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Yuto Mitsuhata1, Takaya Abe2, Kazuyo Misaki3, Yuna Nakajima1, Keita Kiriya1,

Miwa Kawasaki4, Hiroshi Kiyonari2, Masatoshi Takeichi4*, Mika Toya1,4,5,6*&

Masamitsu Sato1,6,7

Cistanche puede mejorar la función renal

Las células epiteliales organizan una serie ordenada de microtúbulos no centrosómicos, cuyos extremos negativos están regulados por CAMSAP3. Sin embargo, el papel de estos microtúbulos en las funciones epiteliales es poco conocido. Aquí, mostramos que elriñonesde ratones en los que está mutado Camsap3 desarrollanquistesen los túbulos contorneados proximales (PCT). Los PCT estaban severamente dilatados en el mutanteriñones, y también exhibieron una proliferación celular mejorada. En estos PCT, las células epiteliales engordaron junto con la perturbación de las matrices de microtúbulos, así como de ciertas estructuras subcelulares, como los procesos basales interdigitados. Además, YAP y PIEZO1, que se conocen como reguladores mecanosensibles para la formación y proliferación celular, se activaron en estas células PCT mutantes. Estas observaciones sugieren que las redes de microtúbulos mediadas por CAMSAP3 son importantes para mantener las propiedades mecánicas adecuadas de las células PCT, y su pérdida desencadena la deformación y proliferación celular a través de la activación de mecanosensores, lo que resulta en la dilatación de las PCT.

Las células epiteliales son componentes principales de varios órganos. Muestran una polaridad de apical a basal que está relacionada con sus funciones, como la absorción y la secreción. En las células epiteliales diferenciadas, la mayoría de los microtúbulos no son centrosómicos y están alineados a lo largo del eje apical a basal1–3. CAMSAP3 es un miembro de la familia de proteínas asociadas a la espectrina regulada por calmodulina (CAMSAP)/Nezha/Patronin y es importante para la organización de los microtúbulos epiteliales4–8. CAMSAP3 se une y estabiliza los extremos negativos de los microtúbulos4,6,9. En las células del intestino delgado de ratones, CAMSAP3 se concentra en las regiones corticales apicales, anclando los extremos negativos de los microtúbulos no centrosomales a estos sitios10,11, lo que da como resultado la formación de conjuntos de microtúbulos orientados hacia la dirección apicobasal con los extremos positivos apuntados basalmente. . Sin embargo, esta organización característica de microtúbulos se pierde en ratones que portan un gen mutante que codifica un Camsap3 truncado (ratones Camsap3dc/dc), en los que se elimina el dominio de unión a microtúbulos C-terminal. Las células epiteliales intestinales en estos ratones tienen varios defectos citológicos, que incluyen una altura celular reducida y orgánulos mal colocados, como el núcleo y Golgi10. A pesar de estas grandes perturbaciones en la arquitectura intracelular, las células epiteliales mantienen láminas bidimensionales de aspecto normal10,12, y los intestinos mutados no tenían defectos fisiológicos evidentes.

túbulos (PCT), el asa de Henle, los túbulos contorneados distales y el conducto colector. Estas subestructuras de nefrona consisten en una sola capa de epitelio, que funciona para la filtración, reabsorción y secreción.

A renal quistees una lesión patológica común delriñones. La lesión quística es variable; Se forman quistes focales o múltiples en un solo lado o bilateralmente en los riñones, mostrando un grado diferente de síntomas13–15. Varios quísticos congénitosrenalenfermedades, incluida la poliquísticariñón(PKD), enfermedad renal glomeruloquística (GCKD) y enfermedad quística medularriñón(MCKD), se sabe que causan múltiplesrenalquistes en riñones bilaterales. En la PKD, los quistes se distribuyen uniformemente por todo el órgano, incluidos los PCT, mientras que la GCKD y la MCKD desarrollan quistes en las cápsulas de Bowman y los conductos colectores (principalmente en la región del bulbo raquídeo), respectivamente16–19.

En cuanto a la PKD, se conocen dos causas principales: 1) mutaciones en el gen Pkd1 o Pkd2, y 2) mutaciones en los genes necesarios para la biogénesis del cilio primario. Pkd1 y Pkd2 codifican policistina 1 y policistina 2, respectivamente, que son canales catiónicos no selectivos 20 que se localizan en varios compartimentos celulares, incluidos los cilios primarios 21,22. En ratones portadores de una forma mutante de PKD1 o PKD2, las proteínas de policistina no se localizan en los cilios23. Los genes necesarios para la biogénesis de los cilios primarios incluyen If88 y Kif3a, que están involucrados en el transporte intrafagelar24–26. Las mutaciones en estos genes también resultan enrenalenfermedades quísticas24–27 . Aunque la relación entre estas dos vías causales es complicada23, una vía que se ha demostrado que induce PKD involucra al efector de señalización Hippo Yap28. En ratones mutantes Pkd1, el coactivador de transcripción YAP/TAZ y su efector c-Myc se activan y promueven la cistogénesis28. Sin embargo, los mecanismos que subyacen al desarrollo de poliquistosisriñonessiguen siendo en gran parte desconocidos.

En el presente estudio, investigamos los roles de CAMSAP3 enriñónestructura y función. Nuestras observaciones muestran que CAMSAP3 localizado apicalmente contribuye a la orientación adecuada de los microtúbulos no centrosomales, así como al establecimiento de la arquitectura intracelular de las células epiteliales en PCT, como se observa en el intestino delgado. Sin embargo, a diferencia del epitelio intestinal, CAMSAP3disfuncióncausó anomalías a nivel de órganos en riñones bilaterales, es decir, formación de quistes en PCT. La pérdida de la función CAMSAP3 resultó en la activación de reguladores mecanosensibles que normalmente ayudan a preservar la integridad del tejido. Nuestro estudio sugiere que la organización de microtúbulos no centrosomales mediada por CAMSAP3-es importante para mantener las propiedades mecanosensibles de los PCT, y la pérdida de este sistema provoca la formación de quistes regionales en el riñón.

