La actividad del complemento está regulada en la glomerulopatía C3 por las proteínas de fusión IgG-factor H con y sin dominios de orientación de owndina

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Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² y Matthew C. Pickering

'Centro de Enfermedades Inflamatorias, Imperial College London, Reino Unido; y²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, EE. UU.

C3 glomerulopatíaSe caracteriza por la acumulación de complemento C3 dentro de los glomérulos. Las causas incluyen, entre otras, anomalías en el factor H, el principal regulador negativo de la vía alternativa del complemento. Los ratones deficientes en factor H (Cfh-/-) desarrollan C3glomerulopatíajunto con una reducción en los niveles plasmáticos de C3. Usando este modelo, evaluamos la eficacia de dos proteínas de fusión que contienen los dominios reguladores de la vía alternativa del factor H (FH1-5)

vinculado a una inmunoglobulina de ratón no dirigida (IgG-FH1-5) o a un anticuerpo anti-properdina de ratón (Anti-P-FH1-5). Ambas proteínas aumentaron el C3 plasmático y redujeron el depósito de C3 glomerular en un grado equivalente, lo que sugiere que no se requería que FH1-5 se dirigiera a la owndina para alterar la activación de C3 en plasma o glomérulos. Después de la administración de IgG-FH1-5, los niveles plasmáticos de C3 se correlacionaron temporalmente con cambios en los niveles de factor B, mientras que los niveles plasmáticos de C5 se correlacionaron con cambios en los niveles plasmáticos de owndina. En particular, los aumentos en el plasma

Los niveles de C5 y owndina persistieron durante más tiempo que los aumentos en C3 y factor B. En ratones Cfh-/-, IgG-FH1-5 redujo la lesión renal durante la nefritis nefrotóxica sérica acelerada. Por lo tanto, nuestros datos demuestran que IgG-FH1-5 restauró la actividad de la vía alternativa circulante y redujo la deposición glomerular de C3 en ratones Cfh-/- y que los niveles plasmáticos de owndina son un marcador sensible de la actividad de la convertasa C5 en la deficiencia del factor H. La proteína FH1-5 conjugada con inmunoglobulina, a través de su vida media plasmática comparativamente larga, puede ser una terapia potencial para C3glomerulopatía.

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Declaración de traducción

C3 glomerulopatía(C3G) es una enfermedad renal caracterizada por una acumulación anormal de complemento C3 dentro de los glomérulos y daño glomerular. Se debe a la activación descontrolada de la vía alternativa del complemento. Las proteínas de fusión, compuestas por dominios funcionales del regulador de la vía alternativa, el factor H (FH), unidas a un anticuerpo, restauraron la regulación del complemento y redujeron el C3 glomerular en un modelo de ratón C3G. La conjugación de anticuerpos no dirigidos dio como resultado una semivida plasmática de la proteína de fusión comparativamente larga, y este, o métodos de conjugación similares, podrían usarse para aumentar la función FH en la terapia de C3G.

C3 glomerulopatía(C3G) es un trastorno renal mediado por complemento caracterizado por cantidades anormales de C3 dentro de los glomérulos.1 Puede progresar a insuficiencia renal y no tiene un tratamiento definitivo.2 C3G se asocia con activación anormal de la vía alternativa del complemento (PA). La activación de AP da como resultado la producción de C3bBb (C3 convertasa), una enzima que escinde C3. Después de la adición de otra molécula C3b, el complejo C3bBbC3b resultante (C5 convertasa) puede escindir el complemento C5. Sin control

La activación de AP en C3G se puede asociar con una reducción de C3, C5, factor B (FB) y owndina circulantes. Las causas de la activación descontrolada de AP incluyen la pérdida de cambios de función en los reguladores del complemento y la ganancia de cambios de función en los activadores del complemento.2 El regulador negativo clave de AP es el factor H (FH), y la deficiencia de FH en humanos, cerdos y ratones está asociada con C3G. 3 El factor nefrítico C3, un anticuerpo que estabiliza la AP C3 convertasa, es frecuente en C3G.4 El factor nefrítico C3 puede dar como resultado una reducción de C3 solo (factor nefrítico C3 independiente de din propio) o una reducción tanto de C3 como de C5 (factor nefrítico C3 propio). factor nefrítico C3 dependiente).5,6

Aunque la deficiencia de owndina no mejoró los niveles plasmáticos de C3, los niveles de C5 aumentaron, lo que sugiere que la propertyina era necesaria para la actividad de la convertasa C5 pero no de la C3.8,9

La administración de FH11,12 de ratón o humano a ratones Cfh–/– redujo la tinción de C3 glomerular y aumentó los niveles de C3 circulante. Las construcciones que contienen solo los dominios reguladores y de direccionamiento de FH (moléculas mini-FH) también son eficaces en este modelo.13 Otros enfoques incluyen proteínas que se dirigen a sitios de activación del complemento. Estos incluyen TT30,14 una proteína que contiene los dominios reguladores del complemento de FH (FH1-5) unidos a los dominios de unión al complemento del receptor 2 del complemento, y moléculas de FH homodiméricas,15 moléculas mini-FH que contienen dominios de unión al complemento de la proteína 1 relacionada con el factor H.

