La ciclopentanona ejerce actividades antimelanogénesis y antiarrugas en el melanoma B16F10

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Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 y Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Resumen:La exposición a la radiación ultravioleta (UV) es la causa principal del envejecimiento extrínseco de la piel, lo que provoca hiperpigmentación y arrugas en la piel. En este estudio, investigamos el efecto blanqueador de (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroxi-4-metoxibencilideno)ciclopentanona (BHCP) en el melanoma B16F10 y su anti- actividad de las arrugas en las células de fibroblastos Hs27. Se descubrió que el BHCP inhibe potentemente la tirosinasa, con valores de concentración de inhibición del 50 por ciento (IC50) de 1,10 μM y 8,18 μM de formicofenolato (L-tirosina) y difenolasa (L-DOPA), y el estudio de cinética enzimática reveló que el BHCP es un inhibidor de la tirosinasa de tipo competitivo . Además, BHCP inhibió significativamente el contenido de melanina y la actividad de la tirosinasa celular y reguló a la baja los niveles del factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF), los niveles fosforilados de la proteína de unión al elemento de respuesta cAMP (CREB) y la tirosinasa inducida por la hormona estimulante de los melanocitos (-MSH). Células de melanoma B16F10. Además, BHCP inhibió la fosforilación de p65 y la expresión de metaloproteinasas de matriz (MMP-1, MMP-9, MMP-12 y MMP-13) en fibroblastos Hs27 estimulado con radiación UV. Por lo tanto, nuestros resultados demuestran que BHCP puede ser un buen candidato para el desarrollo de agentes terapéuticos para enfermedades asociadas con hiperpigmentación y arrugas.

Palabras clave: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroxi-4-metoxibencilideno)ciclopentanona (BHCP); inhibidor de tirosinasa; anti-melanogénesis; anti arrugas

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1. Introducción

El envejecimiento cutáneo es un proceso complejo y progresivo que conduce a cambios funcionales y estéticos en la piel, siendo responsables tanto factores intrínsecos como extrínsecos [1]. El envejecimiento extrínseco de la piel es causado por agresores ambientales, como la radiación ultravioleta (UV), el estrés o el tabaquismo. Sin embargo, es causado principalmente por la exposición repetida a los rayos UV del sol, lo que se denomina fotoenvejecimiento. El fotoenvejecimiento de la piel se caracteriza por arrugas gruesas y profundas, grosor, aspereza, despigmentación y cambios histológicos [2–4].

La tirosinasa (EC 1.14.18.1), que también se conoce como polifenol oxidasa, es una de las enzimas multifuncionales que contienen cobre involucradas en la síntesis de melanina y se encuentra ampliamente en la naturaleza [5]. La tirosinasa suele estar presente en la mayoría de los microorganismos, plantas, y animales En las plantas, la tirosinasa actúa oxidando monofenoles a difenoles (actividad de micofenolato) y participa en la oxidación de o-difenoles a o-quinonas (actividad de difenolasa), seguida de la oxidación de quinonas a pigmentos de color marrón oscuro [6].

La melanogénesis es la transformación de L-tirosina en 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), por lo que la L-DOPA se convierte en DOPA quinina [7]. Por lo tanto, la tirosinasa juega un papel importante en la producción de melanina en los melanocitos, y la inhibición de la tirosinasa es un objetivo atractivo para mejorar los trastornos relacionados con la pigmentación y para el desarrollo de agentes blanqueadores [8,9]. La síntesis de melanina es inducida por varios estímulos, como los rayos UV y sustancias químicas que incluyen isobutilmetilxantina (IBMX) y hormona estimulante de melanocitos alfa (-MSH). -MSH se une a su receptor de melanocortina 1 (MC1R), aumentando posteriormente el nivel de AMP cíclico citoplasmático (cAMP). El aumento del nivel de AMPc activa la proteína quinasa A (PKA), que induce la expresión del factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF) a través de la fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc (CREB). MITF induce la expresión de tirosinasa, proteína relacionada con tirosinasa (TRP)-1 y TRP-2, lo que finalmente da como resultado un aumento de la síntesis de melanina [10]. MITF se considera un factor de transcripción clave de la melanogénesis; por lo tanto, se han realizado muchos estudios para controlar la expresión de MITF para inhibir la melanogénesis [11].