Resultados

Quisteformación enriñonesde ratones mutantes Camsap3. El análisis fenotípico de ratones mutantes Camsap3dc/dc reveló queriñonesen ratones Camsap3dc/dc envejecidos (~ 2 años) estaban hipertróficos y descoloridos (Fig. 1a). Para analizar más a fondo las anomalías en Camsap3dc/dcriñones, examinamos ratones más jóvenes. En el día postnatal 21 (P21), los riñones de Camsap3dc/dc tenían una apariencia normal. Sin embargo, la sección del riñón reveló estructuras quísticas en las regiones corticales (Fig. 1b y Fig. S1a complementaria), como se confirmó al calcular el índice quístico, que es la relación entre las áreas que contienen quistes y el área total del riñón (Fig. 1c). Examinamos embriones mutantes para determinar cuándo comienzan a formarse quistes durante el desarrollo, lo que reveló un signo de aumento de la formación de quistes aproximadamente en el día embrionario 17.5 (E17.5) (Fig. S1a complementaria, flechas). En P0, los quistes corticales se volvieron fácilmente discernibles (Fig. S1a complementaria, flechas), y su tamaño y número aumentaron en P21 (Fig. 1b, Fig. S1a complementaria, flechas). A medida que los ratones envejecían, los fenotipos quísticos se hicieron más evidentes, aunque el grado de formación de quistes varió entre los individuos (Fig. 1c y Fig. S1b complementaria). Además, la relación entre el peso del riñón y el peso corporal fue mayor para los ratones Camsap3dc/dc que para los ratones de tipo salvaje (WT) durante su vida útil (Fig. 1d y Fig. S1c complementaria, d). Por lo tanto, los riñones de Camsap3dc/dc exhibieron formación de quistes, que aumentaron con el tiempo, lo que resultó en hipertrofia en riñones envejecidos.

Los ratones Camsap3dc/dc expresan un CAMSAP3 truncado en el dominio C-terminal (CAMSAP3-dc)10, que podría estar involucrado en el fenotipo quístico observado en los riñones del ratón. Para investigar esta posibilidad, generamos un mouse Camsap3–/– (Camsap3-null) (Fig. S2a,b complementaria) (ver también Métodos en detalle). Estos ratones también teníanriñonescon múltiples quistes, y su fenotipo era indistinguible del observado en ratones Camsap3dc/dc; en particular, los ratones heterocigotos (Camsap3 plus /–) no mostraron signos de riñones poliquísticos (Fig. S2c complementaria).

Formación de quistes en PCT de Camsap3dc/dcriñones. Para determinar qué estructuras se volvieron quísticas en el mutanteriñones, llevamos a cabo la inmunotinción de tres segmentos de nefrona para tres proteínas, a saber, Megalin (se localiza en PCT), un cotransportador de Na más / Cl– (túbulos contorneados distales) y acuaporina -2 (conductos colectores). Los resultados mostraron que la dilatación se produjo exclusivamente en los túbulos Megalin-positivos en P21 (Fig. 1e y Fig. S1e complementaria), lo que indica que la cistogénesis se restringió a PCT. Los PCT se subdividen en tres segmentos, a saber, S1, S2 y S3, y los distinguimos mediante inmunotinción para los transportadores de glucosa SGLT1 y SGLT2, que se localizan en los segmentos S3 y S1/S2, respectivamente29,30. Los túbulos dilatados estaban marcados únicamente por SGLT2 (Fig. 1f), lo que indica que la cistogénesis ocurre en los segmentos S1/S2. Sin embargo, en ratones mutantes más viejos, la formación de quistes también se extendió a la cápsula de Bowman (Fig. 1g).

Arquitectura celular desorganizada en PCT quísticos. Para explorar los defectos a nivel celular en los PCT quísticos, primero los examinamos mediante microscopía electrónica de barrido y descubrimos que una población derenalLos túbulos se hincharon notablemente en los riñones Camsap3dc/dc (Fig. 2a), aunque el grado de hinchazón varió de una posición a otra del túbulo. Las secciones transversales revelaron que, en las porciones hinchadas de un túbulo, su luz se expandió junto con el adelgazamiento de la capa epitelial que compone los túbulos (Fig. 2a). La cuantificación con muestras teñidas con hematoxilina y eosina confirmó que la altura de las células se redujo en los túbulos dilatados (Fig. 2b), mientras que el perímetro apical de cada célula aumentó (Fig. 2c), lo que indica que las células mutantes eran más gordas que las de WTriñones.

A continuación, examinamos si la arquitectura celular y/o las estructuras subcelulares de los PCT se vieron afectadas por la mutación de Camsap3. La inmunotinción para DPP IV, un marcador de membrana apical, y para Na más /K más -ATPasa, un marcador de membrana basolateral, indicó que la polaridad celular general era normal en todos los casos.renalcélula tubular de Camsap3dc/dc

Figura 1. Formación de quistes en túbulos contorneados proximales de Camsap3dc/dcriñones. (a) Morfología de los riñones de ratones WT (plus/plus) y mutantes de Camsap3 (Camsap3dc/dc) en P666. ( b ) Tinción H&E de riñones WT y Camsap3dc / dc en P21. Múltiples quistes formados en la corteza de los riñones Camsap3dc/dc. ( c ) Cambio del índice quístico de ratones WT y Camsap3dc / dc a lo largo del tiempo. Se examinaron 9 ratones para WT o Camsap3dc/dc. Ver MATERIALES Y MÉTODOS para la definición de índice quístico. (d) Proporción de riñón a peso corporal. Se examinaron 11 ratones para WT o Camsap3dc/dc. (e) Inmunotinción para marcadores de túbulos contorneados proximales (PCT) (Megalin), túbulos contorneados distales (DCT), cotransportador de NaCl y conductos colectores (CD) (acuaporina-2; AQP2) en WT y Camsap3dc/ corriente continuariñonesen P21. Las imágenes de la vista ampliada de Megalin muestran Megalin deslocalizado en células quísticas en riñones Camsap3dc/dc, como indica la punta de flecha. Las líneas discontinuas y continuas indican el margen apical y basal de la celda, respectivamente. (f) Inmunotinción para marcadores de los segmentos S1/S2 (SGLT2, verde) y segmento S3 (SGLT1, rojo) en riñones WT y Camsap3dc/dc en P21. Las imágenes de la vista ampliada de SGLT2 muestran una disminución de la intensidad de la señal de SGLT2 en las células quísticas de los riñones Camsap3dc/dc, como indican las puntas de flecha. ( g ) Morfología del glomérulo en P21 y P487. Las puntas de flecha indican el glomérulo dilatado. Ver también las Figuras S1 y S2.