Debido a que se está investigando la utilidad terapéutica de inhibir la activación de C3 del complemento en C3G,2 es importante comprender la cinética del depósito de C3 glomerular y su relación con la activación de AP dentro de los glomérulos y la circulación. En modelos de glomerulonefritis mediada por inmunocomplejos, el C3c glomerular se eliminó dentro de las 24 horas posteriores a la prevención de la activación del complemento, mientras que el C3d glomerular persistió durante semanas. , mientras que el C3d glomerular permanece invariable11.

En este estudio, investigamos la eficacia de 2 nuevas proteínas de fusión con actividad reguladora del complemento en el modelo de ratón Cfh–/– de C3G. Las proteínas contenían los dominios reguladores de FH de ratón (FH1-5), que se conjugaron con Ig de ratón para prolongar la vida media biológica. Una de las proteínas de fusión, denominada IgG-FH1-5, se conjugó con un anticuerpo monoclonal de ratón no dirigido. El otro, denominado anti-P-FH1-5, se conjugó con un anticuerpo monoclonal contra la owndina de ratón. Esto se hizo para probar la hipótesis de que dirigir esta proteína de fusión a sitios de activación del complemento, al interactuar con el depósito de owndina, mejoraría la regulación del complemento tisular. Nuestros datos demuestran que tanto las proteínas no dirigidas (IgG-FH1-5) como las dirigidas a owndina (anti-P-FH1-5) restauraron la regulación plasmática y glomerular de C3 en ratones Cfh–/–. Los estudios a lo largo del tiempo mostraron que la restauración de los niveles de C3 y FB reflejaba los niveles de las proteínas de fusión en la circulación. Por el contrario, los aumentos de C5 en plasma persistieron después de que las proteínas de fusión se hubieran eliminado de la circulación. Mostramos que IgG-FH1-5 mejoró la lesión glomerular durante la nefritis nefrotóxica sérica acelerada en ratones Cfh–/–.

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RESULTADOS

Generación de proteínas de fusión y evaluación in vitro e in vivo de la actividad Las proteínas de fusión se crearon uniendo los primeros 5 dominios de repetición de consenso corto (SCR) de la FH de ratón (FH1-5) a un anticuerpo anti-properdina de ratón (anticuerpo -P-FH1-5) o un anticuerpo con un dominio Ig no dirigido (IgG-FH1- 5, figura complementaria S1). La actividad de las proteínas se evaluó utilizando un ensayo hemolítico específico de AP (Figura 1a). Anti-P-FH1-5 e IgG-FH1-5 inhibieron la hemólisis de forma dosis-dependiente con mayor potencia para anti-P-FH1-5. La anti-properdina (anti-P) también redujo la hemólisis de manera dependiente de la dosis, pero el control IgG- no tuvo ningún efecto. Después de inyecciones equimolares de las proteínas en ratones Cfh–/–, la proteína IgG-FH1-5 fue detectable hasta 11 días después de la inyección, mientras que la proteína anti-P-FH1-5 fue detectable hasta 4 días después de la inyección. inyección (Figura complementaria S2). Para determinar si IgG-FH1-5 y anti-P-FH1-5 podrían restaurar la regulación de AP en plasma en ratones Cfh–/–, primero medimos los niveles de C3 en plasma después de la inyección de las proteínas de fusión (Figura 1b) . La administración de IgG-FH1-5 o anti-P-FH1-5 aumentó significativamente el C3 plasmático a las 24 horas y, en menor medida, a las 96 horas después de la inyección (Figura 1b). Estos datos demostraron que tanto IgG-FH1-5 como anti-P-FH1-5 podrían restaurar temporalmente la regulación de AP en plasma en ratones Cfh–/–. A continuación, realizamos un análisis detallado de estos cambios al caracterizar el curso temporal de los cambios no solo en el C3 plasmático sino también en el C5 plasmático y las proteínas de la vía alternativa FB y owndina. Los aumentos en los niveles circulantes de C5 y owndina persisten más que los aumentos en C3 y FB después de la administración de IgG-FH1-5 y anti-P-FH1-5 en ratones Cfh–/–

