El efecto protector del equinacósido en la nefropatía diabética

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Efectos protectores del equinacósido sobre la función renal, el tejido renal y la lesión de las células mesangiales en ratas con nefropatía diabética

HE Qin, LIU Fan, WANG Hongli, LI Jianping, DUAN Jun

Resumen:

Objetivo Explorar el efecto protector deechinacósido(ECH) sobre la disfunción renal, la histopatología y la lesión de las células mesangiales endiabéticonefropatía(DN) ratas y su mecanismo. Métodos Sesenta ratas SD se dividieron aleatoriamente en grupo de control, grupo modelo, ECH (echinacósido) grupo (dosis altas, medias y bajas ECH (echinacósido),100,50, 20 mg·kg'·d') y el grupo de losartán potásico (losartán potásico, 16 mg·kg'·d'), 10 ratas en cada grupo. El grupo modelo, ECH (echinacósido) y el grupo de losartán potásico fueron alimentados con una dieta rica en grasas y azúcar, y se les inyectó estreptozotocina por vía intraperitoneal (40 mg·kg"') para establecer modelos de ratas DN. Después de 2 semanas de tratamiento, el peso corporal, la ingesta de agua las 24 horas y el volumen de orina de las ratas se registraron los contenidos de glucosa en sangre en ayunas, creatinina sérica, nitrógeno ureico, microproteína en orina, ácido hialurónico (HA), inhibidor de la metaloproteinasa tisular-1(TIMP-1) y laminina (LN). Se realizaron tinciones HE y TUNEL para observar cambios patológicos en el tejido renal. Se realizó RT-PCR para detectar la expresión de linfoma de células B (Bcl-2), Bcl2-asociado Proteína X (Bax), ARNm de caspasa-3. Wester Blot se realizó para determinar los niveles de expresión de la molécula de adhesión de células vasculares-1(VCAM-1), factor de crecimiento transformante (TGF-), - Actina del músculo liso (-SMA) Resultados En comparación con el grupo de control, el peso corporal del grupo modelo disminuyó significativamente (P< 0.05),="" water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly="" increased=""><0.05). bax,="" caspase-3="" mrna,="" and="" expression="" of="" vcam-1,="" tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05),="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="">< 0.05).="" compared="" with="" the="" model="" group,="" bodyweight="" of="" rats="" was="" significantly="" increased="" in="" the="" medium-dose="" ech="">echinacósido) grupo, dosis altas de ECH (echinacósido) y el grupo de losartán potásico (P<0.05), water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly=""><0.05).bax,caspase-3 mrna,="" expression="" of="" vcam-1,tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05);="" and="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly=""><0.05).he and="" tunel="" staining="" showed="" that="" pathological="" changes="" in="" renal="" tissue="" were="" significantly="" decreased.="" conclusion="" medium="" and="" high="" doses="" of="" ech="">echinacósido) puede proteger el daño del tejido renal y mejorar la función renal en ratas DN al inhibir la expresión de proteínas de TGF- y VCAM-1 e inhibir la fibrosis intersticial renal y la apoptosis de las células renales.

Palabras clave:Cistanches herba;equinacósido; diabéticonefropatía; fibrosis intersticial renal; apoptosis; ratas

cistanche echinacoside tratar la nefropatía diabética

Introducción

Diabético nefropatía(nefropatía diabética, ND) es una enfermedad comúndiabéticocomplicación microvascular, que no solo puede causar daño renal sino también afectar a otros órganos. La característica clínica patológica de la fibrosis tubulointersticial renal es la complicada patogenia dediabéticonefropatía. Estudios previos [P2-5 creen que la enfermedad se debe principalmente a la hiperglucemia endiabéticopacientes, lo que provoca cambios hemodinámicos renales y metabolismo anormal. Las manifestaciones clínicas son principalmente proteinuria y disminución de la tasa de filtración glomerular. Actualmente,diabéticonefropatíaLos pacientes todavía carecen de métodos de tratamiento clínico efectivos, y encontrar nuevos medicamentos efectivos es la clave para el tratamiento dediabéticonefropatía.

echinacósido(ECH) es uno de los extractos de Cistanche Tubulosa. Tiene el efecto de vigorizar el riñón y fortalecer el yang". Los estudios farmacológicos modernos han demostrado que el equinacósido tiene propiedades antioxidantes, antiapoptóticas, antiinflamatorias y mejora el flujo sanguíneo. La microcirculación y otros efectos farmacológicos también pueden regular el metabolismo de la glucosa del cuerpo y mejorar la glucosa. tolerancia En los últimos años, los estudios han demostrado que el echinacósido puede inhibir la vía de señalización del factor de crecimiento de transformación (factor de crecimiento transformante, TGF-) e inhibirdiabéticonefropatía. La fibrosis intersticial de los riñones de rata protege el tejido renal de rata. Sin embargo, existen pocos reportes en la literatura sobre el tratamiento dediabéticonefropatíaconechinacósido, y su mecanismo específico para protegerdiabéticonefropatíaen ratas no está claro. Por lo tanto, este estudio exploró más a fondo El efecto deechinacósidosobre la fibrosis renal y la apoptosis de las células renales endiabéticonefropatíaratas y su posible mecanismo pretende proporcionar una base teórica para la aplicación clínica deechinacósido.