Se sabe que la formación de arrugas está estrechamente relacionada con la degradación de la matriz extracelular de la piel, y la radiación UV activa el factor nuclear-κB (NF-κB), aumentando así la producción de fragmentación de colágeno y metaloproteinasas de matriz (MMP) [2]. Las MMP son endopeptidasas dependientes de zinc que son importantes en la remodelación de la estructura de la matriz extracelular en la piel. Por lo tanto, la degradación excesiva del colágeno y la matriz por las MMP inducidas por UV es un rasgo característico de la piel dañada por el sol, y las MMP se utilizan como un marcador principal del fotoenvejecimiento inducido por UV, así como de la inflamación de la piel [12].

Los derivados del esqueleto de diarilheptanoide similares a la curcumina se han incluido antioxidantes, se han informado actividades anticancerígenas. (BHCP) (Figura 1),para exhibir una amplia gama de anti-inflamación, anti-melanogénesis, especialmente, Leow et al. [19] informado en bioactividades y antitirosinasa [13–18]dibencilideno-ciclopentanona 2014 que podría contribuir a los efectos protectores sobre el osteosarcoma humano a través de la regulación de la vía de señalización Wnt/ -catenina. Sin embargo, los efectos anti-melanogénesis y anti-arrugas de BHCP aún no se han descubierto, y los mecanismos moleculares que subyacen a su actividad aún no se han establecido claramente.

Figura 1. Estructura de (2E,5E)-bis(3-hidroxi-4-metoxibencilideno)ciclopentanona (BHCP).

En el presente estudio, investigamos el potencial anti-melanogénesis y anti-arrugas de BHCP, y buscamos identificar el mecanismo involucrado, especialmente con respecto al contenido de melanina y la actividad de tirosinasa celular, que se exploraron mediante el ensayo de inhibición de tirosinasa y el análisis de la cinética enzimática. Además, demostramos que BHCP ejerce un efecto inhibidor sobre la melanogénesis y las arrugas que se asocia con la regulación a la baja de CREB/MITF/tirosinasa en células de melanoma de ratón B16F10 inducidas por -MSH y la inhibición de la fosforilación de p65 y la expresión de MMP en fibroblastos humanos Hs27 inducidos por UV.

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2. Resultados y Discusión

2.1. Síntesis de (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroxi-4-metoxibencilideno)ciclopentanona (BHCP)

Una solución de {{0}}hidroxi-4-metoxibenzaldehído (100 mg, 0,66 mmol, isovainillina) y ciclopentanona (0,03 ml, 0,33 mmol) en solución de ácido acético-HCl 1 N (0,02 mL) se agitó a 25 ◦C durante 2 h. Después de reposar durante 1 día, la mezcla de reacción se trató con agua fría en presencia de una pequeña cantidad de metanol, se filtró y se lavó con agua fría para producir BHCP (65,9 mg) con un rendimiento del 56,9 por ciento. El BHCP se identificó mediante métodos espectroscópicos, incluidos 1H y 13C-NMR, así como por comparación con datos espectrales publicados y análisis de cromatografía en capa fina (TLC) [19]. La estructura se muestra en la Figura 1.

BHCP: polvo amorfo amarillo (CHCl3); 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9,25 (s, 2H, 2 × OH),7,28(s,2H,2×vinílicoH), 7,14 (d, 2H , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7,11 (dd, 2H, J=8,5, 2,0 Hz, 2×6- H), 7,01 (d, 2H, J=8,5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) δ: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-EM: m/z 351 (M − H)−.

2.2. Efecto inhibitorio de BHCP sobre la actividad de tirosinasa de hongos

Como se muestra en la Tabla 1, BHCP inhibió la tirosinasa con valores de IC50 de 1,10 ± 0,12 μM y 8,18 ± 0,44 μM, mientras que el ácido kójico (control positivo) tuvo valores de IC50 de 18,68 ± 1,40 μM y 33,89 ± 1,16 μM para monofenolasa y difenolasa, respectivamente. En nuestro estudio anterior de inhibidores potenciales sintéticos de la tirosinasa, encontramos el mecanismo a través de estudios de modelado molecular por el cual los grupos 3-hidroxi y 4-metoxi del bencilideno tenían grandes tendencias de unión hacia el sitio activo de la tirosinasa [20]. A partir del resultado de este estudio, se demostró que sus grupos funcionales (grupos 3-hidroxi y 4-metoxi) se asociaron con un aumento significativo en la actividad inhibidora de la tirosinasa.