Comparamos la cinética de los cambios en C3, C5, FB y owndina midiendo las proteínas a intervalos de hasta 27 días después de una sola inyección de IgG-FH1-5 o anti-P-FH1-5 ( Figura 2). Después de la administración de IgG-FH1-5, el aumento máximo de C3, C5, FB y owndina se produjo el día 1 después de la inyección. El tiempo para que estos cambios caigan a los niveles previos al tratamiento fue diferente. El retorno a los niveles de pretratamiento ocurrió entre los días 1 y 4 para FB, entre los días 7 y 11 para C3, y entre los días 14 y 21 tanto para owndina como para C5 (Figura 2a, c, e y g). Después de la administración de anti-P-FH1-5, los niveles máximos de C3 se produjeron el día 1, pero cayeron a los niveles previos al tratamiento entre los días 4 y 7 (Figura 2b). Los niveles máximos de C5 se produjeron el día 4 y volvieron a los niveles previos al tratamiento entre los días 7 y 11 (Figura 2d). El aumento máximo de FB se produjo el día 1 y cayó a los niveles previos al tratamiento entre los días 1 y 4 (Figura 2f). Como era de esperar, la owndina plasmática libre se agotó después de la inyección de anti-P-FH1-5 o anti-P (Figura 2h). Los niveles de owndina en plasma libre se mantuvieron bajos hasta 7 días después de la anti-P-FH1-5 y hasta 14 días después de la anti-P (Figura 2h). Aunque ambas proteínas de fusión restauraron temporalmente la regulación de AP en plasma, la duración de la mejora en los niveles de C3, FB y C5 reflejó la duración de su detección en plasma, que fue más corta para anti-P-FH1-5 (Figura complementaria S2) . En resumen, los cambios en los niveles de C3 y FB después de la inyección de cualquiera de las proteínas fueron más breves que los de C5 y owndina. Estos datos sugieren que el FB plasmático es un marcador sensible de la actividad de la convertasa C3 en este contexto, mientras que la owndina es un marcador de la actividad de la convertasa C5. En particular, después de la inyección de anti-P, hubo un aumento en C5 a las 24 y 96 horas y el día 7

Figura 1| (a) Complementar el ensayo de hemólisis dependiente de la vía alternativa. Los anticuerpos se valoraron en diluciones de 2-veces desde 60 nM hasta 0,5 nM. Los reactivos IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 y anti-P redujeron la hemólisis de eritrocitos de conejo de forma dependiente de la dosis. No se utilizó inhibición de la proteína de control IgG. Las barras horizontales indican valores medios y las barras de error representan SD. ( b ) C3 del complemento plasmático en ratones Cfh–/– después de la inyección de proteínas de fusión. El C3 plasmático se midió antes y 24 horas y 96 horas después de la administración de IgG-FH1-5 (triángulos rojos, n ¼ 5) Anti–P–FH1-5 (triángulos morados, n ¼ 6), Anti -P (puntos verdes, n=5) y control IgG (puntos azules, n=5). Las barras horizontales denotan valores medios y los bigotes denotan SD. ***P # 0,001 frente al valor de pretratamiento y derivado de 2-vía ANOVA con prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. FH, factor H; P, propertyin.

(Figura 2d). Como se informó,8,9 indica que la convertasa C5 depende de la owndina en ratones Cfh–/–.

IgG-FH1-5 y anti-P-FH1-5 redujeron el C3c glomerular pero no alteraron la tinción de C3d en ratones Cfh–/–

A continuación, evaluamos la influencia de IgG-FH1-5 y anti-P-FH1-5 en las proteínas glomerulares C3b/iC3b/C3c, C3d, owndina y FH-relacionadas (FHR). A las 96 horas después de la inyección de IgG-FH1-5, la tinción glomerular C3b/iC3b/C3c se redujo, pero no la tinción glomerular C3d (Figura 3a) y FHR (Figura 3b). C3b/iC3b/C3c glomerular permaneció sin cambios con control IgG o anti-P. El patrón lineal anormal de la tinción glomerular de owndina en ratones Cfh–/–9 no tratados permaneció 96 horas después del control con IgG. En ratones Cfh–/– a los que se les inyectó anti-P o IgG-FH1-5, el nivel de owndina glomerular fue casi indetectable a las 96 horas (Figura 3b). Inesperadamente, la inyección de anti-P-FH1-5 resultó en un patrón de tinción glomerular granular usando anticuerpos anti-properdina, anti-FH/FHR y anti-IgG (Figura 3b). Este hallazgo sugirió que la proteína anti-P-FH1-5 se estaba depositando en los glomérulos. La inyección de proteína anti-P-FH1-5 en ratones de tipo salvaje dio como resultado una tinción glomerular con anticuerpos anti-properdina, anti-FH/FHR y anti-IgG a las 96 horas (Figura complementaria S3), lo que indica que esto El reactivo interactúa con los glomérulos normales. Sin embargo, especulamos que la proteína anti-P-FH1-5 también podría interactuar con la owndina glomerular preexistente en ratones Cfh–/–. Cuando inyectamos el reactivo en ratones Cfh–/– que habían sido tratados previamente con anti-P para eliminar la owndina glomerular, hubo una reducción en los patrones de tinción granular usando anticuerpos anti-properdina, anti-FH/FHR y anti-IgG ( Figura complementaria S4). Estas observaciones indican que la interacción glomerular de la proteína anti-P-FH1-5 en ratones Cfh–/– depende en parte de la owndina glomerular.

