La absorción de citocinas durante la perfusión renal humana reduce la firma genética inflamatoria asociada a la función retardada del injerto

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Juan R. Fernando1,2|Sara A. Hosgood2,3|Tomás Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomás Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Unidad de Inmunidad Molecular, Departamento de Medicina de la Universidad de Cambridge, Laboratorio de Biología Molecular, Cambridge, Reino Unido

2 Unidad de Investigación sobre Donación de Órganos del Instituto Nacional de Investigación en Salud, Sangre y Trasplantes, Cambridge, Reino Unido

3 Departamento de Cirugía de la Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

El trasplante es el tratamiento óptimo para la mayoría de los pacientes con enfermedad terminalriñónenfermedadpero la escasez de órganos es un gran desafío. La máquina de perfusión normotérmica (NMP) se ha utilizado para reacondicionar órganos marginales; sin embargo, los mecanismos por los cuales la NMP podría beneficiar a los órganos no se conocen bien. Usando pares de riñones humanos obtenidos del mismo donante, comparamos el efecto de NMP con el del almacenamiento en frío en el mundo.riñóntranscriptoma. Descubrimos que el almacenamiento en frío condujo a una reducción global en la expresión génica, incluidos los genes de la vía inflamatoria y los necesarios para los procesos de generación de energía, como la fosforilación oxidativa (OXPHOS). Por el contrario, durante la NMP, hubo una marcada regulación positiva de los genes OXPHOS, pero también de una serie de genes de vías inmunitarias e inflamatorias. Usando biopsias de riñones sometidos a NMP que fueron posteriormente trasplantados, encontramos que se produjo una mayor expresión de genes inflamatorios en órganos con función de injerto retrasada prolongada (DGF). Por lo tanto, utilizamos un adsorbente de hemo (HA) para eliminar las citocinas proinflamatorias. Esta expresión génica inflamatoria atenuada aumentó los genes de la vía OXPHOS y tuvo efectos potencialmente clínicamente importantes en la reducción de la expresión de una firma génica asociada a DGF. Juntos, nuestros datos sugieren que la adsorción de mediadores proinflamatorios del perfundido representa una intervención potencial que puede mejorar la viabilidad del órgano.

PALABRAS CLAVE:investigación/práctica clínica, función retardada del injerto (DGF), donantes y donación: fallecido,riñón(aloinjerto) función/disfunción,riñónenfermedad: inmune / inflamatorio, riñón

Hierba Cistanche que mejora la función renal.

1. INTRODUCCIÓN

RiñónEl trasplante representa el tratamiento óptimo para la mayoría de los pacientes conEtapa finalriñónenfermedad, con beneficios tanto para la calidad como para la cantidad de vida.1 La escasez de órganos es un desafío importante, y se han empleado varias estrategias para aumentar la cantidad de riñones disponibles, incluido el uso de donantes fallecidos por muerte circulatoria (DCD) y donantes con criterios extendidos (ECD). ), los cuales están asociados con tasas más altas de función retardada del injerto (DGF) en comparación con el donante fallecido en muerte del tronco encefálico (DBD). . El DGF se produce debido al daño o la muerte de las células tubulares isquémicas, lo que puede estimular la activación inmunitaria innata a través del ensamblaje del inflamasoma NLRP3 que conduce a la generación de interleucina (IL)1 e IL18.4-6 De hecho, la presencia de citocinas inflamatorias en la orina ha sido utilizado como biomarcador deagudoriñónlesióny FGD.7-9

La máquina de perfusión normotérmica (NMP, por sus siglas en inglés) permite perfundir los órganos trasplantados con glóbulos rojos tibios y oxigenados, en ausencia de componentes inmunitarios circulantes, incluidos el complemento y los neutrófilos.10-14 Este proceso se ha utilizado para evaluar órganos marginales15 y para " reacondicionar" órganos para facilitar el trasplante de riñones que inicialmente se rechazaron después de una oferta a través de un servicio nacional de asignación de órganos.16 Nuestra experiencia previa con el uso de NMP proporcionó la justificación para un ensayo controlado aleatorio para evaluar su eficacia en la prevención de DGF en riñones DCD,17 pero los mecanismos por los cuales la NMP podría beneficiar a los riñones trasplantados no se comprenden completamente. Además, la cuestión de si la manipulación adicional delriñóndurante la NMP, por ejemplo mediante la eliminación de citocinas y quimiocinas proinflamatorias del perfundido, podría ofrecer beneficios adicionales en la optimización del órgano antes del trasplante no se ha abordado en los riñones humanos, pero nuestro estudio de la NMP porcina demostró resultados prometedores.18

Aquí adoptamos un enfoque imparcial para abordar estas dos preguntas mediante el análisis transcriptómico de humanos.riñónbiopsias tomadas al comienzo y al final de NMP para evaluar los cambios globales en la expresión génica. Utilizamos pares de riñones humanos de un solo donante que permitieron comparar el efecto de diferentes intervenciones en órganos con antecedentes genéticos idénticos y pudimos evaluar el impacto de esos cambios en una predicción del resultado del injerto.