Tabla 1. Actividad inhibidora de tirosinasa y análisis cinético enzimático de BHCP.

Además, el mecanismo responsable de la inhibición de la tirosinasa por BHCP se investigó mediante un análisis cinético enzimático en el presente estudio (Tabla 1 y Figura 2). Se dibujaron gráficas de Lineweaver-Burk utilizando los datos obtenidos de los estudios cinéticos, y la constante de inhibición (Ki) se obtuvo de las gráficas de Dixon. Los gráficos recíprocos dobles de Lineweaver-Burk indicaron una inhibición de tipo competitivo. Como se muestra en la Figura 2a-c, BHCP actuó como un inhibidor competitivo tanto de L-tirosina como de L-DOPA. Además, las intersecciones en el eje x de los gráficos de Dixon son comúnmente se utiliza para determinar los tipos de constantes de inhibición de enzimas (Ki) para un complejo enzima-inhibidor [21,22], donde el valor del eje x indica el valor de −Ki. Como se muestra en la Figura 2b-d, los valores Ki de BHCP fueron 1,7 μM y 10,5 μM como sustratos para L-tirosina y L-DOPA, respectivamente. Como el valor de Ki representa la concentración necesaria para formar un complejo enzima-inhibidor, un valor de Ki más bajo sugiere una inhibición más eficaz contra la tirosinasa.

Figura 2. Gráficos de Lineweaver-Burk (a,c) y Dixon (b,d) para la inhibición de la enzima tirosinasa por BHCP.

2.3. Efectos de BHCP sobre la viabilidad celular de células de melanoma B16F10 y fibroblastos Hs27

Antes de determinar si BHCP ejercía alguna actividad antimelanogénesis y antiarrugas, examinamos la citotoxicidad de BHCP para las células B16F10 y las células Hs27 mediante el tratamiento con diferentes concentraciones de BHCP durante diferentes intervalos de tiempo, y la viabilidad celular se midió con el ensayo EZ-Cytox. Como se muestra en la Figura 3a,b, hasta 10 μM de BHCP durante 48 h no redujeron la supervivencia ni de las células B16F10 ni de las células Hs27. Posteriormente, se realizaron más estudios in vitro sobre las actividades antimelanogénesis y antiarrugas de BHCP con 1, 5 y 10 μM.

2.4. Inhibición de BHCP contra el contenido de melanina y la actividad de tirosinasa celular en células de melanoma B16F10

Para determinar si BHCP ejerce un potencial inhibitorio sobre el contenido de melanina de las células B16F10 inducidas por -MSH, las células se pretrataron con las diferentes concentraciones indicadas (1, 5 y 10 μM) de BHCP o ácido kójico (5 mM) durante 24 h y luego se estimularon con -MSH durante 48 h. Como se muestra en la Figura 4a, el contenido de melanina en las células tratadas con BHCP en presencia de -MSH disminuyó de manera dependiente de la concentración, mostrando un 113 % a 1 μM, un 106 % a 5 μM y un 102 % a 10 μM, en comparación con el grupo de control tratado solo con -MSH (186 por ciento). Curiosamente, BHCP (1 μM) inhibió el contenido de melanina más fuertemente que el ácido kójico (5 mM). Además, se realizó un ensayo de actividad de tirosinasa celular para medir el efecto inhibidor de BHCP en células B16F10. Como se muestra en la Figura 4b, BHCP disminuyó de manera dependiente de la concentración con la actividad de tirosinasa en un 120 por ciento a 1 μM, 116 por ciento a 5 μM y 105 por ciento a 10 μM, en comparación con el grupo de control tratado solo con -MSH (181 por ciento). por ciento). El efecto inhibitorio de BHCP fue mucho más potente que el del ácido kójico; la inhibición de BHCP a 1 μM fue superior a la del ácido kójico a 5 mM (131 por ciento). Estos resultados sugieren que BHCP tiene un efecto blanqueador al inhibir la biosíntesis de melanina y la síntesis de tirosinasa intracelular en los melanocitos B16F10.