Beneficio de la cistanche: tratar la enfermedad renal y mejorar la función renal

1 Material y métodos

1.1 Animales:

60 ratas SD, macho, grado SPF, 8 semanas de edad, peso corporal 240~280 g, proporcionadas por Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd., número de licencia de animales: SCXK (Beijing) 2015-0001, calidad animal está calificado Número de certificado: 11400700106210, criado en el laboratorio del centro de animales del hospital, manteniendo la temperatura ambiente constante a 25 grados, simulando el día y la noche, cambiando las condiciones de iluminación una vez cada 12 horas, y los animales pueden comer y beber libremente .

1.2 Medicamentos y reactivos:

equinacósido, Instituto de China para el Control de Alimentos y Medicamentos, número de lote: 111670-201706; Losartán potásico, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., Norma Nacional de Medicina: H20030654; estreptozotocina, American Sigma Company, número de lote: 040103; Kit de detección del contenido de proteína en orina, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd., número de lote: 20170612; kit de detección TUNEL, Amicage Technology Co., Ltd., número de lote: 20180406; kit de extracción de ARN, kit de transcripción inversa, Shanghai Hengfei Bio-Technology Co., Ltd., número de lote: 20180705, 20180904; Kits de detección de ácido hialurónico (HA) sérico, inhibidor de la metaloproteinasa tisular-1 (TIMP-1) y laminina (laminina, LN), Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., los números de lote son 20180612, 20180624, 20180706.

1.3 Aparato

Analizador bioquímico automático de tipo 7600, empresa japonesa HITACHI; medidor de glucosa en sangre portátil, Beijing Yicheng Bioelectronics Technology Co., Ltd.; Microscopio óptico B X60, empresa japonesa OLYMPUS; Analizador de radioinmunoensayo SN-695B, empresa Shanghai Rihuan Instrument Shenbei Co., Ltd.

1.4 Método de agrupación, replicación de modelos y administración

Después de una semana de alimentación previa, 60 ratas se dividieron aleatoriamente en el grupo de control, el grupo modelo, elechinacósidogrupos de dosis alta, media y baja y el grupo de Losartán potásico, con 10 ratas en cada grupo. El grupo modelo,echinacósidoy el grupo de losartán potásico fueron tratados con una dieta alta en grasas y azúcar combinada con dosis bajas de estreptozotocina para inducirdiabéticonefropatíaen ratas Antes de replicar el modelo, las ratas ayunaron con agua durante 12 h. Las ratas en el grupo de control fueron alimentadas con alimento ordinario y los otros grupos fueron alimentados con alimento alto en grasa y azúcar. Después de 4 semanas de alimentación continua, a las ratas del grupo de control se les administró una inyección intraperitoneal única de un volumen igual de tampón de citrato, y a los grupos restantes se les administró una inyección intraperitoneal única de estreptozotocina bacteriocina (40 mg·kg') para replicar el modelo de rata dediabéticonefropatía. 72 horas después de que las ratas recibieron la inyección de estreptozotocina, la glucosa en sangre era mayor o igual a 16,7 mmol·L, y la tasa de excreción de proteínas en la orina de 24 horas después de 3 semanas fue mayor que la del grupo de control. La proteína cuantitativa en la orina de 24 horas fue superior al 50 por ciento antes de la replicación del modelo, lo que indica que el modelo se replicó con éxito. Cuatro semanas después de la inyección de estreptozotocina, los grupos de dosis baja, media y alta deechinacósidorecibieron 20 mg·kg', 50 mg·kg y 100 mg·kg'echinacósido(según 5mL·kg en ratas). kg"' de peso corporal se disuelve en solución salina normal de 37 grados), a las ratas del grupo de Losartán potásico se les administra por vía intragástrica 16 mg·kg' de Losartán potásico, y al grupo modelo y al grupo de control se les administra por vía intragástrica volúmenes iguales de solución salina normal, una vez al día. Se continuó con la sonda durante 2 semanas.