IgG-FH1-5 mejoró la lesión renal durante la nefritis nefrotóxica sérica acelerada en ratones Cfh–/–

En pacientes con C3G, la lesión renal aguda puede desarrollarse en el contexto de infecciones intercurrentes. Por ejemplo, la pérdida de la función renal en la nefropatía FHR5 se asocia con episodios de hematuria macroscópica sinfaringítica.17 La desregulación subyacente de C3 en pacientes con C3G probablemente da como resultado una lesión renal mediada por el complemento intensificada después de un factor desencadenante que resulta en inflamación renal. Para modelar esto, indujimos nefritis nefrotóxica sérica acelerada, un inmunocomplejo

Figura 2| Evolución temporal del perfil del complemento plasmático en ratones Cfh–/– inyectados con IgG-FH1-5 y anti-P-FH1-5. Plasma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) y owndina (P; g,h) desde el inicio experimental hasta 27 días después de la inyección única de IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; triángulos rojos, n ¼ 5) o anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; triángulos morados, n ¼ 6). Los controles incluían anti-P (puntos verdes, n=5) y un anticuerpo monoclonal de isotipo coincidente (control IgG; puntos azules, n=5). Las barras horizontales denotan valores medios y los bigotes denotan SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 frente al valor de pretratamiento y derivado del análisis de varianza 2-way con la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. FB, factor B; FH, factor H.

modelo de glomerulonefritis que involucra las vías mediadas por el receptor Fc y el complemento18,19 en los ratones Cfh–/–. Previamente demostramos que los ratones Cfh–/– son hipersensibles a la lesión renal en este entorno7 y planteamos la hipótesis de que la proteína FH1-5, al mejorar la regulación de AP, podría mejorar la lesión renal mediada por el complemento en este modelo. Debido a que nuestros datos indicaron que la proteína anti-P-FH1-5 se depositó en los glomérulos normales, utilizamos IgG-FH1-5 durante la nefritis nefrotóxica sérica acelerada. Veinticuatro horas antes de la inyección de suero nefrotóxico de oveja, los ratones recibieron una inyección ip de IgG-control (n=7) o IgG-FH1-5 (n=8). El protocolo experimental se representa en la Figura 4a. Los ratones se sacrificaron 6 días después de la administración de suero nefrotóxico de oveja. Las 3 medidas histológicas de patología glomerular (puntuación de gravedad, número total de células y número de macrófagos) fueron significativamente más bajas en el grupo IgG-FH1-5 (Figura 4b). La lesión tubulointersticial también fue menor en el grupo IgG-FH1-5 (Figura 4b). La urea sérica se elevó significativamente en

Figura 3| Inmunotinción del complemento glomerular en ratones Cfh–/– 96 horas después de la inyección de IgG-FH1-5 o anti-P-FH1-5. (a) Imágenes representativas junto con cuantificación de C3b/iC3b/C3c y C3d glomerular en los 4 grupos experimentales: IgG-FH1-5 (triángulos rojos, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (triángulos morados, n=6), anti-P (puntos verdes, n=5) y control de IgG (puntos azules, n=5). Los niveles de C3 en plasma en el momento de los cultivos que se muestran en la Figura 1. (b) Los puntos de datos representan valores medianos y los bigotes indican un rango intercuartílico. Valores de P derivados de la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. (b) Imágenes representativas de IgG glomerular, FCF y tinción en los 4 grupos experimentales. Barra ¼ 100 mm. AFU, unidades fluorescentes arbitrarias; FH, factor H; P, propertyin. Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo enwww.riñón-internacional.org.

el grupo de control de IgG, pero los cambios en la albúmina sérica y la proporción de albúmina a creatinina en orina no difirieron (Figura 4b). Como se esperaba, el C3b/iC3b/C3c glomerular se redujo significativamente en el grupo IgG-FH1-5 (Figura 4b), pero la IgG glomerular de ratón (Figura 4b) y la IgG de oveja (datos no mostrados) no difirieron entre los grupos. .