Figura 4. Inhibición del contenido de melanina (a) y actividad de tirosinasa celular (b) de BHCP en células de melanoma B16F10.

2.5. Efectos de BHCP sobre la expresión de MITF/tirosinasa y CREB fosforilado en células B16F10

MITF, un factor de transcripción específico, juega un papel fundamental en la activación eficaz de los genes melanogénicos, incluida la tirosinasa, que cataliza el paso limitante de la velocidad en la biosíntesis de melanina: TRP-1 y TRP-2. La expresión de MITF podría aumentarse por la fosforilación de CREB [23]. CREB es un importante promotor de MITF [24,25], y la fosforilación de CREB en los melanocitos aumenta la expresión de MITF al unirse a CREB (proteína de unión al elemento de respuesta c-AMP) en los melanocitos [26]. Para dilucidar las vías moleculares responsables del efecto antimelanogénico de BHCP en las células B16F10, examinamos los niveles de proteína de moléculas clave, incluidas CREB y MITF, que desempeñan funciones importantes en la melanogénesis mediante análisis de transferencia Western. Las células se trataron con BHCP o ácido kójico y luego se estimularon con -MSH durante 48 h. El intervalo de tiempo para las mediciones siguió la metodología descrita en estudios previos [27]. Como se muestra en la Figura 5, los niveles de tirosinasa y MITF aumentaron con -MSH, pero BHCP disminuyó estos niveles de proteína. Además, BHCP suprimió significativamente la fosforilación de CREB. Se sabe que la regulación de la fosforilación de CREB inducida por -MSH es potencialmente importante en la regulación de la pigmentación [28]. Estos resultados indican que los efectos antimelanogénicos de BHCP resultan de la regulación a la baja de MITF y tirosinasa a través de la regulación a la baja de CREB fosforilado. El presente estudio sugiere que la aclaración del mecanismo de inhibición de BHCP sobre la tirosinasa y la melanogénesis es crucial y debe investigarse más en el futuro. Aunque la línea celular de melanoma B16F10 es generalmente más adecuada para investigar mecanismos de señalización in vitro, la línea celular B16F10 es de un melanoma de roedor. Por lo tanto, serán necesarios más estudios en melanocitos humanos para confirmar los hallazgos.

2.6. Efecto de BHCP en la activación de NF-κB p-p65 inducida por UV en células Hs27

Luego investigamos el efecto de BHCP en la expresión inducida por UV de mediadores inflamatorios utilizando fibroblastos Hs27. Se ha informado previamente que la fosforilación de p65 (Ser536) es esencial para su capacidad de transactivar genes [29]. Por lo tanto, los niveles de proteína de p-p65 (Ser536) yp65 se examinaron en la fracción de núcleo mediante transferencia de Western. Como se indica en la Figura 6a,b, en células Hs27, UV aumentó los niveles de proteína p-p65 (Ser536) en el núcleo, mientras que el tratamiento con BHCP disminuyó los niveles de proteína p-p65 (Ser536) del núcleo. En consecuencia, la cantidad total de p65 se redujo en el citoplasma por UV y se restauró por BHCP (Figura 6c, d). Aunque los niveles de expresión de la proteína p65 disminuyeron en el citoplasma y aumentaron en el núcleo después de la inducción UV, el pretratamiento con BHCP revirtió estas tendencias de manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, estos resultados sugieren que la inhibición de p-p65 por BHCP podría contribuir a los efectos protectores sobre la pigmentación de la piel y la destrucción de colágeno contra los rayos UV.

Figura 6. Efectos de BHCP sobre los niveles de expresión de p-p65 (Ser536) en células de fibroblastos humanos Hs27 inducidas por UV.