Figura 2. Arquitectura celular desorganizada en células PCT quísticas. (a) Imágenes de microscopía electrónica de barrido ▸

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de WT y Camsap3dc/dcriñonesen P21. El túbulo renal en Camsap3dc/dcriñonesestá parcialmente hinchado. (b) Cuantificación de la altura de las células en la corteza [más / más, n=121 células; dc/dc (dilatada), n=128 celdas; dc/dc (no dilatado), n=66 celdas]. Las barras de error indican SD ***p<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">riñones. (i) Número de cilios primarios en los PCT. El número de cilios primarios se calculó utilizando la longitud de la circunferencia apical de las secciones transversales de PCT, junto con el número de cilios y núcleos primarios. [ más / más , N=340 células, 63 secciones transversales de PCT, No. de cilios primarios=268; dc/dc, N=221 células, 29 secciones transversales de PCT, No. de cilios primarios=133].

ratones (Fig. 2d). Por el contrario, aunque Megalin se acumuló en las regiones apicales de las células WT, se difundió en el citoplasma de algunas de las células Camsap3dc/dc quísticas (Fig. 1e vista ampliada y Fig. 2d). La tinción de fluorescencia para F-actina, que se acumula a alta densidad en las microvellosidades apicales, sugirió que las microvellosidades estaban ocasionalmente desordenadas en las células engordadas de mutantes.riñones(punta de flecha de la Fig. 2e), según lo confirmado por microscopía electrónica de transmisión (Fig. 2f). Ezrin, una parte del complejo ERM que se asocia con la membrana plasmática apical31, disminuyó o se perdió en las células quísticas de Camsap3dc/dcriñones(Fig. 2e), lo que sugiere que la citoarquitectura era anormal en las células mutantes. Además, mientras que el aparato de Golgi positivo para Giantin generalmente se distribuye como hebras delgadas yuxtapuestas al núcleo en las células WT, el Golgi ocasionalmente se condensó en las células Camsap3dc / dc (Fig. 2e). La microscopía electrónica de transmisión reveló defectos subcelulares adicionales en PCT dilatados de Camsap3dc/dcriñones. En las células PCT WT, las mitocondrias estaban alargadas y mostraban una orientación ordenada a lo largo del eje apico-basal de la célula, mientras que en las células PCT quísticas, las mitocondrias tendían a ser redondas y ya no mostraban ninguna orientación ordenada (Fig. 2f). En estas células, las estrías basales también estaban desorganizadas, perdiendo sus invaginaciones paralelas y profundas que son comunes en las células WT (Fig. 2f puntas de flecha y dibujo trazado), como también se muestra en la inmunotinción para Na más /K más -ATPasa (Fig. puntas de flecha 2d). Además, los núcleos se engordaron en las células quísticas, en comparación con su forma redonda en las células WT (Fig. 2f, g). Los cilios primarios se detectaron en el lado luminal de las células PCT tanto en los riñones mutantes como en los WT (Fig. 2h, i), a diferencia del caso de los ratones mutantes que son defectuosos para la ciliogénesis, lo que causa riñones poliquísticos 24-27, lo que sugiere que el deterioro de la ciliogénesis es no es la razón probable de la

observaron fenotipos poliquísticos en ratones Camsap3dc/dc. Colectivamente, estas observaciones indicaron quedisfunciónde CAMSAP3 perturba la arquitectura subcelular de las células quísticas PCT.

Los ratones Camsap3dc/dc muestran algunos defectos fisiológicos. A continuación, examinamos si los riñones de Camsap3dc/dc tenían algún defecto fisiológico. Los estudios inmunocitológicos antes mencionados mostraron que Megalin, que funciona como un receptor endocítico multiligando32,33, tendía a difundirse en el citoplasma de las células Camsap3dc/dc PCT (Fig. 1e punta de flecha y Fig. 2d), en contraste con su clara localización apical en Células PCT WT. Además, aunque el transportador de glucosa SGLT2, que es responsable del 90 por ciento de la reabsorción de glucosa29, se localiza principalmente en las regiones apicales de las células Camsap3dc/dc (como también se observa en las células WT), la intensidad de su señal disminuye en ciertas regiones de los túbulos quísticos ( Fig. 1f puntas de flecha), lo que sugiere que la fisiología de los túbulos mutantes podría haberse visto afectada negativamente. Por lo tanto, realizamos análisis de orina y sangre, utilizando ratones P396- a P424-viejos. Las pruebas de orina revelaron una tendencia a la salida excesiva de K plus , Mg2 plus y nitrógeno ureico en ratones Camsap3dc/dc (Figura complementaria S3a). Los análisis de sangre demostraron de manera más convincente que los ratones Camsap3dc/dc tenían niveles significativamente más bajos de K plus y Mg2 plus en comparación con los ratones WT o Camsap3 plus /dc, aunque no se detectaron cambios en los niveles de nitrógeno ureico y glucosa (Figura complementaria S3b) . Los niveles de creatinina en orina y sangre no difirieron entre los ratones WT y mutantes (Fig. S3c complementaria). Por lo tanto, observamos solo defectos fisiológicos parciales en ratones Cam-sap3dc/dc.

Organización de microtúbulos enrenalcélulas epiteliales de los túbulos. Como la mutación de Camsap3 conduce a la desorientación de los microtúbulos en las células epiteliales del intestino delgado10,12, examinamos si esto también ocurre enriñóncélulas epiteliales. Primero inmunoteñimos -tubulina junto con Megalina. En particular, tanto en riñones WT como Camsap3dc/dc, los túbulos Megalin-negativos, es decir, los túbulos contorneados distales o los conductos colectores, mostraron una intensidad de inmunotinción de -tubulina más fuerte que la observada para -tubulina en los PCT Megalin-positivos (Fig. 3a, b) . Como se encuentra en el intestino delgado10, CAMSAP3 se localiza apicalmente en todas las células epiteliales de WTriñones, superpuesto al extremo apical de los microtúbulos que están alineados a lo largo del eje apico-basal (Fig. 3c izquierda). Las células epiteliales de riñón Camsap3dc/dc también fueron algo inmunopositivas para CAMSAP3 pero en posiciones irregulares (Fig. 3c derecha, puntas de flecha), lo que sugiere que CAMSAP3 mutado se retiene en las células, anclado a algunas estructuras no identificadas. En las células quísticas de los riñones mutantes, la matriz de microtúbulos estaba enredada y desorganizada (Fig. 3c derecha), como se observa en las células intestinales de los ratones Camsap3dc/dc10. Sin embargo, en las células no quísticas, la organización de los microtúbulos no se vio afectada.