Figura 4| El pretratamiento con IgG-FH1-5 mejoró la lesión renal durante la nefritis nefrotóxica sérica acelerada en ratones Cfh–/–. ( a ) Esquema del protocolo de nefritis nefrotóxica sérica acelerada. Los ratones preinmunizados con IgG de oveja recibieron IgG-FH1-5 (grupo de tratamiento, n=8) o control de IgG (grupo de control, n=7) 24 horas antes de la administración del suero nefrotóxico de oveja. (b) Función renal e histología 6 días después de la inducción de nefritis nefrotóxica sérica acelerada en ratones tratados con IgG-FH1-5 (tratamiento; triángulos rojos, n=8) o control con IgG (control; círculos azules, n ¼ 7). Las barras horizontales denotan valores medianos y los bigotes denotan un rango intercuartílico. *P # 0.05, **P # 0.01, ***P # 0.001 versus control y derivado de la prueba de Mann-Whitney. FH, factor H; P, propertyin.

DISCUSIÓN

Tanto IgG-FH1-5 como anti-P-FH1-5 normalizaron los niveles de C3, FB y C5 en ratones Cfh–/–. Este hallazgo es consistente con el hecho de que los dominios reguladores del complemento de FH de ratón están ubicados dentro de los dominios SCR 1 a 5 (un sitio de unión a C3b y la actividad del cofactor para la escisión de C3b mediada por el factor I).20 Dominios de reconocimiento de superficie, que influyen en la unión a la heparina y las células endoteliales e incluyen un segundo sitio de unión a C3b, están presentes dentro de los dominios SCR 18 a

20 (FH18-20) y, por lo tanto, no están presentes en las proteínas de fusión.20 Sin embargo, ambas proteínas redujeron el iC3b/C3b/C3c glomerular, lo que indica que FH18-20 no era necesario en este contexto. Este hallazgo es consistente con datos previos que muestran que los ratones Cfh–/– que expresan una proteína FH mutante que consta de los dominios SCR 1 a 15 (Cfh–/– .FHD16-20) no desarrollaron una deposición glomerular anormal de C3.21,22 Sin embargo, los animales Cfh–/–.FH D16-20 no pudieron regular la activación de C3 a lo largo del endotelio renal y desarrollaron microangiopatía trombótica. Es posible que, debido a la falta de dominios de FH18-20 dirigidos a la superficie, la administración de proteínas de fusión que contienen FH1-5 en la deficiencia de FH podría dar lugar a una susceptibilidad a la microangiopatía trombótica. También es posible que el aumento de la avidez por la unión de C3b, bajo la estructura dimérica de las proteínas de fusión, sea suficiente para compensar la ausencia de los dominios FH18-20 dirigidos a la superficie. Sin embargo, el reconocimiento de superficie de C3b también se ve influido por cambios conformacionales en FH.23 Una proteína de unión a FH de Streptococcus pneumoniae (PspCN, que se une al dominio 9 de SCR), desencadena un cambio conformacional de FH, y el complejo FH-PspCN había aumentado la unión a C3b y mayor actividad aceleradora de la descomposición. El sitio de unión de FH20 C3d no está expuesto en FH, pero queda expuesto en el complejo FH-PspCN. Esto podría explicar por qué FH19-20 interactúa con la superficie C3d pero FH no.24,25 Especulamos que nuestros agentes, a través de cambios conformacionales, pueden interactuar de manera eficiente tanto con la fase fluida como con la superficie C3b. En particular, tanto IgG-FH1-5 como anti-P-FH1-5 protegieron a los eritrocitos de la lisis en un ensayo de hemólisis dependiente de AP.

Ninguna proteína de fusión redujo la tinción de C3d glomerular, quizás debido a la naturaleza persistente de C3d glomerular. En la nefritis experimental por inmunocomplejos, el C3c glomerular se resolvió dentro de las 24 horas posteriores al cese de la activación del complemento, pero el C3d persistió durante semanas.16 Además, el C3d glomerular es persistente en la nefritis lúpica.26 Esto probablemente refleja su interacción covalente con las superficies glomerulares. Las inyecciones repetidas de FH humana en ratones Cfh–/– mostraron una reducción en el C3d glomerular durante 10 días.11 Es probable que la administración repetida de IgG-FH1-5 pueda reducir el C3d glomerular en este modelo. Tampoco hubo cambios en la tinción de FHR glomerular. Se sabe poco sobre las funciones de las proteínas FHR de ratón, pero pueden interactuar tanto con C3b27,28 como con C3d.27 De hecho, la afinidad aparente de FHR-A y FHR-B por C3d es más fuerte que la de FH.27 Especulamos que es probable que las proteínas FHR glomerulares se eliminen de los glomérulos solo cuando se haya eliminado C3d. En este contexto, llama la atención que en el C3G humano, la proteína 5 relacionada con el factor H se asocie con el C3d glomerular29.