Beneficio del extracto de Cistanche: prevención agudariñónlesión

2. RESULTADOS

2.1. Los riñones emparejados son genéticamente similares y un modelo útil para evaluar intervenciones

Investigamos los cambios transcripcionales asociados con la preservación de órganos y NMP en dos estudios independientes, cada uno con cinco pares de riñones, lo que hace un total de 10 pares/20 riñones humanos. De estos, dos eran de donantes DBD y ocho de DCD (Tabla S1, S2 y Figura S1). En estos estudios, tomamos biopsias corticales antes y después de la intervención (almacenamiento en frío o NMP) e investigamos el panorama transcripcional mediante secuenciación de ARN (RNA-Seq). El uso de riñones emparejados y biopsias emparejadas del mismoriñónnos permitió controlar la variación biológica y hacer retroceder este factor de confusión fuera del análisis (Figura S2A). Confirmamos queriñónlos pares comienzan con un paisaje transcripcional común (Fig. S2B) y al aplicar diferentes intervenciones a cada unoriñónen un par, podemos estudiar el efecto de una intervención independientemente de la variación biológica.

FIGURA 1 Los riñones expuestos al almacenamiento en frío muestran cambios limitados en la expresión génica en comparación con los sometidos a NMP. Se obtuvieron un par de riñones que habían sido declinados para su uso en trasplante. Unariñónse mantuvo en cámara frigorífica estática y el otro se sometió a perfusión en máquina normotérmica (NMP). Se tomaron biopsias de la corteza exterior al principio y después de 2 horas. B, diagrama de volcán que indica un cambio en la expresión génica a las 2 horas para el grupo indicado en comparación con el inicio. Los puntos rojos indican genes expresados ​​diferencialmente con un valor P ajustado<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

FIGURA 2 Correlación del transcriptoma después de NMP con la duración de la función retrasada del injerto. La expresión génica se correlacionó con la longitud de DGF en biopsias tomadas después de NMP como parte de un ensayo clínico aleatorizado. Se han trazado los niveles de expresión de los 1000 genes con la mayor correlación con el resultado. B, se realizó GSEA para la correlación de A con el conjunto de datos de características. Solo vías significativas (valor q de FDR<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP da como resultado un aumento en OXPHOS y genes de vías inflamatorias en comparación con el almacenamiento en frío

Para investigar los mecanismos potenciales por los cuales la NMP podría afectar los riñones, inicialmente tomamos cincoriñónpares (n {{0}} DCD donantes y n=1 muerte del tronco encefálico fallecido [DBD] donante, Figura S1, Tabla S1) y realizaron una biopsia cortical de tiempo 0 (0 horas) . En este punto, los riñones se asignaron al azar a almacenamiento en frío estático o NMP, como se describió anteriormente 10 (Figura 1A). Después de 2 horas, se tomó una segunda biopsia de ambos riñones y se realizó RNA-Seq. Al comparar la expresión génica entre las biopsias de 0- y 2- horas, encontramos que los riñones colocados en almacenamiento en frío estático no tuvieron cambios estadísticamente significativos en la expresión de ningún gen individual cuando se corrigieron para múltiples pruebas (Figura 1B , panel izquierdo). Por el contrario, durante el transcurso de 2 horas de NMP, 956 genes se regularon al alza y 353 genes se regularon a la baja (Figura 1B, panel derecho). A continuación, evaluamos los cambios en la expresión de grupos de genes dentro de una vía común, comparando decenas o cientos de genes en lugar de cualquier gen individual, reduciendo así aún más el efecto de la variación biológica interindividual en el análisis. Esto reveló cambios en vías funcionalmente importantes, donde la expresión de cada gen individual dentro de esa vía no se alteró con la magnitud suficiente para alcanzar significación estadística. Este análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) demostró que el almacenamiento en frío tuvo un impacto sustancial en varias vías metabólicas (Figura 1C, panel izquierdo). En particular, hubo una marcada reducción en los genes involucrados en la fosforilación oxidativa (OXPHOS), una vía clave requerida para generar ATP.19 En contraste, OXPHOS estuvo entre las vías significativamente reguladas al alza durante la NMP (Figura 1C, panel derecho), con beneficios potenciales para la viabilidad celular y la restauración de la homeostasis celular. Además, se indujeron varias vías implicadas en procesos inmunitarios o inflamatorios durante la NMP, y la "señalización de TNF a través de NFkB" demostró el mayor aumento. De acuerdo con esto, TNF, así como IL1B y las quimiocinas reclutadoras de neutrófilos CXCL8 (IL8) y CXCL2, se encontraban entre los genes más regulados al alza en biopsias de NMP de 2- horas (Figura 1D). El análisis de cadenas de los 50 principales genes regulados al alza reveló la regulación al alza de genes bioquímicamente relacionados que se agruparon en cuatro nodos principales; IL8 y quimiocinas reclutadoras de neutrófilos, genes asociados al inflamasoma, señalización de NFkB y regulación transcripcional (Figura 1E). Es de destacar que los riñones DBD y DCD fueron transcripcionalmente similares al inicio (Figura S2C), y las vías genéticas que cambiaron durante NMP fueron similares en los riñones DBD y DCD (Figura S2D). Juntos, nuestro análisis demuestra que durante la NMP, hay una mayor expresión de genes que promueven la generación de energía, con efectos potencialmente beneficiosos para el órgano, pero una inducción simultánea de genes proinflamatorios, que pueden ser perjudiciales.