Figura 3. Microtúbulos en células epiteliales del túbulo renal. (a) Inmunotinción para -tubulina, Megalina y núcleos en riñones WT y Camsap3dc/dc en P21. (b) Cuantificación de la intensidad de -tubulina en PCT y DCT/CD de riñones WT (PCT, n=28 túbulos; DCT/CD, n=18 túbulos) y riñones Camsap3dc/dc (PCT, n { {8}} túbulos; DCT/ CD, n=9 túbulos). Las barras de error indican SD ***p<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

mucho incluso en ausencia de CAMSAP3 funcional, lo que puede explicar por qué estas células no mostraron anomalías citológicas. Además, las células epiteliales renales nulas de Camsap3- también mostraron defectos similares en los microtúbulos, pero solo en las células quísticas (Fig. S2d complementaria). En conjunto, estos resultados indicaron que CAMSAP3 desempeña un papel en el mantenimiento de la organización apico-basal de los microtúbulos solo para una subpoblación de células epiteliales renales.

Proliferación celular mejorada en PCT Camsap3dc/dc. La formación de quistes en los riñones está estrechamente relacionada con una mayor proliferación de células renales34. Para probar si la proliferación celular se alteró en los riñones Camsap3dc/dc, comparamos la proliferación de células PCT entre WT y riñones mutantes mediante inmunotinción conjunta para Megalin y Ki-67, un marcador de proliferación celular. Rara vez se observaron células positivas para Ki-67 en PCT de riñones WT, mientras que fueron fácilmente evidentes en células PCT de riñones Camsap3dc/dc. Sin embargo, se detectó Ki-67 tanto en túbulos dilatados como no dilatados (Fig. 4a,b), sin mostrar correlación entre la proliferación celular y la formación de quistes. martes, CAMSAP3disfunciónpromovió la proliferación celular, pero este proceso no siempre se asoció con la formación de quistes.

Cambios en la localización de YAP y miosina no muscular relacionados con la deformación celular. YAP es un activador transcripcional que regula la proliferación celular35 así como la formación celular dependiente de la tensión mecánica36. YAP se activa junto con su localización nuclear en riñones de ratones deficientes en Pkd1-, un modelo de PKD37, y la activación de Yap promueve la proliferación celular y la dilatación tubular en los riñones28. Por lo tanto, probamos si YAP también se activó en PCT de riñones Camsap3dc/dc. La inmunotinción para YAP reveló su localización citoplasmática en PCT de riñones WT. Sorprendentemente, YAP se concentró en los núcleos de los PCT Camsap3dc/dc, pero solo en sus porciones dilatadas (Fig. 5a), como lo confirmó la cuantificación (Fig. 5b), lo que sugiere que la redistribución de YAP observada ocurrió en respuesta a un cambio en la célula. morfología en lugar de CAMSAP3disfunciónper se.

YAP es un efector corriente abajo de la vía Hippo, que está regulada por señales mecánicas38. De hecho, las células quísticas en el riñón Camsap3dc/dc parecían estiradas, lo que sugiere que pueden haber estado expuestas a una mayor tensión.

Figura 4. Proliferación celular en PCT Camsap3dc/dc. (a) Inmunotinción para Ki-67, Megalin y DAPI en riñones WT y Camsap3dc/dc en P22. Las puntas de flecha indican células positivas para Ki-67 en túbulos quísticos. (b) Porcentaje de células positivas para Ki-67 dentro de las células epiteliales PCT [ más / más , n=700 células; dc/dc (dilatada), n=224 celdas; dc/dc (no dilatado), n=396 celdas]. Las barras de error indican SD *p<0.05,>

Por lo tanto, investigamos si se produjeron cambios mecánicos junto con la formación de quistes. Debido a que la activación de la miosina II no muscular es un proceso sensible a la tensión39, evaluamos la distribución de la cadena ligera de miosina 2 (MLC2), que está involucrada en la activación de la miosina II, en los riñones. Aunque MLC2 se difundió en el citoplasma en las células del túbulo WT, se concentró cerca de las porciones apicales de las células quísticas en los riñones Camsap3dc/dc (Fig. 5c punta de flecha), lo que sugiere que estas células fueron sometidas a fuerza de tracción. Las células en PCT no dilatadas no mostraron tal concentración de MCL2. Estos hallazgos estaban de acuerdo con la idea de que YAP ingresa al núcleo cuando las células se estiran mecánicamente40,41.

Cambios en la distribución PIEZO1 en PCT Camsap3dc/dc. Para evaluar más a fondo si las células quísticas están expuestas a la fuerza de estiramiento, examinamos la distribución subcelular de PIEZO1, un canal iónico mecanosensible42–45, ya que este es un marcador típico del estiramiento mecánico; La localización de PIEZO1 cambia de la membrana plasmática/citoplasma a la envoltura nuclear cuando detecta señales de estiramiento46. La inmunotinción para PIEZO1 mostró que PIEZO1 se localizó principalmente en el citoplasma de las células WT PCT, mientras que su localización se superpuso con el núcleo en las células quísticas de Camsap3dc/dc PCT (Fig. 6a). La inmunotinción para YAP y PIEZO1 en secciones secuenciales también sugirió que su localización nuclear coincidía en los PCT dilatados (Fig. S4 complementaria, puntas de flecha). Por otro lado, en PCT Camsap3dc / dc no dilatados, la distribución de PIEZO1 parecía citoplásmica (Fig. 6a). Sin embargo, las observaciones cercanas de las imágenes de inmunofluorescencia, así como la cuantificación, indicaron que su localización nuclear tendía a aumentar hasta cierto punto, en comparación con las células WT (Fig. 6a, b). Por lo tanto, a diferencia de YAP, parece que PIEZO1 comienza a activarse antes de la deformación detectable de las células en PCT Camsap3dc/dc.