2.7. Efecto de BHCP sobre la expresión de MMP en células Hs27

Las MMP juegan un papel vital en el envejecimiento de la piel. La irradiación UV altera los tejidos conectivos de la piel al aumentar la expresión de las MMP [30,31]. MMP-1 es una enzima que descompone el colágeno que acelera la descomposición del colágeno sintetizado a partir del procolágeno tipo I. MMP-9 es una enzima que descompone la gelatina que descompone las fibras de colágeno cortadas por MMP-1, aumentando la producción de arrugas y la pérdida de elasticidad. Para examinar el efecto antiarrugas de BHCP contra la inducción de UV, determinamos los niveles de proteína MMP-1 y MMP-9 mediante transferencia Western. Además, las células inducidas por UV mostraron un nivel significativamente elevado de MMP-13, que inicia la degradación del colágeno tipo I y III en lugar de MMP-1 [32]. Investigamos el aumento de MMP (MMP1, MMP9, MMP12 y MMP13) después del tratamiento de células Hs27 inducidas por UV con BHCP a 1 y 10 μM. Como se muestra en la Figura 7, los niveles de expresión de MMP-1, MMP-9, MMP-12 y MMP-13 aumentaron después de la inducción UV; sin embargo, el tratamiento con BHCP disminuyó la expresión en una dosis -manera dependiente. Nuestros resultados sugieren que BHCP podría contribuir a la prevención de la formación de arrugas al reducir la producción anormal de MMP inducida por la exposición a los rayos UV. Estos resultados implican que BHCP inhibe la expresión de MMP en los fibroblastos Hs27 para prevenir la descomposición del colágeno y, por lo tanto, la producción de arrugas. Por lo tanto, BHCP exhibe el potencial de uso como fármaco preventivo y de tratamiento de enfermedades relacionadas con la piel.

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3. Material y Métodos

3.1. Químicos e Instrumentación

La tirosinasa de hongos (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tirosina, 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), dimetilsulfóxido (DMSO) y ácido kójico se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, EE. MO, EE. UU.). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero bovino fetal, la estreptomicina y la anfotericina se adquirieron de Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, EE. UU.). Anticuerpos contra MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tirosinasa, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , y -actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU.). Las membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) se obtuvieron de Millipore Corporation (Bedford, MA, EE. UU.). Se adquirieron utensilios de plástico estériles para cultivos de tejidos de SPL Labware (Seúl, Corea). La fuente de luz UV fue proporcionada por la unidad de 6 lámparas de la serie Crosslinker 800 (UVP, CA, EE. UU.) (8 vatios/lámpara). La cromatografía de capa fina y el gel de sílice 60 (malla 230–400) se realizaron en gel de síliceF{{27} }placas prerrevestidas de Merck Millipore (Darmstadt, Alemania). Los espectros de RMN se registraron usando instrumentos Varian Unity INOVA 400 (400 MHz para 1H, 100 MHz para 13C) y Varian Unity AS 500 (500 MHz para 1H). Los valores de desplazamiento químico (δ) se notifican con referencia a los respectivos picos de deuterado o disolvente residual (δH 2,50 y δC 39,51 para DMSO). Los datos de espectrometría de masas de baja resolución se obtuvieron con un espectrómetro de masas Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, EE. UU.).

3.2. Ensayo de inhibición de tirosinasa de hongos

La actividad inhibidora de la tirosinasa de hongos se determinó utilizando L-tirosina y L-DOPA como sustratos, según el procedimiento descrito por Jung et al. [23]. Brevemente, se añadieron 190 μL de enzima tirosinasa (1000 U diluidos con tampón de tirosinasa de hongo, incluyendo solución de L-tirosina y L-DOPA 1 mM), en presencia o ausencia de compuestos (concentración final que va de 1 a 20 μM, disueltos en 100 % DMSO), a cada pocillo de una 96-placa de pocillos, para proporcionar un volumen final de 200 μl. La placa se incubó a 37 ◦C durante 30 min. La actividad tirosinasa se cuantificó midiendo la absorbancia a 492 nm utilizando un lector de microplacas (TECAN, Salzburgo, Austria) y el porcentaje de inhibición (porcentaje) se obtuvo a partir de la siguiente ecuación:

porcentaje de inhibición=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

donde Ac es la absorbancia del control y As es la absorbancia de la muestra. Los valores IC50 se calcularon a partir de las curvas logarítmicas lineales y sus ecuaciones. Se muestran los resultados promedio de tres determinaciones. Se utilizó ácido kójico como control positivo.