Extracto de Cistanche tubulosa: mejora la función renal

2.3. Genes de vías inflamatorias en riñones NMP asociados con función de injerto retrasada prolongada

Para vincular los cambios transcripcionales que ocurren durante el almacenamiento en frío y la NMP con los resultados clínicos, realizamos RNA-Seq en biopsias tomadas de 33 riñones DCD que se habían sometido a NMP como parte de un ensayo clínico aleatorizado que actualmente evalúa su eficacia.17 Las muestras estaban disponibles en un subconjunto de riñones asignados al azar al brazo de NMP del estudio que posteriormente fue trasplantado (Tabla S3, Figura S1). El DGF es más común en los riñones DCD y se define clásicamente como un requisito para la diálisis en la primera semana posterior al trasplante. Sin embargo, en el período inmediatamente posterior al trasplante, algunos pacientes reciben un único episodio de diálisis por hiperpotasemia, lo que no necesariamente refleja la presencia de necrosis tubular aguda significativa. Por lo tanto, utilizamos un modelo que correlaciona la expresión génica con el tiempo entre la cirugía de trasplante y la última sesión de diálisis (es decir, la duración de DGF). Esto mostró cambios transcripcionales más marcados en trasplantes que requieren diálisis más allá de las primeras 24 horas posteriores al trasplante (Figura 2A), así como una correlación positiva significativa entre la expresión de genes de vías inflamatorias, incluidas las vías de "señalización de TNFA a través de NFkB" y "respuesta inflamatoria" y la longitud de DGF, con un mayor enriquecimiento de estas vías en los riñones que experimentaron DGF postrasplante más prolongado (Figura 2B). Por el contrario, la longitud de DGF se correlacionó negativamente con la magnitud de la expresión de los genes de la ruta "OXPHOS" (Figura 2B). En conjunto, estos datos indican que después de NMP, los riñones que tienen una expresión más baja de los genes de la ruta inflamatoria y una expresión más alta de los genes de la ruta "OXPHOS" son menos susceptibles a DGF prolongado después del trasplante. Esto apoyaría la conclusión de que los cambios moleculares que ocurren durante la NMP pueden tener efectos tanto beneficiosos (inducción de genes de la vía OXPHOS) como perjudiciales (inducción de genes de las vías inflamatorias).

2.4. La producción de orina y el flujo sanguíneo renal durante NMP demuestran diferentes asociaciones con OXPHOS y genes de vías inflamatorias

La cantidad de orina producida durante la NMP es uno de varios parámetros incluidos en los puntajes de evaluación de la calidad quirúrgica utilizados para guiar las decisiones sobre la utilización de órganos,15 pero si la producción alta de orina durante la NMP realmente presagia un buen pronóstico para el riñón y las vías moleculares subyacentes activadas en riñones con una diuresis alta no está claro. En un total de 10 riñones sometidos a NMP (solo riñones con NMP, Tabla S1 y S2, Figura S1), observamos un rango de diuresis de 0 a 340 ml durante el período de perfusión de 2- horas (Figura 3A panel izquierdo). Cabe destacar que cuando comparamos las vías que cambian durante NMP en cinco riñones en dos experimentos independientes, encontramos que se indujeron vías similares (Figura S3A), lo que confirma la reproducibilidad de nuestro diseño experimental y la utilidad de comparar vías en lugar de genes individuales. En las biopsias posteriores a la perfusión de 2-horas, la expresión de 11 genes se correlacionó significativamente con el volumen de orina producido durante este período. Estos incluyeron proteínas de choque térmico (HSP), HSPA1A, HSPA1B y HSPH1, que se correlacionaron positivamente con una mayor producción de orina (Figura 3A, panel derecho). El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes mostró que la producción de orina también se correlacionó positivamente con los genes de la vía "Señalización de TNF a través de NFkB" y se correlacionó negativamente con los genes OXPHOS en biopsias posteriores a la perfusión (Figura 3B, S3C). De manera similar, en biopsias previas a la perfusión, OXPHOS se correlacionó negativamente con la producción de orina en estos riñones, mientras que las vías asociadas con la activación inmunitaria, incluida la "señalización de TNF a través de NFkB" y el "rechazo del aloinjerto", se correlacionaron positivamente con la producción de orina, lo que sugiere que la NMP tuvo poco efecto en estos procesos. , o en otras vías analizadas, en riñones con alto gasto urinario (Figura 3B, S3C-D). Dado que se observó la inducción de genes de vías inflamatorias en nuestras muestras clínicas con DGF prolongado (Figura 2B), estos datos desafían el dogma de que la diuresis alta ocurre en riñones más viables y "sanos" y sugieren que, de hecho, estos riñones pueden tener más potencial inflamatorio, son menos capaces de generar energía y que ésta no se altera sustancialmente durante la NMP.