Discusión

En este estudio, encontramos que la mutación CAMSAP3 o su pérdida resultó en la dilatación de las células PCT, lo que provocó que las secciones transversales de los túbulos adquirieran una apariencia quística. Ya se observó un signo de cistogénesis ya en E17.5, con un aumento gradual de la dilatación durante el envejecimiento y su eventual extensión a la cápsula de Bowman. Las células epiteliales en las regiones dilatadas se adelgazaron, exhibiendo diversos defectos citológicos, como se observó en células del intestino delgado de ratones Camsap3dc/dc10,12. También se observaron algunos defectos específicos del riñón, incluida la perturbación de la alineación de las mitocondrias y el patrón de la membrana plasmática basal. Estos cambios coincidieron con la perturbación de la disposición de los microtúbulos, lo que sugiere que las redes de microtúbulos mediadas por CAMSAP3-son responsables de la organización normal de estas estructuras subcelulares en las células PCT, como se encuentra en otros tipos de células. Por otro lado, aunque CAMSAP3 parecía expresarse en todas las células epiteliales del túbulo renal, solo se observaron fenotipos estructurales aberrantes en PCT, lo que sugiere la existencia de un mecanismo redundante para mantener las redes de microtúbulos en ausencia de CAMSAP3. Es posible que otras moléculas además de CAMSAP3, como otros CAMSAP, puedan participar en el mantenimiento de la integridad de las redes de microtúbulos en estas células. Las células PCT tenían una densidad de microtúbulos relativamente más baja que otras células tubulares. Esto probablemente facilitó la deformación celular, ya que las redes de microtúbulos que quedarían después de la pérdida de CAMSAP3 podrían haber sido insuficientes para mantener

la arquitectura celular apropiada. Incluso en las células PCT, sin embargo, parecen existir mecanismos que compensan la pérdida de CAMSAP3, ya que la dilatación de las PCT no se produce de manera uniforme.

Figura 5. Localización de YAP y miosina no muscular asociada a deformación celular. (a) Inmunotinción para YAP, Megalin y DAPI en riñones WT y Camsap3dc/dc en P22. Las señales de fluorescencia de DAPI y YAP se escanearon a lo largo de la línea dibujada en las imágenes ampliadas, y los cambios espaciales en la intensidad de la fluorescencia se muestran en azul para DAPI y en verde para YAP. Las líneas discontinuas indican el área aproximada del núcleo. Las puntas de flecha indican la posición del núcleo en células representativas. (b) Relación entre la intensidad de YAP nuclear y la intensidad de YAP citoplasmático [más/más, n=81 células; dc/dc (dilatada), n =43 celdas; dc/dc (no dilatado), n=53 celdas]. Los diagramas de caja indican los valores del primer cuartil, la mediana y el tercer cuartil. ***pags<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

Figura 6. Cambio en la distribución PIEZO1 en PCT Camsap3dc/dc. (a) Inmunotinción para PIEZO1, Megalin y DAPI en riñones WT y Camsap3dc/dc en P22. Las señales de fluorescencia de DAPI y PIEZO1 se escanearon a lo largo de la línea dibujada en las imágenes ampliadas, y los cambios espaciales en la intensidad de la fluorescencia se muestran en azul para DAPI y en verde para PIEZO1. Las líneas discontinuas indican el área aproximada del núcleo. Las puntas de flecha indican la posición del núcleo en células representativas. (b) Relación entre la intensidad del piezo1 nuclear y la intensidad del piezo1 citoplásmico [ más / más , n=66 células; dc/dc (dilatada), n =44 celdas; dc/dc (no dilatado), n=81 celdas]. Los diagramas de caja indican los valores del primer cuartil, la mediana y el tercer cuartil. ***pags<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

¿Cómo, entonces, se dilataron los PCT de manera regional, acompañados de engorde de las células epiteliales? En particular, la formación de quistes se volvió detectable en E17.5, y este momento se correlaciona con el inicio de la producción de orina primitiva en ratones47. Por lo tanto, podemos suponer que el 'flujo de orina' es un factor mecánico potencial que induce la dilatación de los túbulos renales. Es probable que las células PCT que habían perdido el citoesqueleto de microtúbulos mediado por CAMSAP3- fueran mecánicamente más susceptibles a las fuerzas externas, es decir, más deformables, en comparación con las células WT PCT. Así, las fuerzas producidas por el flujo de orina en los túbulos renales pueden provocar la dilatación de los túbulos, provocando su engorde. Tales fuerzas pueden no ser uniformes, lo que da como resultado grados variables de dilatación a lo largo de los PCT. Esta idea, huelga decirlo, no excluye otros posibles mecanismos de dilatación del PCT.

Nuestras observaciones demostraron que PIEZO1 se relocaliza del citoplasma a la región nuclear en células PCT dilatadas de riñones Camsap3dc/dc, lo que sugiere que este mecanosensor se activó en respuesta a la deformación celular, muy probablemente el "estiramiento" de las células como se informó anteriormente46. El estado estirado de las células PCT dilatadas se confirmó mediante la observación de que MLC2 aumentaba en sus regiones corticales. Nuestro análisis indicó además que PIEZO1 ya estaba activado hasta cierto punto en células PCT no dilatadas, lo que sugiere que incluso estas células estaban experimentando cambios mecánicos a pesar de su apariencia normal. Otro mecanosensor, YAP, también se activó en células PCT, pero su activación parecía ocurrir solo en células estiradas.

Entonces, ¿cómo contribuyen estos reguladores mecanosensibles a la deformación celular, así como a la proliferación celular que se promovió en ausencia de CAMSAP3? Se ha demostrado que la activación inducida por estiramiento de PIEZO1 promueve la proliferación celular en células epiteliales46, lo que sugiere que este mecanismo también funciona en células PCT de riñones Camsap3dc/dc. Esta idea es consistente con nuestra observación de que la proliferación celular mejorada y la activación parcial de PIEZO1 ocurrieron juntas, incluso en células no dilatadas de PCT Camsap3dc/dc. En cuanto a YAP, su activación se retrasó, no mostrando una correlación clara con el inicio de la potenciación de la proliferación celular. YAP es conocido no solo como un factor de crecimiento celular sino también como un regulador de la homeostasis mecánica, como se demostró previamente36,48. Por lo tanto, es posible que YAP, que se reubicó en el núcleo junto con la deformación de las células PCT, podría funcionar para regular su forma, es decir, para restaurar la forma dañada de estas células. De lo contrario, YAP podría cooperar con PIEZO1 para mejorar la proliferación de células dilatadas, ya que se sabe que YAP participa en la formación de riñones poliquísticos a través de la mejora de la proliferación celular28.

