Esto puede estar relacionado con la estabilidad inherente del acteosido: como diglicósido feniletanoide con un resto cafeoílo, puede sufrir una escisión del enlace éster bajo cambios en la temperatura de calentamiento, el tiempo y el pH para generar ácido cafeico e isomerizarse parcialmente en isoacteosido. La disminución observada de acteosido y el aumento de isoacteósido en los cuatro productos procesados ​​pueden estar asociados con la cocción al vapor a alta temperatura, de acuerdo con los patrones informados para el procesamiento de Rehmanniae Radix [18].

En este estudio, el echinacósido aumentó después de la cocción al vapor de vino/agua y el procesamiento de frijoles negros, lo cual es contrario a lo que afirman Zhang Chao et al. [12]. Al comparar el procesamiento por agitación con el procesamiento de frijoles negros y el procesamiento de jugo de frijoles negros, este último mostró contenidos significativamente mayores de equinacósido y cistanósido A y una tendencia de conversión más pronunciada de actósido a isoactósido. En general, este estudio revela cambios de composición y contenido después de varios métodos de procesamiento y verifica el cambio entre acteosido e isoacteosido. Las huellas dactilares de HPLC proporcionan un método científico para identificar lonchas crudas y productos procesados, y ofrecen una referencia para establecer estándares de control de calidad y análisis cualitativos y cuantitativos.

 

Incompatibilidad

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Contribuciones del autor

XU Xiaoqin: apoyo a proyectos, diseño de estudios, determinación experimental y redacción de manuscritos;
QING Degang: coordinación general y recolección de materiales medicinales;
ZHANG Juan y ZHAO Peng'an: determinación de constituyentes y análisis de datos;
WANG Guoping: autenticación de materiales medicinales.

 

Fábrica de muestras de Cistanche:

https://www.xjcistanche.com/about-us

 

 

Referencias

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