3.3. Análisis cinético de la inhibición de tirosinasa

Para determinar los mecanismos cinéticos se utilizaron dos métodos cinéticos (Lineweaver-Burk y Dixon plots) de forma complementaria [21,22,33]. Para los gráficos recíprocos dobles de Lineweaver-Burk (un gráfico de 1/velocidad de la enzima (1/V) frente a 1/concentración de sustrato (1/[S])), el tipo de inhibición se determinó usando varias concentraciones de L-tirosina (1, 2, y 4 mM) y L-DOPA (0.5, 1 y 2 mM) como sustratos en presencia de diferentes concentraciones de BHCP. Las concentraciones de BHCP fueron las siguientes: 0, 0.5, 1.{{20}} y 2.0 μM para L-tirosina; y 0, 2,5, 5 y 10 μM para L-DOPA. El gráfico de Dixon es un método gráfico (gráfico de 1/velocidad de la enzima (1/V) frente a la concentración de inhibidor (I)) para la determinación del tipo de inhibición de la enzima y se utilizó para determinar la constante de disociación o Ki para el complejo inhibidor-enzima. Se obtuvieron gráficos de Dixon (gráficos recíprocos simples) de la inhibición en presencia de sustrato de L-tirosina a 1, 2 y 4 mM y {{40}}, 0.5, 1.{ {47}}, y 2.0 μM para BHCP; y L-DOPAsustrato en {{50}}.5, 1.0 y 2,0 mM y 0, 2,5, 5,0 y 10,0 μM para BHCP.

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3.4. Líneas celulares y cultivo celular

Se obtuvieron células de melanoma murino B16F10 del Korean Cell Line Bank. La línea celular de fibroblastos de piel humana Hs27 se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Estas células se mantuvieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento, penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 mg/mL en una incubadora humidificada con CO2 al 5 por ciento a 37 ◦C. Los fibroblastos dérmicos en un plato de 100 mm se trataron con BHCP y se expusieron a 50 mJ/cm2UV en DMEM sin suero (fuente de luz UV, UVP). Las células Hs27 se cultivaron hasta una confluencia del 70 al 80 por ciento en una placa de 100 mm de diámetro y se usaron entre los pases 5 y 15.

3.5. Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad de las células se evaluó utilizando el ensayo del kit EZ-Cytox. En resumen, se sembraron células B16F10 y fibroblastos Hs27 en una placa de 96-pocillos a una densidad de 1 × 104 células/pocillo y se incubaron a 37 ◦C durante 24 h. Las células se alimentaron con DMEM fresco sin suero que contenía diferentes concentraciones (0, 1, 2, 5 y 10 μM) de BHCP y se incubaron durante 24 y 48 h. Posteriormente, se cargaron 10 μL de solución EZ-Cytox en cada pocillo y las células se incubaron durante 2–4 h. La medida de la absorbancia de las células en ausencia de cualquier tratamiento se consideró como una supervivencia celular del 100 por ciento. Cada tratamiento se realizó por triplicado y cada experimento se repitió tres veces.

3.6. Determinación del ensayo de contenido de melanina

El efecto de BHCP sobre la melanogénesis inducida por -MSH en células B16F10 se basó en un método utilizado previamente con ligeras modificaciones [34]. Brevemente, se permitió que las células B16F10 (5 × 104 células/pocillo) en 6-placas de pocillos crecieran hasta una confluencia del 70 al 80 por ciento. Luego, las células se trataron con diferentes concentraciones de BHCP (1, 5 y 10 μM) o ácido kójico (5 mM) durante 24 h y luego se estimularon con -MSH (5 μM) durante 48 h. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces con PBS helado, se disolvieron en 90 μL de solución de NaOH 1 M que incluía DMSO (5 por ciento) a 60 ◦C durante 1 h, y se midió la absorbancia a 405 nm con un espectrofotómetro de microplacas (TECAN, Salzburgo). , Austria). Para medir la cantidad de melanina en el experimento, se calculó la tasa de inhibición en los grupos de tratamiento a partir de la absorbancia de las concentraciones conocidas de melanina sintética, que se corrigieron a la cantidad total de proteína que estaba presente en el sobrenadante de los lisados ​​celulares. La absorbancia de las células no tratadas se midió por triplicado.