El flujo sanguíneo renal durante la perfusión también se ha evaluado como un parámetro que puede reflejar la función posterior del trasplante.15 En los 10 riñones estudiados, el flujo sanguíneo renal a las 2 horas de perfusión varió de 14,1 a 168,8 ml/minuto (Figura 3C, panel izquierdo). En las biopsias posteriores a la perfusión de 2- horas, ocho genes se correlacionaron significativamente de forma positiva con el aumento del flujo sanguíneo renal (panel derecho de la Figura 3C), incluido HSPA1L, pero no hubo una superposición directa entre esta lista de genes y los que se correlacionan con la producción de orina (Figura 3A ). El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes demostró que el flujo sanguíneo renal alto se correlacionó positivamente con los genes OXPHOS en biopsias de 0- horas, pero a diferencia de aquellas con la producción de orina más alta, la perfusión tuvo un impacto significativo, lo que resultó en una correlación negativa con "OXPHOS". genes de la vía en 2 horas (Figura 3D, Figura S4A-B). Los flujos sanguíneos renales se correlacionaron negativamente con varias vías genéticas inmunitarias e inflamatorias en biopsias de 0- y 2- horas (Figura 3D, Figura S4B), en contraste con la producción de orina (Figura 3B, Figura S3C). Juntos, estos datos sugieren que el flujo sanguíneo renal y la producción de orina pueden no ser indicadores equivalentes de un riñón más viable, pero que el primero puede identificar más fielmente un riñón.riñónmenos probabilidades de tener DGF prolongado.

beneficio y efectos secundarios de la cistanche: antiinflamatorio

2.5. La adición de un adsorbedor de hem al circuito de perfusión no tiene efecto sobre los parámetros de perfusión, pero reduce significativamente la expresión de genes inflamatorios, incluidos NLRP3 e IL1B

Análisis deriñónperfusate han demostrado un aumento sustancial en la concentración de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias durante el curso de hipotermia y NMP.20,21 Estas moléculas bioactivas recirculan en el riñón, con el potencial de inducir más inflamación. Dado que nuestro análisis de trasplantesriñónmuestras indicaron que la inducción de genes dependientes de TNF en riñones NMP se asoció con DGF (Figura 2B), planteamos la hipótesis de que la eliminación de citocinas y quimiocinas del circuito de perfusión puede atenuar la inducción de genes inflamatorios, con posibles efectos beneficiosos para el riñón. Tal enfoque ha demostrado cierta eficacia en pacientes con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica,22,23, y se asoció con un aumento del flujo sanguíneo renal en riñones porcinos sometidos a NMP.18 Para probar esto en riñones humanos, tomamos cinco pares de riñones adicionales y realizamos NMP durante 4 horas con biopsias tomadas a las 0, 2 y 4 horas (Figura S1). En cada caso, se añadió al circuito de perfusión de un riñón dentro de cada par (NMP más HA) un adsorbedor de citosol (HA) que elimina moléculas con un peso molecular de 10-50 kDa (Figura 4A). Como se anticipó, la adición de HA resultó en concentraciones más bajas de una variedad de citocinas en el perfundido (Figura 4B), pero no tuvo efecto sobre el flujo sanguíneo renal, la producción o composición de orina, el consumo de oxígeno y la homeostasis ácido-base (Figura 4C, Tabla S4, S5). Por lo tanto, durante 4 horas de NMP, la HA no tuvo impacto en los parámetros de perfusión actualmente utilizados clínicamente para generar puntajes de evaluación de calidad, pero tuvo un efecto sustancial en la expresión génica; Después de NMP, los genes 1794 y 4026 aumentaron a las 2 y 4 horas, respectivamente, incluidos TNF e IL6 (Figura 4D, E). pero solo la mitad de este número (n=898 y n=2606) se incrementaron cuando el HA estaba presente (Figura 4D, Figura S5A y B). El número de genes regulados a la baja también se redujo mediante la adición de HA (Figura 4D). Después de 4 horas de NMP, 46 genes se regularon significativamente y 181 se regularon a la baja con la adición de HA (Figura 4F). Esta respuesta transcripcional atenuada incluyó genes asociados a la activación del inflamasoma NLRP3, como IL1B, NLRP3 y CASP1 (Figura 4G, Figura S4B) y algunas quimiocinas reclutadoras de neutrófilos (Figura S5C), previamente asociadas con lesión renal en modelos animales.24,25 Esto demuestra que los mediadores solubles liberados delriñónrecirculan e impulsan la expresión de novo de genes inflamatorios dentro del órgano, pero que esto puede aliviarse mediante su eliminación del circuito de perfusión.

FIGURA 4 La adición de un adsorbente de hem al circuito de perfusión de la máquina normotérmica tiene efectos sustanciales en el nivel de citoquinas en el perfundido y el transcriptoma, pero no en los parámetros físicos registrados en la plataforma. Se tomaron un par de riñones humanos del mismo donante, uno de los dos se sometió al protocolo estándar de perfusión normotérmica (NMP) durante 4 horas y el otroriñónse sometió a NMP con la adición de un adsorbente de dobladillo al circuito. Se tomaron muestras para RNA-Seq antes de la perfusión (0 horas), después de 2 horas y al final (4 horas). B, Concentración de citocinas clave en el perfundido después de 4 horas de NMP. La línea indica pares de riñones. Las mediciones de citoquinas se normalizaron al contenido total de proteína perfundida. El valor P indicado es de una prueba t pareada para la reducción de citoquinas con la adición de HA. C, Producción de orina y flujo sanguíneo renal (RBF) a lo largo del tiempo de perfusión. La línea verde indica NMP solo y el naranja con la adición de adsorbente de hem. D, Diagrama de Venn que muestra el número de genes expresados ​​de forma significativamente diferencial al comparar las muestras de 2-hr o 4-hr con las muestras previas a (0-hr). Los diagramas rojos son genes regulados al alza y los azules regulados a la baja. La intersección son los genes que se expresan deferentemente en ambos puntos de tiempo en la misma dirección. E, valores de expresión normalizados log2 para los genes indicados a través de la perfusión del transcriptoma tisular, se indican las barras de error estándar. F, Gráfico de volcán para la comparación por pares de NMP solo con NMP más HA a las 4 horas. El rojo indica genes expresados ​​​​diferencialmente con un valor P ajustado<0.05. g,="" as="" for="">