1.5 Recogida de muestras

Después de la última administración, las ratas ayunaron sin comida ni agua. Se registraron las 24 horas de agua de bebida de las ratas, y se recogieron las 24 horas de orina. A primera hora de la mañana del segundo día, se pesaron las ratas. Después de recolectar la orina, inyección intraperitoneal de solución de pentobarbital sódico al 2 por ciento, 2 mL·kg~ para anestesia, separación de sangre aórtica abdominal de rata, centrifugación (3 500 r·min²', 15 min), tomar el suero y colocarlo en el refrigerador- Almacenar temporalmente a 20 grados; separe el tejido de riñón de rata y divídalo en dos partes, una parte se fija en paraformaldehído al 4 por ciento, la otra parte se prepara como homogeneizado al 10 por ciento y se coloca en un refrigerador de -80 grados para su uso posterior.

1.6 Determinación del metabolismo de glucosa y lípidos en ratas

Se tomó el suero de cada grupo de ratas, se midió la glucemia en ayunas con un glucómetro y se detectaron los niveles de triglicéridos, colesterol y lipoproteínas de baja densidad mediante un analizador bioquímico automático.

1.7 24 h proteína en orina, función renal e indicadores relacionados con la fibrosis renal

Se recogió la orina de 24-horas de las ratas de cada grupo y se determinó el contenido de microproteínas en la orina de 24-horas mediante radioinmunoensayo. La operación se llevó a cabo en estricta conformidad con las instrucciones. Se recolectó el suero de cada grupo de ratas, y se utilizó el analizador bioquímico automático para detectar los niveles de creatinina y nitrógeno ureico en sangre, los cuales están relacionados con la función renal, se detectó el nivel de TIMP-1 sérico por ELISA, y los niveles de HA y LN fueron detectados por radioinmunoensayo. La operación se llevó a cabo en estricta conformidad con las instrucciones.

1.8 Tinción HE para observar los cambios patológicos del tejido renal y tinción TNUEL para observar la apoptosis de las células del tejido renal

Se tomaron los tejidos renales fijados de cada grupo, se incluyeron rutinariamente en parafina y se seccionaron. Una sección se utiliza para la tinción HE para observar los cambios morfológicos de los túbulos renales, los glomérulos y el intersticio renal bajo un microscopio óptico; la otra sección se utiliza para la tinción TUNEL, operando de acuerdo con las instrucciones del kit y observando el número y la positividad de las células del tejido renal bajo el microscopio. El número de células se calcula como la relación entre el número de células positivas y el número de tejido renal. células, que es la tasa de apoptosis.

1.9 Método RT-PCR para detectar la expresión de genes relacionados con la apoptosis en tejidos renales

Tome homogeneizado de tejido de riñón de rata, extraiga el ARN total mediante el método Trizol, determine la concentración mediante espectrofotómetro ultravioleta y sintetice ADNc con el kit de transcripción inversa.

1.10 Método Western Blot para determinar la expresión de proteína VCAM-1, TGF- y -SMA en tejido renal.

Tome aproximadamente 50 mg de homogeneizado de tejido de riñón de rata, disuélvalo con lisado celular que contenga inhibidores de proteasa y extraiga la proteína total con lisado celular, utilizando el método BCA para la cuantificación de proteínas. La muestra de proteína total extraída en 50 μmol·L" se transfirió a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se selló con leche descremada al 5 por ciento, y se agregaron el anticuerpo primario (1∶1000) y la proteína -actina respectivamente. Anticuerpo (1: 300), incubar durante la noche a 4 grados. Finalmente, añadir el anticuerpo secundario e incubar durante 2 h a 37 grados, monitoreado por electroquimioluminiscencia. Utilice el software de análisis de imágenes Photoshop para analizar el valor gris de las bandas de proteínas.

1.11 Métodos de procesamiento estadístico

Se usó el software SPSS 17.0 para analizar los datos obtenidos, y los datos de medición que satisfacen la distribución normal se expresan como media ± desviación estándar ((x±s), y se usa el análisis de varianza de un solo factor para comparar las diferencias entre grupos La comparación por pares entre grupos utiliza SNK- Con la prueba q, P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

2 resultados

2.1 Los efectos del equinacósido sobre la masa corporal, el agua potable y la diuresis de ratas con nefropatía diabética se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 Efectos de la ECH sobre el peso corporal, la ingesta de agua y el volumen de orina en ratas DN（x ± s,n=10）

En comparación con el grupo de control, el peso corporal de las ratas del grupo modelo se redujo significativamente y las 24-horas de consumo de agua y orina aumentaron significativamente. La diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" doses="" of="">echinacósidoEl peso corporal de las ratas en el grupo de Losartán potásico aumentó significativamente, y las 24-horas de bebida y la producción de orina disminuyeron significativamente, y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<>