La proteína anti-P-FH1-5 redujo los niveles plasmáticos de owndina libre como se esperaba porque la parte anti-properdina de esta proteína de fusión puede bloquear la actividad de AP (debido al agotamiento de la owndina) durante 8 días después de una sola inyección.30 Sin embargo, nuestros datos mostraron que la eficacia de FH1-5 en el aumento de los niveles plasmáticos de C3 y la reducción de la tinción glomerular de C3b/iC3b/C3c fue comparable entre las 2 proteínas de fusión (es decir, fue independiente del direccionamiento de la propertyina). Además, la tinción anormal de la owndina glomerular se redujo significativamente después de la administración de anti-P o IgG-FH1-5. Evidentemente, en contraste con las proteínas C3d y FHR, la owndina glomerular se elimina fácilmente después de la restauración de la regulación de C3. La owndina glomerular cambió de patrón después de la administración de la proteína anti-P-FH1-5, pero esto se complicó por la observación de que detectamos el depósito de esta proteína de fusión tanto en Cfh–/– como en los glomérulos de tipo salvaje. Esto se debió en parte a una interacción con la owndina glomerular, pero el depósito en los glomérulos de tipo salvaje indicó que también dependía en parte por completo del complemento glomerular y probablemente estaba relacionado con las propiedades fisicoquímicas de la proteína de fusión.

Nuestros datos cinéticos demostraron hallazgos novedosos sobre los cambios temporales en FB, C5 y owndina que acompañan a los aumentos en C3 en ratones Cfh-/- después de la inyección de las proteínas de fusión. Los niveles de FB aumentaron rápidamente después de la inyección

y volvió a los niveles de referencia en un momento en que tanto los niveles de C5 como de owndina permanecieron elevados. Los niveles de properdina en ratones Cfh–/– se redujeron al inicio y aumentaron a niveles normales (20 mg/ml30) después de la inyección de IgG-FH1-5 y permanecieron en estos niveles durante al menos 14 días. Se observó un curso de tiempo similar para el aumento de los niveles de C5 en plasma. Sorprendentemente, IgG-FH1-5 estuvo mayormente ausente de la circulación a los 11 días, lo que indica que la formación de la convertasa C5 en ratones Cfh–/– es más lenta que la de la convertasa C3 (porque los niveles de C3 regresaron a la línea base entre 7 y 11 días). El C5 plasmático aumentó después del tratamiento anti-P y aumentó aún más con la proteína anti-P-FH1-5. Por lo tanto, tanto el direccionamiento de la propertyina como los efectos de FH1-5 contribuyeron al aumento de los niveles de C5 e indican que la convertasa de C5 depende parcialmente de la propertyina en ratones Cfh–/–. Este hallazgo es consistente con la mejora de la desregulación de C5 en ratones con deficiencia combinada de FH y owndina. {30}}.31,32 Nuestros datos respaldan un vínculo íntimo entre los niveles de owndina y la actividad de la convertasa C5 y respaldan el uso de los niveles de owndina como biomarcador de la activación continua de C5 glomerular.

En particular, la proteína IgG-FH1-5 todavía era detectable en la circulación hasta 11 días después de una sola inyección. Esto es mucho más largo que lo que informamos anteriormente para la proteína FH1-5 de ratón no conjugada, que se eliminó de la circulación dentro de las 24 horas.14 Este hallazgo indica que la vida media plasmática más prolongada de la IgG-FH{ La proteína {9}} se deriva de la conjugación de anticuerpos. La vida media plasmática de la proteína IgG-FH1-5 también fue más larga que lo que observamos previamente para la FH completa.10,11 Por ejemplo, la FH humana se eliminó de la circulación 96 horas después de una sola inyección. en ratones Cfh–/–.11 En combinación con nuestros datos que demuestran la eficacia de la proteína IgG-FH1-5 en la regulación del complemento, consideramos que la conjugación de la proteína FH1-5 para prolongar su perfil farmacocinético tiene potencial terapéutico. utilidad en C3G.

En resumen, mostramos que, a pesar de carecer de dominios de reconocimiento de superficie, las proteínas de fusión FH1-5 fueron efectivas para reducir la activación glomerular de C3 y restaurar la regulación del complemento plasmático en la deficiencia de FH. No hubo una ventaja obvia en la conjugación de los dominios FH1-5 con antiproperdina, y la proteína IgG-FH1-5 redujo la lesión renal en la nefritis experimental. En contraste con los desafíos en la producción de preparaciones a gran escala de FH para uso terapéutico, la producción a gran escala de terapias basadas en anticuerpos está bien establecida, lo que hace que IgG-FH1-5 sea un potencial terapéutico atractivo para C3G.

MÉTODOS

Proteínas de fusión

IgG-FH1-5. Los primeros 5 dominios FH SCR de ratón (mFH1-5) vinculados

a una Ig de ratón IgG1 no dirigida (un anticuerpo antiidiotípico producido contra un anticuerpo monoclonal de ratón).

Anti-P-FH1-5. FH murino1-5 vinculado a anticuerpo anti-properdina de ratón (anti-P),30 proporcionado a Alexion por W. Song, Universidad de Pensilvania).