3.7. Ensayo de actividad de tirosinasa celular

El ensayo de actividad de tirosinasa celular se realizó midiendo la tasa de oxidación de L-DOPA [35]. Se colocaron células B16F10 a una densidad de 5 × 104/células en 6-placas de pocillos y se incubaron durante la noche. Luego, las células se trataron con varias concentraciones de BHCP (1, 5 y 10 μM) o ácido kójico (5 mM) durante 24 h y luego se estimularon con -MSH (5 μM) durante 48 h. Las células se lavaron con PBS y se lisaron en una solución que contenía 100 μl de tampón de fosfato 50 mM (pH 6,5), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM y Triton X-100 al 1 por ciento. Luego, las células se colocaron en una máquina de ultracongelación (-80 ◦C) durante 30 min. Tras descongelar las células, los extractos celulares se purificaron mediante centrifugación a 12,000 rpm durante 30 min a 4 ◦C. Se agregaron un total de 80 μL del sobrenadante y 20 μL de L-DOPA (2 mg/mL) a una placa de 96-pocillos, y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 492 nm cada 10 min durante 1 h a 37 ◦ C con lector de placas ELISA (TECAN, Salzburgo, Austria).

3.8. Preparación de extractos citosólicos y nucleares de células Hs27

Las células Hs27 se lavaron con PBS enfriado con hielo y se recolectaron. Se usó un tampón que contenía Tris 10 mM (pH 8.0), MgCl2 1,5 mM, DTT 1 mM, NP-40 al 0,1 por ciento e inhibidores de la proteasa para la extracción de fracciones citosólicas por centrifugación a 12,000 rpm a 4 ◦C durante 15 min, y las fracciones nucleares se extrajeron de los sedimentos utilizando un tampón que contenía Tris 10 mM, KCl 50 mM, NaCl 100 mM e inhibidores de proteasa, se incubaron en hielo durante 30 min, y luego se centrifugó a 13,000× g durante 30 min a 4 ◦C para obtener fracciones nucleares.

3.9. Transferencia occidental

Las muestras de lisado se hirvieron durante 10 min en tampón de carga de gel (Tris-HCl 125 mM, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 4 %, 2-mercaptoetanol al 10 % y bromofenol al 0,2 %. azul; pH 6,8) en una relación volumétrica de 1:1. Los equivalentes de proteína total para cada muestra se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE) usando geles de acrilamida según el procedimiento descrito por Laemmli [36] y se transfirieron a membranas de PVDF a 80 V durante 2 h usando el sistema de transferencia húmeda. Las membranas se colocaron inmediatamente en un tampón de bloqueo (leche sin grasa al 5 por ciento) en Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mMN y Tween al 0,1 por ciento-20. Las transferencias se bloquearon para evitar la unión no específica a 25 ◦C durante 2 h. Posteriormente, las membranas se incubaron con un anticuerpo primario específico a 4 ◦C durante la noche, seguido de una incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante a 25 ◦C durante 1 h . El marcaje de anticuerpos se detectó mediante quimioluminiscencia mejorada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cuantificación de proteínas se realizó utilizando el Davinch-Chemi TM. Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seúl, Corea). Se usaron marcadores proteicos preteñidos para la determinación del peso molecular.

3.10. Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± SEM. Los datos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para las diferencias entre tratamientos, seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni. Un valor de p < 0.05="" se="" consideró="" estadísticamente="">

4. Conclusiones

En resumen, los hallazgos del presente estudio demostraron que BHCP tiene un efecto blanqueador de la piel a través de la inhibición de la tirosinasa, que es una enzima clave para la biosíntesis de melanina en los melanocitos B16F10 inducidos por -MSH. Además, BHCP disminuyó la expresión de los niveles de proteína MMP en los fibroblastos inducidos por UV, lo que se espera que tenga un efecto antiarrugas. Se requiere más investigación para confirmar los efectos blanqueadores y antiarrugas de BHCP a través de estudios clínicos y en animales. Finalmente, se identificó que BHCP tiene efectos blanqueadores y antiarrugas, lo que indica su potencial para el desarrollo de agentes terapéuticos para enfermedades asociadas con hiperpigmentación y arrugas.

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