2.2 Los efectos del equinacósido sobre el metabolismo de la glucosa y los lípidos en ratas con nefropatía diabética se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Efectos de ECH sobre el metabolismo de glucosa y lípidos en ratas DN

Nota:En comparación con el grupo de control,' P<0.05; compared="" with="" the="" model="" group,=""><>

En comparación con el grupo de control, la glucosa en sangre en ayunas de las ratas del grupo modelo aumentó significativamente y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). En comparación con el grupo modelo, la glucosa en sangre en ayunas de las ratas en los grupos de dosis media y alta deechinacósidoy el grupo de losartán potásico se redujo significativamente, y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" decreased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

2.3 En la Tabla 3 se muestran los efectos del equinacósido sobre la proteína en la orina de 24- horas y la función renal de ratas con nefropatía diabética.

En comparación con el grupo de control, los niveles de microalbúmina, nitrógeno ureico y creatinina en la orina del grupo modelo aumentaron significativamente y las diferencias fueron estadísticamente significativas (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">echinacósidoLos niveles de microalbúmina urinaria, nitrógeno ureico y creatinina de las ratas en el grupo de potasio y losartán se redujeron significativamente, y las diferencias fueron estadísticamente significativas (P<>

Tabla 3 Efectos del equinacósido sobre la proteína en orina de 24 horas y la función renal de ratas con nefropatía diabética (x±s, n=10)

2.4 Los efectos del equinacósido sobre la fibrosis renal en ratas con nefropatía diabética se muestran en la Tabla 4.

En comparación con el grupo de control, los niveles séricos de HA, TIMP-1 y LN en el grupo modelo aumentaron significativamente y las diferencias fueron estadísticamente significativas (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

Tabla 4 Efectos de ECH sobre la fibrosis renal en ratas DN

2.5 Tinción HE para observar los cambios patológicos del tejido renal en ratas con nefropatía diabética (ver Figura 1).

La tinción con HE de ratas en el grupo de control mostró que la estructura de las células del tejido renal estaba intacta y no se observaron cambios patológicos obvios. La tinción HE de ratas en el grupo modelo y la dosis bajaechinacósidoEl grupo mostró: glomérulo hinchado y aumentado de tamaño, células epiteliales tubulares renales hinchadas o caídas, intersticio renal acompañado de infiltración de células inflamatorias, y también eran visibles algo de hiperplasia mesangial y proliferación intersticial. Fibrosis cualitativa.equinacósidogrupos de dosis media y alta y grupos de Losartán potásico. La tinción mostró que los cambios patológicos del tejido renal se redujeron significativamente, acompañados de una pequeña cantidad de infiltración de células inflamatorias, y el grado de hiperplasia mesangial y fibrosis intersticial también fue más leve que el del grupo modelo.

Figura 1 Cambios patológicos de los tejidos renales de ratas en cada grupo

2.6 El efecto del equinacósido sobre la apoptosis del tejido renal en ratas con nefropatía diabética se muestra en la Figura 2.

La tinción de TUNEL mostró que, en comparación con el grupo de control, la tasa de apoptosis de las ratas en el grupo modelo aumentó significativamente y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); en="" comparación="" con="" el="" grupo="" modelo,="" las="" dosis="" medias="" y="" altas="">echinacósidoy Corsa La tasa de apoptosis de las ratas en el grupo de potasio se redujo significativamente y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<>

Figura 2 Apoptosis de células de tejido renal en ratas DN

2.7 El efecto del equinacósido sobre la expresión de genes relacionados con la apoptosis en tejidos renales de ratas con nefropatía diabética se muestra en la Tabla 6.

Los resultados de la RT-PCR mostraron que, en comparación con el grupo de control, la expresión de ARNm de Bax y Caspase-3 en el grupo modelo estaba significativamente regulada al alza, y la expresión de ARNm de Bcl-2 estaba significativamente regulada a la baja , y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">echinacósidoy el grupo de losartán potásico, y la expresión de ARNm de Bcl-2 se reguló significativamente, y las diferencias fueron estadísticamente significativas (P<>

Tabla 6 Efectos de ECH sobre la expresión del gen relacionado con la apoptosis en tejido renal de ratas DN

2.8 Los efectos deechinacósidoen la expresión de proteínas VCAM-1, TGF- y -SMA endiabéticonefropatíaLas ratas se muestran en la Figura 3 y la Tabla 7. En comparación con el grupo de control, la expresión de la proteína VCAM-1, TGF- y -SMA en el grupo modelo se reguló significativamente y la diferencia fue estadísticamente significativa (P ＜0.05); Las expresiones de proteínas VCAM-1, TGF- y -SMA en ratas en el grupo de dosis y el grupo de losartán potásico se regularon significativamente a la baja, y las diferencias fueron estadísticamente significativas (P<>

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