tratar enfermedades renales extracto de cistanche

2.6. HA asociada con una reducción en una firma genética asociada a la función retrasada del injerto

El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes mostró una disminución significativa en la vía de "señalización de TNF a través de NFkB" en NMP más riñones HA en comparación con NMP solo (Figura 5A-B). En particular, la presencia de HA no solo redujo la expresión del gen inflamatorio dentro delriñónpero también aumentó las vías de metabolismo de OXPHOS y ácidos grasos, los cuales contribuyen a la generación de energía (Figura 5A-B). Por lo tanto, los cambios en las vías de expresión génica que ocurren con la HA respaldarían la conclusión de que sus efectos son clínicamente beneficiosos, ya que redujo la "señalización de TNFA a través de los genes de la vía NFkB" y aumentó los genes de la vía "OXPHOS", los cuales se asociaron con una duración más corta. duración de DGF (Figura 2B).

Para explorar más a fondo la relación entre los cambios transcripcionales en NMP y los resultados clínicos, buscamos curar una firma genética presente en riñones con DGF. Identificamos los 100 principales genes regulados positivamente (ARRIBA) y negativamente (ABAJO) (clasificados por cambio logarítmico) que se correlacionaron con la longitud de DGF en las 33 muestras de ensayos clínicos (Figura 5C, Datos S1). Encontramos un enriquecimiento significativo de la firma del gen asociado con una mayor longitud de DGF en muestras con mayor producción de orina (Figura 5D), lo que sugiere que la alta producción de orina durante NMP identifica los riñones en riesgo de DGF más prolongado. No hubo una correlación estadísticamente significativa entre la firma DGF y los genes asociados con un mayor flujo sanguíneo renal (Figura 5E). A continuación, evaluamos si y cómo la adición de HA al circuito NMP afectó la expresión de las firmas de genes "UP" y "DOWN" de DGF. Sorprendentemente, esto mostró que la expresión de la firma génica asociada con una mayor longitud de DGF se redujo significativamente con la adición de HA, y la firma asociada con una menor longitud de DGF aumentó significativamente con la adición de HA (Figura 5F).

En general, los cambios transcripcionales que hemos identificado sugieren que NMP tiene beneficios potenciales sobre el almacenamiento en frío en términos de sus efectos sobre la generación de energía en el riñón. Sin embargo, durante la perfusión, algunas moléculas bioactivas se liberan desde el riñón hacia el circuito de perfusión, generando un bucle de amplificación que provoca inflamación cuando vuelven a entrar en el riñón. La eliminación de estas moléculas interrumpe este ciclo y puede ser útil para reducir la inflamación y aumentar la generación de energía, mejorando aún más los efectos beneficiosos de la NMP y reduciendo la susceptibilidad a DGF (Figura 6).

FIGURA 5 La adición del adsorbente de jamón reduce la firma del gen asociado con DGF. Un análisis GSEA del efecto de la adición de HA al transcriptoma después de 4 horas de NMP contra la ruta de características de conjuntos de genes. Solo se trazan rutas significativas. Los puntos rojos indican enriquecimiento positivo y azul negativo, el tamaño del punto está inversamente correlacionado con el valor FDR q y la posición indica la puntuación de enriquecimiento normalizado (NES). B, Gráficos de enriquecimiento de GSEA para vías clave de la base de datos Hallmark para la comparación de A. La línea indica la puntuación de enriquecimiento en ejecución y el gráfico de violín indica la distribución de los genes miembros del conjunto de genes a lo largo de la lista de genes clasificada utilizada en cada análisis. C, Mapa de calor de las cuatro principales correlaciones positivas (ARRIBA) y negativas (ABAJO) con la longitud de DGF y utilizado como parte de la firma de expresión génica para DGF. Firma completa de DGF proporcionada en datos complementarios. DF, la firma del gen asociado con DGF se usó con GSEA para investigar la expresión de la firma en la correlación de 2-h de producción de orina con 2-h transcriptoma (D), correlación de 2-h RBF con 2-h transcriptoma (E), y el efecto de la adición de HA en el transcriptoma a las 4 horas (F). Parcelas como para A

FIGURA 6 Resumen gráfico. A, Durante el almacenamiento en frío, hay una reducción global en la transcripción. Durante la NMP, la expresión de genes en una serie de vías aumenta, incluida la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y los genes de vías inflamatorias como TNF, IL8 y NFkB. B panel izquierdo, durante la NMP, los mediadores inflamatorios (círculos amarillos) se liberan delriñónen la solución de perfusión. Recirculan y estimulan la transcripción de genes proinflamatorios en el riñón y están asociados con una reducción en los genes de producción de vías de energía, lo que reduce el ATP. Panel derecho, la presencia del adsorbente de hem (HA) rompe este bucle de amplificación inflamatoria

Hierba Cistanche que mejora la función renal.