Descubrimos que los ratones Camsap3dc/dc tenían niveles significativamente más bajos de K plus y Mg2 plus en la sangre, lo que sugiere que sus riñones podrían haber sufrido algún funcionamiento anormal. Los defectos citológicos severos que observamos en las membranas plasmáticas apicales y basales de las células PCT, donde se encuentra la maquinaria de transporte activo, podrían estar relacionados con esta anomalía. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que otras porciones de los túbulos renales u otros órganos también puedan ser funcionalmente defectuosos, induciendo este fenotipo. Además, no obtuvimos ninguna evidencia de que las funciones de filtrado del glomérulo estuvieran dañadas, ya que los niveles sanguíneos de creatinina y nitrógeno ureico, que se excretan a través del glomérulo, eran normales.

La interrupción de la biogénesis del cilio primario conduce a PKD24–27. En el caso de la mutación de Camsap3, la formación de cilios primarios no pareció verse afectada. Un estudio reciente mostró que la pérdida de CAMSAP3 en las células epiteliales multiciliadas nasales afectaba la formación de los pares centrales de microtúbulos en el axonema, provocando una motilidad aberrante en los cilios móviles49. Aunque los cilios primarios en las células epiteliales no son móviles y carecen de los pares centrales de microtúbulos50, sigue sin estar claro si el cilio primario en los ratones mutantes Camsap3 aún es funcional. A pesar de esta incertidumbre, las anormalidades en los mutantes PKD y Camsap3 son bastante diferentes, ya que la formación de quistes ocurre uniformemente en todo el riñón en el primero, mientras que es un evento local en el segundo. Lo más probable es que esta diferencia se deba a los distintos antecedentes moleculares de la formación de quistes entre ellos.

En resumen, nuestro estudio revela que CAMSAP3 es importante para mantener la estructura y la función de los túbulos renales en las regiones proximales, probablemente a través de la regulación del ensamblaje de microtúbulos no centrosómicos. Sin embargo, se requerirán más estudios para comprender a fondo cómo la pérdida de este sistema de organización de microtúbulos interfiere con las funciones fisiológicas del riñón.

materiales y métodos

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes y fueron aprobados por el Centro RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas y/o el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Waseda.

Ratones. Los ratones mutantes de Camsap3 (Camsap3dc/dc) utilizados en este estudio se generaron en nuestro estudio anterior10 (número de acceso CDB0716K; http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant percent 20mice percent 20list.html). En esos ratones, se eliminó la región C-terminal de Camsap3, es decir, los exones 14–17, y previamente confirmamos que las células de ratón expresan un CAMSAP3 truncado en el extremo C no funcional (CAMSAP3-dc)10. En el presente estudio, se utilizaron ratones de generación N4 y 5 en experimentos.

Se generaron ratones knockout para Camsap3 (Camsap3–/–) (número de acceso CDB0033E), que carecen de la región de codificación de Camsap3 de 22-kb completa, con edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9-mediante electroporación de cigotos51. Brevemente, se diseñaron dos ARN guía y un oligodesoxinucleótido monocatenario (ssODN) para eliminar la región 22-kb, y se agregó un sitio EcoRI con el fin de reconocer la inserción exitosa en ratones mutantes. Para la electroporación, se introdujeron cRNA, tracrRNA, ssODN y proteína Cas9 en los cigotos C57BL/6. Después de la electroporación, los cigotos se transfirieron a ratones hembra ICR pseudopreñadas, y los ratones fundadores se seleccionaron mediante PCR y secuenciación de ADN. Se obtuvieron ratones knockout de árbol (nº 4, nº 10, nº 23), y uno de ellos (nº 23) tenía el alelo de activación EcoRI diseñado. Las secuencias de ARN guía fueron diseñadas por CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp). Las secuencias crRNA, tracrRNA y ssODN utilizadas para la edición del genoma se sintetizaron de la siguiente manera: 5′-cRNA, 5′-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3′, 3′-cRNA , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuug-3′; tracrARN, 5′-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3′; ssODN, 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCTCCACCCCCACAT-3′ . Las letras mayúsculas y minúsculas indican secuencias codificantes y auxiliares, respectivamente. La línea de ratón #23 se cruzó con C57BL/6 tres veces, y los ratones de la generación N3 se usaron en los experimentos.

Los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas o la Universidad de Waseda, y se realizaron de acuerdo con los protocolos proporcionados por esos comités. El estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE: https: //arriveguidelines.org.

Genotipado. El genotipado de los ratones se realizó mediante PCR. Para los ratones Camsap3dc/dc, usamos los cebadores descritos en Toya et al. (2016). Para los ratones Camsap3–/–, utilizamos los siguientes cebadores para detectar el alelo de tipo salvaje (WT) (P1/P2, 411 pb) o Camsap3–/– (P1/P3, 614 pb) (Fig. S2a,b complementaria) : P1, 5′- CATGTACCTACCACC ATCC-3′; P2, 5′-GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3, 5′- GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3′ . La región P1/P3 en WT no se amplificó en las condiciones de PCR utilizadas.

Histología: Preparación de cortes de tejido congelado. El tejido renal disecado se fijó en paraformaldehído al 2 por ciento (Termo Fisher)/sorbitol 0,1 M (Nacalai Tesque)/tampón PEM durante 1 hora a temperatura ambiente. La receta para PEM es: TUBOS 100 mM (Nacalai Tesque), EGTA 5 mM (Nacalai Tesque) y MgCl2 5 mM (Wako), ajustado a pH 6,9 con KOH 2 M. Después de la fijación, el tejido renal se enjuagó tres veces con PEM durante 10 min. Diez, la crioprotección se llevó a cabo con sacarosa/PEM: 15 % de sacarosa en solución de PEM durante 2 h a 4 °C, seguido de 20 % de sacarosa en solución de PEM durante la noche a 4 °C, y reemplazo con 30 % de sacarosa en solución de PEM durante ~ 2 h a 4 grado. El tejido renal se congeló en compuesto OCT en un molde de inclusión (Polysciences, Inc.) en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 grados. Las muestras congeladas se cortaron en rodajas de 5 µm de espesor con un criostato CM1850 (Leica). Las secciones en portaobjetos de vidrio se mantuvieron a -80 grados hasta la tinción.