Control S. Los controles eran Ig de ratón no objetivo coincidentes con isotipo (control de IgG) y anti-properdina de ratón (anti-P) (Figura complementaria S1). Las proteínas se generaron usando vectores pVEK y células Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), purificadas usando proteína A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

Ensayo hemolítico específico de AP

Veinte por ciento de suero de ratón normal valorado de 60 nM a 0,5 nM se incubó con eritrocitos de conejo (1,5 106 células/ml) a 37ºC durante 30 minutos. La liberación de hemo se cuantificó espectrofotométricamente (densidad óptica 415 nm); El 100 por ciento de lisis fue suero sin inhibidor.

Plasma FB y FH

El plasma se obtuvo después de la centrifugación de la sangre recogida en tubos que contenían ácido etilendiaminotetraacético (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Alemania). Las proteínas se midieron mediante inmunoensayo de electroforesis capilar (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Los anticuerpos utilizados fueron anticuerpos policlonales anti-FH de ratón (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) y anticuerpos anti-FB de ratón (Abcam, Cambridge, Reino Unido); Se utilizó el módulo de detección anti-conejo WES (ProteinSimple, San Jose, CA). Las señales quimioluminiscentes se analizaron con el software Compass for SW (ProteinSimple, versión 5.0.1), se cuantificaron como áreas de pico y se normalizaron con el control del ensayo.

Ratones

Todos los ratones se alojaron en condiciones específicas libres de patógenos; los procedimientos se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Ministerio del Interior del Reino Unido. Se compraron ratones C57BL/6 de tipo salvaje en Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se generaron ratones Cfh–/– como se describió anteriormente.7 Los ratones se emparejaron por edad y sexo; Se administraron dosis equimolares de proteínas mediante inyección ip (1 mg para anti-properdina e IgG-control; 1,4 mg para IgG-FH1-5 y anti-P-FH1-5). Se indujo nefritis nefrotóxica en suero acelerada mediante inyección iv de suero nefrotóxico de oveja en ratones preinmunizados con IgG de oveja.7 La administración de las proteínas de fusión se realizó 24 horas antes de la inducción con suero nefrotóxico de oveja (Figura 4a).

C3, C5 y owndina libre Se midieron C3 en plasma mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. - owndina o un anti-C5 murino personalizado recubierto en placas de MSD de alta unión. La owndina "libre" unida y el C5 se detectaron con anti-properdina (de W. Song) o anti-C5 monoclonal biotinilado (Alexion) combinado con estreptavidina-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). La señal quimioluminiscente se adquirió utilizando un generador de imágenes SECTOR S 6000 (MSD, Meso Scale Diagnostics) y se analizó con el software MSD Discovery Workbench (Meso Scale

Diagnósticos, versión 4.0.12.1). Se utilizaron como patrones la owndina murina recombinante y C5.

Función renal e histología

La hematuria y la proteinuria se evaluaron con Hema-Combistix (Bayer, Reading, Reino Unido); se midió la urea plasmática y se procesó el tejido renal como se describió previamente.9 la albúmina plasmática se midió mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Las secciones renales teñidas con ácido peryódico de Schiff se evaluaron de forma ciega y se clasificaron según la gravedad de la lesión glomerular y tubulointersticial (0 [ninguna], 1 [leve], 2 [moderada]). Se evaluaron diez glomérulos por sección para determinar el número medio de células glomerulares. La tinción de inmunofluorescencia se realizó en criosecciones de 5- mm montadas usando medio Vectashield con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Los anticuerpos usados ​​fueron anti-ratón de cabra policlonal conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) C3b/C3c/iC3b (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; IgG anti-ratón de cabra policlonal conjugada con FITC específica de cadena de higo (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); IgG monoclonal de ratón conjugado con FITC anti-cabra/oveja (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); o owndina antihumana de cabra conjugada con FITC (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immu- nologic Laboratories, Copenhague, Dinamarca).9 Anti-ratón C3d de cabra biotinilado (1:10; #BAF2655; R&D Systems , Minneapolis, MN) en secciones bloqueadas con biotina (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA), con anticuerpo secundario de estreptavidina AF488 (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). La FH se visualizó en secciones bloqueadas de CD16/CD32-anti-ratón de rata purificada (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) usando FH antihumana de cabra (1:1000; #A312; Quidel, San Diego , CA) y anticuerpo secundario monoclonal anti-cabra IgG-FITC (1:100; clon GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Los macrófagos glomerulares se identificaron usando CD68 anti-ratón de rata conjugado con FITC (FA-11 clon GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). El análisis de inmunofluorescencia cuantitativo se realizó utilizando un microscopio óptico Leica DM4B acoplado con una cámara digital Leica DFC700T (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y el software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, versión 7). Se examinaron diez glomérulos por sección y la intensidad media se expresó en unidades arbitrarias de fluorescencia.

análisis estadístico

GraphPad Prism, versión 8.0 (GraphPad, San Diego, CA) se utilizó para el análisis estadístico. Se utilizó el análisis de varianza de medidas repetidas 2-vía con la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (los factores fueron el tiempo y el tratamiento) para el análisis del curso del tiempo. Se usó la prueba de comparaciones múltiples de Kruskal-Wallis con Dunn cuando se compararon múltiples grupos, y la prueba de Mann-Whitney se usó para 2 grupos.