3. DISCUSIÓN

Nuestros datos muestran que el almacenamiento en frío es efectivo para limitar cambios sustanciales en la expresión génica. Esto está de acuerdo con los modelos de roedores, donde los riñones almacenados hasta 18 horas en almacenamiento en frío mostraron pocos cambios en la expresión de citoquinas proinflamatorias, incluidas IL1, TNF e IL6.26 Nuestro uso de perfiles transcripcionales globales e imparciales en lugar de la medición de un pequeño número de genes candidatos nos permitió analizar la expresión de grupos de genes que se encuentran dentro de vías específicas. Esto reveló una reducción significativa en la expresión de OXPHOS y genes de la vía de la glucólisis en riñones almacenados en frío, lo que podría reducir la capacidad de estos riñones para generar ATP, en línea con un estudio anterior que mostró ATP reducido en riñones humanos almacenados en frío.27 Un número de vías proinflamatorias también se redujeron durante el almacenamiento en frío, incluida la activación de TNF a través de NFkB y vías de especies reactivas de oxígeno que pueden ser potencialmente beneficiosas. Sin embargo, puede ser que el almacenamiento en frío simplemente detenga temporalmente estas vías y que, después de la reperfusión en el receptor, se produzcan cambios similares en la expresión del gen inflamatorio que se observan en la NMP.

NMP tuvo el efecto opuesto al almacenamiento en frío en OXPHOS y los genes de la vía de la glucólisis, aumentando su expresión, con el potencial de aumentar la capacidad celular para generar ATP y restaurar la homeostasis. Cabe destacar que también se ha demostrado que la perfusión oxigenada hipotérmica de los riñones humanos aumenta los niveles de ATP en comparación con el almacenamiento en frío 27, por lo que la restauración de la oxigenación puede ser el principal estímulo para estos procesos en lugar de la normotermia. No obstante, es probable que estos cambios sean beneficiosos para el órgano dada nuestra observación de una correlación negativa entre el aumento de la expresión de los genes de la vía OXPHOS y el DGF prolongado.

Un artículo reciente de Hameed et al28 también realizó un análisis transcriptómico de NMP en tres riñones sometidos a NMP. Lamentablemente, los autores no pusieron sus datos a disposición del público, por lo que no es posible realizar una comparación en profundidad con nuestro conjunto de datos. Sin embargo, su manuscrito indicó la inducción de genes relacionados con la respuesta inmunitaria durante la NMP, incluidos IL1B, CXCL2 y TNF, lo que concuerda con nuestros hallazgos.

En nuestro análisis de riñones sometidos a NMP en el contexto de un ensayo clínico, correlacionamos las firmas de expresión génica con una duración de DGF en lugar de una incidencia de DGF (definida como una necesidad de diálisis dentro de la primera semana posterior al trasplante). En particular, los riñones con una duración de DGF de 1 día o menos fueron transcripcionalmente muy similares a aquellos sin DGF, lo que probablemente refleja el requisito de diálisis debido a la hiperpotasemia asociada al perioperatorio en lugar de DGF de buena fe. Descubrimos que un DGF más largo se asoció con una mayor expresión de la señalización de TNFA a través de los genes de la vía NFkB y una menor expresión de genes asociados con OXPHOS. Estos datos sugieren que los riñones con OXPHOS aumentado y señalización inmunitaria disminuida pueden presentar un mejor potencial como riñones de donantes, pero esta conclusión requiere validación en un estudio prospectivo más amplio.

También evaluamos los procesos moleculares que se correlacionan con la diuresis y la sangre renal durante la NMP. Estos parámetros se han utilizado previamente, junto con otras medidas, para generar una puntuación de evaluación de la calidad de los riñones perfundidos. Se ha considerado que valores altos de diuresis y flujo sanguíneo renal reflejan un injerto más viable.15 Nuestros datos revelan que las vías que se correlacionan con una diuresis alta y un flujo sanguíneo renal alto difieren y, de hecho, estos parámetros demuestran asociaciones opuestas polares con vías inflamatorias. . La diuresis alta se asoció con una mayor expresión de los genes de las vías inmunitarias, mientras que el flujo sanguíneo renal alto se correlacionó negativamente con estas vías. También encontramos que la firma del gen DGF que generamos estaba enriquecida en riñones con una alta producción de orina durante NMP, lo que sugiere que este parámetro puede identificar riñones en riesgo de un DGF más largo, en contraste con el dogma actual. Una posible explicación es que una producción de orina muy alta refleja riñones con más daño tubular que carecen de la capacidad de concentrar la orina. Por lo tanto, puede haber un "efecto Ricitos de oro" con respecto a la diuresis, donde los riñones con diuresis baja/poca son los que tienen anomalías sustanciales en la generación de filtrado, los que tienen una diuresis muy alta tienen un daño tubular sustancial que impide la concentración de orina. Esta hipótesis habría que probarla en un mayor número de riñones que se trasplantaron posteriormente.