Histología: preparación de cortes de tejido embebidos en parafina. El tejido renal disecado se fijó en solución Super Fix (Kurabo) durante 2 ha temperatura ambiente, luego se transfirió a 4 grados durante la noche. Cada muestra se expuso a tres soluciones acuosas de etanol de concentración creciente a temperatura ambiente: 30 por ciento de etanol durante 3{{20}} min dos veces, 50 por ciento de etanol durante 3{ {35}} min, y finalmente 70 por ciento de etanol durante 30 min. Cada muestra se procesó con un procesador de tejidos ASP300 (Leica). Diez, las muestras de tejido renal se incluyeron en cera de parafina (Sakura Finetek) con un EG1160 (Leica) y se almacenaron a 4 grados. Las muestras incluidas en parafina se cortaron en rodajas de 6 µm de espesor con un micrótomo rotatorio RV240 (Yamato Kohki). Las secciones sobre portaobjetos de vidrio se mantuvieron a 4 grados hasta la tinción. Tinción inmunofluorescente. Las secciones de riñón congeladas se sumergieron en Triton X-100 al 0,1 por ciento (Nacalai Tesque)/PEM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Diez, las muestras se permeabilizaron aplicando 0,2 por ciento de Triton X-100/PEM durante 10 min a temperatura ambiente. Una vez más, las muestras se sumergieron en Triton X-100/PEM al 0,1 % durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se bloquearon con albúmina sérica bovina al 3 % (BSA; Roche) / Triton X-100 al 0,1 % / PEM durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de una reacción de anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados. Los anticuerpos primarios se diluyeron en BSA al 3 %/Triton X-100 al 0,1 %/PEM. Para los anticuerpos primarios generados en ratones, se realizó un bloqueo adicional con MOM Blocking Reagent (Vector Laboratories) antes del bloqueo en 3 % de BSA/0,1 % de Triton X-100/PEM. El reactivo de bloqueo MOM se diluyó en Triton X-100 al 0,1 %/PEM y se aplicó a las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del tratamiento con MOM, las muestras se lavaron con Triton X-100 / PEM al 0,1 por ciento tres veces durante 5, 10 y 15 min a temperatura ambiente. Después de la reacción del anticuerpo primario, las muestras se lavaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con Triton X-100 al 0,1 por ciento/PEM tres veces. La reacción del anticuerpo secundario se llevó a cabo durante 2 ha temperatura ambiente en la oscuridad. Los anticuerpos secundarios se diluyeron en BSA al 3 %/Triton X-100 al 0,1 %/PEM. Después de la reacción, las muestras se lavaron con Triton X-100 / PEM al 0,1 por ciento tres veces durante 5, 10 y 15 min a temperatura ambiente y se sellaron con VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories). Anticuerpos y reactivos. El ADN se tiñó con solución DAPI (Dojindo, D523, 1:1000). La actina F se tiñó con faloidina Alexa Fluor 594 (Termo Fisher, A12381, 1:400). Los microtúbulos se tiñeron con anti- -tubulina-FITC de ratón (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-Megalina de cabra (P-20; Santa Cruz Biotechnology, sc-16478, 1:200), cotransportador anti-NaCl de conejo (MERCK, AB3533, 1:500 ), anti-aquaporina de conejo-2 (abcam, AB3274, 1:400), anti-SGLT1 de cabra (M-19; Santa Cruz Biotechnology, sc-20582, 1:200) , conejo anti-SGLT2 (Novus Biologicals, NBP1-92384, 1:200), ratón anti-ezrin (3C12; abcam, ab4069, 1:500), conejo anti-giantin (Covance, PRB-114 C, 1:700), anti-aPKC de conejo (Santa Cruz Biotechnology, sc-216, 1:400), anti-DPP IV de cabra (R&D Systems, AF954, 1:100), anti-Na de ratón más /K más -ATPasa (abcam, ab7671, 1:100), tubulina antiacetilada de ratón (Sigma Aldrich, T6793, 1:200), anti-CAMSAP3 de conejo (Tanaka et al., 2012, 1:400), ratón anti-tubulina tirosina (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), conejo anti-Ki-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), conejo anti-YAP (Cell Signaling, #4912, 1:100) ), conejo anti-miosina cadena ligera 2 (Cell Signaling, #8505, 1:100), conejo anti-piezo1 (Novus Biologicals, N BP1-78446, 1:100), anti-E-cadherina de rata (52, 1:400) y anti-merlin de conejo (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: IgG anti-cabra conjugada con Dylight 594 de burro (Jackson, 1:500), IgG anti-conejo conjugada con Alexa Fluor 488/594 de cabra (Termo Fisher, A-11034, A -11037, 1:500), IgG anti-ratón conjugada con Alexa Fluor 488/594 de cabra (Termo Fisher, A-11029, A-11032, 1:500) y Alexa Fluor de cabra IgG anti-rata conjugada con 488 (Termo Fisher, A-11006,

1:400). La especificidad de unión de los anticuerpos anti-YAP (Cell Signaling, #4912) y anti-PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446) usados ​​en el estudio fue verificada por trabajos previos46,53. Tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Se colocaron portaobjetos de vidrio con secciones de riñón en una placa de 55 grados durante 30 minutos para estirar la parafina. Luego, las muestras se sumergieron en xileno durante 15 minutos dos veces, seguido de una inmersión en una serie de 70 a 100 por ciento de etanol: 100 por ciento de etanol durante 5 minutos dos veces, 90 por ciento de etanol durante 5 minutos, 80 por ciento de etanol durante 5 minutos y 70 por ciento de etanol durante 5 minutos. etanol durante 5 min. Después de enjuagar en agua durante 20 min y en H2O destilada/desionizada (ddH2O) durante 1 min, las muestras se tiñeron en solución de hematoxilina de Mayer (Wako) durante 5 min. Las muestras se sumergieron en ddH2O dos veces, luego se enjuagaron con ddH2O durante 10 min. Las muestras se sumergieron nuevamente en ddH2O y luego se tiñeron en solución de eosina (Merck) durante 2 min. Para el lavado, las muestras se sumergieron en ddH2O durante 30 s, seguido de una inmersión en serie de 70 a 100 % de etanol y xileno: 70 % de etanol durante 5 s, 80 % de etanol durante 5 s, 90 % de etanol durante 5 s, 100 % de etanol durante 5 s dos veces y xileno durante 10 min. Finalmente, las muestras se sellaron en glicerol. Microscopía. Las imágenes se adquirieron con el microscopio de fluorescencia todo en uno BZ-X710 (Keyence) o el microscopio confocal de barrido láser LSM880 (Zeiss). Para BZ-X710, los objetivos utilizados fueron Nikon CFI Plan Apo λ 2 × , 10 × , 40 × , 100 × y Nikon CFI Plan Fluor 4 × . Las imágenes obtenidas se procesaron con el software BZ-X Analyzer. El LSM880 estaba equipado con un microscopio invertido Axio Observer Z1 con una lente de objetivo de inmersión en aceite Plan-Apochromat 63 × /1.40 NA (Zeiss). Las imágenes se procesaron y analizaron con ImageJ y Adobe Photoshop CC2019. Análisis del índice quístico. ImageJ analizó el índice quístico utilizando imágenes teñidas con H&E de la sección horizontal del riñón. Como medida del área que contiene el quiste, se trazó el perímetro de la luz tubular dilatada utilizando la función de "selecciones a mano alzada", y su área se midió mediante la función de "medida". Este trabajo se realizó para todos los quistes dentro de la sección del riñón, y las áreas de todos los quistes se sumaron para determinar el área que contenía el quiste. El área renal total se midió de la misma manera. La circunferencia exterior del riñón se trazó usando la función de "selecciones a mano alzada" y se evaluó su área. Finalmente, calculamos el índice quístico dividiendo el área que contiene el quiste por el área total del riñón.