DIVULGACIÓN

MCP ha recibido honorarios por consultoría de Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope y Achillion Pharmaceuticals. HTC ha recibido honorarios por consultoría de Alexion, Novartis, Aurinia y Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ y SK-K son empleados de Alexion Pharmaceuticals. SK es un ex empleado de Alexion Pharmaceuticals y actualmente es empleado de Gemini Pharmaceuticals. Todos los demás autores no declararon intereses en competencia.

EXPRESIONES DE GRATITUD

MCP es miembro sénior de Wellcome Trust en Ciencias Clínicas (referencia de subvención 212252/Z/18/Z), y ACG y DPL cuentan con el apoyo de esta beca. YZ, SK, YW, KKJ y SK-K fueron financiados por Alexion Pharmaceuticals.

MATERIAL SUPLEMENTARIO

Archivo complementario (PDF)

Figura S1. Proteínas de fusión utilizadas en este estudio. IgG-FH1-5 contiene los primeros 5 dominios del factor H de ratón (FH1-5) vinculados a una Ig de ratón no objetivo. El anti-P-FH1-5 consta de mFH1-5 unido a un anticuerpo neutralizante de la owndina anti-ratón de ratón (anti-P; véase Miwa et al.30). Las proteínas de control incluían una Ig de ratón no dirigida de isotipo coincidente (IgG-control) y el anticuerpo neutralizante de la properdina de ratón anti-ratón (Anti-P). Figura S2. Análisis de transferencia WES para detectar FH1-5 en muestras de plasma de ratones con deficiencia de FH inyectados con (A) IgG-FH1-5 o (B) Anti-P-FH1-5. La 94-cadena pesada kDaI unida a FH de ratón1-5 (HC-FH1-5) es detectable hasta 11 días después de la inyección de IgG-FH1-5 y hasta 4 días después de la inyección de proteína anti-P-FH1-5 (recuadros rojos Los controles incluyeron plasma de ratones de tipo salvaje en los que se detecta la proteína del factor H de longitud completa (FH, recuadros negros, carril C1) y ratones deficientes en FH no inyectados, en los que no hay FH evidente (recuadros negros, carril C2,). Como era de esperar, ni FHniFH1-5 es detectable en muestras de plasma de ratones inyectados con control Anti-P o IgG.

Figura S3. Inmunotinción del complemento glomerular 96 horas después de la inyección de IgG-control o anti-P-FH1-5 en ratones de tipo salvaje. Se muestran imágenes glomerulares representativas (barra ¼ 100 mm).

Figura S4. El papel de la owndina en el depósito de anti-P-FH1-5 en los glomérulos de ratones con deficiencia de FH. A los ratones Cfh–/– se les inyectó control IgG- o anti-P (tratamiento 1) seguido 24-horas más tarde por control IgG- o anti-P-FH1-5 (tratamiento 2). Los animales se sacrificaron 120 horas después del tratamiento uno y se evaluó la tinción glomerular para IgG, owndina y FH/FHR. Se muestran imágenes representativas. La inyección de anti-P redujo notablemente la tinción de owndina (fila 1, columna 2) pero no FH/FHR (permanece sin cambios) o IgG (permanece ausente). La administración de anti-P-FH1-5 24-horas después del control de IgG resultó en la aparición de una tinción granular con anticuerpos anti-IgG, anti-FH/FHR y anti-P como se observa después de la inyección de anti-P-FH 1-5 solo (ver Figura 3b). Esta tinción granular se redujo cuando la inyección de anti-P-FH1-5 fue precedida por una inyección de anti-P, que agota tanto la circulación (ver Figura 1h) como la glomerular (ver Figura 3b). La tinción glomerular con anti-IgG fue evidente solo en ratones inyectados con anti-P-FH1-5 (fila 3, columnas 3 y 4) y fue significativamente menor en ratones que recibieron anti-P-FH1-5 precedida de anti-P. Llegamos a la conclusión de que el depósito de anti-P-FH1-5 en los glomérulos de ratones Cfh–/– dependía en parte de la owndina. Las barras horizontales indican valores medianos y los bigotes indican el rango intercuartílico. El valor P se derivó de la prueba de Mann-Whitney. Barra ¼ 100 mm.

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