Durante 4 horas de NMP, hubo una inducción de genes inflamatorios en el riñón. Sin embargo, vale la pena señalar que la práctica clínica actual implica solo 1 hora de NMP y este efecto puede no ser evidente en un tiempo de perfusión más corto. Sin embargo, una perfusión más prolongada puede tener beneficios en términos de restauración de la oxigenación y generación de energía, y en nuestro experimento, los efectos negativos de la inducción de genes inmunes podrían anularse sustancialmente mediante la introducción de un citosol HA en el circuito de perfusión. Estos datos indican que los mediadores inflamatorios generados por el riñón durante el curso de la NMP ingresan al circuito de perfusión y son capaces de exacerbar la inflamación estéril y que su eliminación mejora la inducción de los genes de la ruta de la inflamación observados durante la NMP. Es importante destacar que demostramos que la adición de HA afecta la expresión de genes que están asociados con peores resultados clínicos. Nuestra firma del gen DGF se derivó de muestras que se sometieron a NMP como parte de un ensayo clínico que evaluó su eficacia, lo que nos permitió vincular de manera sólida los cambios que observamos en nuestros estudios de riñones emparejados con criterios de valoración clínicos en riñones sometidos a trasplantes. Sin embargo, será necesaria su aplicación en el contexto de un ensayo clínico para probar definitivamente la utilidad de su aplicación en el pretrasplante renal. El HA es inespecífico y puede eliminar moléculas que son útiles, además de las que son perjudiciales para el órgano. Descubrimos que el efecto neto de la HA en el transcriptoma renal parecía beneficioso, pero puede ser que un refinamiento para eliminar específicamente los mediadores nocivos comprobados pueda ser aún más efectivo.

Los pares de riñones que usamos eran del mismo individuo y, por lo tanto, eran genéticamente idénticos y habían experimentado un entorno similar a lo largo de la vida del donante. Confirmamos que su tiempo 0 transcriptoma era extremadamente similar (Figura S2 A, B). Sin embargo, estas biopsias toman muestras de una pequeña parte del riñón, y los pares de riñones pueden verse afectados asimétricamente por patologías, por ejemplo, quistes o enfermedad de vasos pequeños. Una advertencia adicional es que todos los riñones utilizados en los experimentos de intervención presentados aquí fueron rechazados para trasplante y algunos representan órganos trasplantados en el extremo inferior del espectro de calidad. Sin embargo, observamos resultados altamente reproducibles al comparar las vías de los genes en grupos de cinco riñones. También pudimos demostrar que los riñones de DCD y DBD tenían una respuesta similar a la perfusión. Al combinar esto con nuestra firma DGF post-NMP seleccionada, pudimos predecir los beneficios clínicos potenciales. Este enfoque experimental podría emplearse como una herramienta preclínica para evaluar futuras intervenciones en busca de una posible eficacia terapéutica para permitir la selección racional de intervenciones candidatas para ensayos clínicos.

En resumen, nuestro estudio proporciona el primer perfil transcripcional global de riñones humanos sometidos a NMP, resolviendo las diferentes vías moleculares que se activan en NMP en comparación con el almacenamiento en frío, y mostrando que los efectos nocivos de las moléculas bioactivas producidas o liberadas por el riñón durante NMP pueden ser revertido por la adición de un HA. Además, esta intervención redujo la expresión de genes asociados con DGF prolongado, lo que proporciona una sólida justificación mecánica para aplicar dicha intervención a un ensayo clínico futuro. Nuestros datos también tienen implicaciones para las estrategias de perfusión más allá del riñón, incluido el trasplante de hígado y pulmón, lo que sugiere que la eliminación de moléculas bioactivas de los perfundidos debe investigarse en estos contextos donde la NMP se usa cada vez más. Finalmente, nuestro estudio destaca la utilidad del perfil transcripcional global en paresriñonespara evaluar intervenciones novedosas en órganos perfundidos; Los cambios transcripcionales preceden a los cambios en la abundancia de proteínas (tradicionalmente utilizadas como biomarcadores deriñónlesión) y se pueden medir fácilmente decenas de miles de transcripciones de genes. Por lo tanto, la medición del ARN tiene el potencial de proporcionar una lectura temprana y sensible de la función celular de los órganos humanos recuperados para trasplante que se puede aplicar a estudios futuros.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Los autores agradecen a todos los donantes de órganos y sus familias. El Laboratorio Clatworthy agradece las instalaciones centrales proporcionadas por el Laboratorio de Biología Molecular de MRC. Este trabajo se realizó con recursos proporcionados por Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3) operado por University of Cambridge Research Computing Service, proporcionado por Dell EMC e Intel con fondos Tier-2 de Engineering and Physical Sciences Research Consejo (subvención de capital EP/P020259/1) y financiamiento de DiRAC del Consejo de Instalaciones de Ciencia y Tecnología (www. Dirac. ac. Reino Unido).

DIVULGACIÓN

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses para divulgar según lo descrito por el American Journal of Transplantation.

CONTRIBUCIONES DE AUTOR

JRF, SH, MLN y MRC diseñaron el estudio e interpretaron los datos. JRF, SH, TM, CJW, AF y TCD realizaron los experimentos. JRF, SH y MRC crearon figuras y tablas. MRC escribió el manuscrito principal. JRF y SH crearon los métodos y las leyendas de las figuras, JRF, SH y MLN editaron el manuscrito.