Definición de túbulos dilatados y túbulos no dilatados. En esta investigación, los túbulos con un área del lumen mayor o igual a 500 µm2 han sido defnidos como "dilatados", mientras que aquellos con un área del lumen de<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

Microscopio de electrones. Para microscopía electrónica, se examinaron ratones macho P21. Las muestras para microscopía electrónica de barrido se prepararon de acuerdo con Takahashi-Iwanaga54 con ciertas modificaciones, como sigue. Los ratones se anestesiaron con isofurano y se perfundieron con formaldehído al 2 por ciento (p/vol) y glutaraldehído al 2,5 por ciento (vol/vol) en tampón de cacodilato 0,1 M, pH 7,4. Cada riñón se extirpó y se cortó en cubos que se sumergieron en el mismo fijador durante la noche y luego se enjuagaron con tampón de cacodilato 0, 1 M. Las muestras fijas se transfirieron a través de una solución acuosa de sulfóxido de dimetilo al 30 por ciento a sulfóxido de dimetilo al 60 por ciento y luego se fracturaron en N2 líquido. Las muestras fracturadas se enjuagaron con tampón de cacodilato 0,1 M y se colocaron en NaOH 6 N durante 1{{30}}–20 min a 60 grados. Después de la maceración en la solución de NaOH, cada muestra se enjuagó con tampón de cacodilato 0,1 M que contenía Tween 20 al 0,05 por ciento y se posfijó con OsO4 al 1 por ciento en tampón de cacodilato 0,1 M en hielo durante 2 horas. Las muestras posfijadas fueron: (1) enjuagadas con ddH2O y colocadas en tiocarbohidrazida acuosa al 1 por ciento durante 20 min a temperatura ambiente, y (2) enjuagadas con ddH2O y posfijadas nuevamente en 1 por ciento de OsO4 en tampón de cacodilato 0,1 M durante 1 h a temperatura ambiente . Después de repetir los pasos (1) y (2), las muestras se enjuagaron con ddH2O y se tiñeron con una solución de acetato de uranilo al 0,5 por ciento durante la noche a temperatura ambiente. Los bloques de tejido se enjuagaron con ddH2O y se deshidrataron a través de una serie graduada de etanol, se transfirieron a acetato de isopentilo y se secaron en el punto crítico usando CO2 líquido. Las muestras secas se recubrieron por evaporación con osmio y se examinaron con un microscopio electrónico de barrido JSM-5600LV a un voltaje de aceleración de 10 kV. Las imágenes fueron procesadas con Adobe Photoshop.

Para la microscopía electrónica de transmisión, se fijaron cubos de riñones disecados durante al menos 2 h en formaldehído al 2 por ciento (p/vol) y glutaraldehído al 2,5 por ciento (vol/vol) en tampón de cacodilato 0,1 M a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron con tampón de cacodilato 0,1 M y se posfijaron con OsO4 al 1 por ciento en tampón de cacodilato {{10}},1 M en hielo durante 2 h. Luego, las muestras se lavaron con ddH2O y se tiñeron durante la noche con acetato de uranilo acuoso al 0,5 por ciento a temperatura ambiente. Las muestras teñidas se deshidrataron con una serie graduada de etanol, se transfirieron a óxido de propileno y se incluyeron en Polybed 812 (Polysciences). Se cortaron secciones ultrafinas con un bisturí de diamante, se tiñeron dos veces con acetato de uranilo y citrato de plomo y se observaron a un voltaje de aceleración de 100 kV usando un microscopio electrónico de transmisión (JEM-1010; JEOL) equipado con una cámara con dispositivo acoplado por carga ( BioScan modelo 792; Gatan). Las imágenes fueron procesadas con Adobe Photoshop.

Análisis de orina y análisis de sangre. Para la comparación con ratones Camsap3dc/dc, se usaron ratones WT (plus/plus) y heterocigotos (plus/dc) como controles en estos ensayos. Los ratones heterocigotos no muestran signos de Camsap3disfunción10y han organizado arreglos apico-basales de microtúbulos. Los ratones tenían entre 56 y 60 semanas de edad.

Los ratones se alojaron en una jaula metabólica (TECNIPLAST). Las muestras de orina se recolectaron cada día durante cinco días consecutivos y las muestras recolectadas se almacenaron a -80 grados. Finalmente, las cinco muestras de cada ratón se mezclaron de modo que la mezcla final reflejara la condición promedio de cada ratón durante ese período.

Para la extracción de sangre, se administró a los ratones {{0}},02 ml de anestesia por gramo de peso corporal. La composición del anestésico fue Domitor (ZENOAQ) 30 µL, Midazolam (Sandoz) 80 µL, Vetorphale (Meiji Seika Pharma) 100 µL y NaCl acuoso al 0,9 % hasta 1 ml. La sangre se recogió por punción cardíaca. Para evitar la hemólisis, la jeringa se insertó y extrajo suavemente. Cada muestra de sangre se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 h para coagular. A continuación, cada muestra se centrifugó (10,000xg, 25 grados, 15 min), y el suero se recogió y almacenó a -80 grados. Todas las muestras de orina y sangre fueron analizadas por Oriental Yeast Co.