Beneficio de Cistanche: mejora la función renal

Referencias:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. UK Renal Registry 19th Annual Report: Capítulo 5 Supervivencia y causas de muerte en pacientes adultos del Reino Unido con terapia de reemplazo renal en 2015: análisis nacionales y específicos del centro. Nefrona. 2017;137(1):117–150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J, et al. Análisis de los factores que afectan el resultado después del trasplante de riñones donados después de una muerte cardíaca en el Reino Unido: un estudio de cohortes. Lanceta. 2010;376(9749):1303–1311.
3. Summers DM, Johnson RJ, Hudson A, Collett D, Watson CJ, Bradley JA. Efecto de la edad del donante y el tiempo de almacenamiento en frío en el resultado de los receptores de riñones donados después de la muerte circulatoria en el Reino Unido: un estudio de cohortes. Lanceta. 2013;381(9868):727–734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Células inflamatorias en insuficiencia renal aguda isquémica.RiñónEn t. 2004;66(2):486–491.
5. Kono H., Rock KL. Cómo las células moribundas alertan al sistema inmunitario del peligro. Nat Rev Inmunol. 2008;8(4):279–289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Inmunoterapia para agudosriñónlesión. Inmunoterapia. 2012;4(3):1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H, et al. Los biomarcadores posoperatorios predicen lariñónlesiones y malos resultados después de la cirugía cardíaca en adultos. J Am Soc Nephrol. 2011;22(9):1748–1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG, et al. IL-18 y NGAL urinario predicen diálisis y recuperación del injerto despuésriñóntrasplante. J Am Soc Nephrol. 2010;21(1):189–197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowinska I, Durlik M. Biomarcadores de la función retardada del injerto como una forma deriñónlesión enriñóntrasplante. Sci Rep. 2015;5:11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Primero en trasplante renal humano después de perfusión normotérmica ex vivo. Trasplante. 2011;92(7):735–738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Perfusión normotérmica ex vivo en trasplante renal: pasado, presente y futuro. Curr Opin Trasplante de Órganos. 2016;21(3):301–307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A, et al. Un estudio observacional de perfusión pulmonar ex vivo de donante en trasplante de pulmón en el Reino Unido: DEVELOP-UK. Evaluación de Tecnologías de la Salud. 2016;20(85):1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M, et al. Obtención de pulmón de donante estándar con perfusión pulmonar normotérmica ex vivo: un ensayo clínico aleatorizado prospectivo. J Corazón Pulmón Trasplante. 2017;36(7):744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H, et al. Un ensayo aleatorizado de preservación normotérmica en el trasplante de hígado. Naturaleza. 2018;557(7703):50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH, et al. Uso de perfusión normotérmica ex vivo para la evaluación de la calidad de páncreas de donantes humanos descartados. Soy J Trasplante. 2015;15(9):2475–2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Trasplante exitoso de riñones humanos considerados no trasplantables pero resucitados por perfusión de máquina normotérmica ex vivo. Soy J Trasplante. 2016;16(11):3282–3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Protocolo de un ensayo aleatorizado, controlado y abierto de perfusión normotérmica ex vivo versus almacenamiento en frío estático en donación después de un trasplante renal por muerte circulatoria. Abierto BMJ. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. La hemoadsorción reduce la respuesta inflamatoria y mejora el flujo sanguíneo durante la perfusión renal ex vivo en un modelo experimental. J Transl Med. 2017;15(1):216.
19. Krebs HA. La historia del ciclo del ácido tricarboxílico. Perspect Biol Med. 1970;14(1):154–170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. El valor de la concentración de biomarcadores de perfusión en máquina en DCDriñóntrasplantes Trasplante. 2013;95(4):603–610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS, et al. Proteínas en líquido de conservación como predictores de la función retardada del injerto en riñones de donantes después de la muerte circulatoria. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(5):817–824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Hemoadsorción por CytoSorb en pacientes sépticos: una serie de casos. Cuidado crítico. 2017;21(1):74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Efecto de la eliminación extracorpórea de citocinas sobre la función de barrera vascular en un paciente con shock séptico. J Cuidados Intensivos. 2017;5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL, et al. La IL-17 producida por los neutrófilos regula la migración de neutrófilos mediada por IFN-gamma en ratonesriñónlesión por isquemia-reperfusión. J Clin Invest. 2010;120(1):331–342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K, et al. Efecto beneficioso del inhibidor de la elastasa de neutrófilos en la lesión renal por isquemia-reperfusión caliente en la rata. Proceso de trasplante 2006;38(7):2201–2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP, et al. Una comparación de perfiles de expresión de genes inflamatorios, citoprotectores y de lesiones en riñones de donantes con muerte cerebral y muerte cardíaca. Trasplante. 2014;98(1):15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F, et al. Estrategias para restaurar el nivel de trifosfato de adenosina (ATP) después de más de 20 horas de tiempo de isquemia fría en humanos marginalesRiñónInjertos. Ana Trasplante. 2018; 23: 34–44.
28. Hameed AM, Lu DB, Patrick E, et al. La perfusión breve con máquina normotérmica rejuvenece los riñones humanos descartados. Trasplante Directo. 2019;5(11):e502.