El conjugado dendrímero-tesaglitazar induce un cambio fenotípico de la microglía y mejora la fagocitosis de -amiloide† Parte 2

Ensayos biológicos in vitro.

Cultivo celular. La línea celular microglial murina BV2 se obtuvo de las instalaciones de cultivo celular del Hospital Infantil de Michigan.

En los últimos años, los científicos han descubierto que el cultivo celular está estrechamente relacionado con la memoria humana. Los estudios han demostrado que mediante el estudio del cultivo celular se pueden descubrir los mecanismos moleculares de la memoria y el proceso de aprendizaje, mejorando así la capacidad cognitiva y la memoria humana.

El cultivo celular se refiere al proceso de colocar células biológicas en un medio de cultivo que contiene nutrientes esenciales para crecer y reproducirse en condiciones in vitro. Las células son las unidades básicas de la vida y el cultivo celular proporciona a los científicos una plataforma para estudiar el comportamiento celular y las actividades vitales. Mediante el estudio de las células, los científicos han descubierto mucha información sobre el crecimiento de las neuronas y las conexiones sinápticas. Estos hallazgos no sólo pueden ayudar a los humanos a comprender mejor cómo funciona el cerebro, sino también a desarrollar nuevos tratamientos y fármacos.

Las investigaciones de los últimos años han demostrado que el cultivo celular también está estrechamente relacionado con la memoria humana. Los científicos han descubierto que la formación y el mantenimiento de la memoria humana requieren mucha regulación molecular y entrega de señales. Estos mecanismos de regulación y entrega de señales tienen muchas similitudes con los mecanismos del cultivo celular. Al estudiar los mecanismos de regulación y entrega de señales en cultivos celulares, los científicos pueden comprender mejor la memoria humana y los mecanismos de aprendizaje.

Además, algunos estudios también han demostrado que el cultivo celular puede mejorar la memoria humana y la capacidad de aprendizaje de determinadas maneras. Por ejemplo, utilizando un método llamado "estimulación eléctrica", se puede estimular la actividad de las células y la conexión entre las neuronas, mejorando así la capacidad cognitiva humana y los efectos del aprendizaje. Aunque este método aún se encuentra en la etapa de investigación de laboratorio, se espera que en el futuro se convierta en un nuevo método de entrenamiento cognitivo.

En resumen, existe una estrecha conexión entre el cultivo celular y la memoria humana. A través del estudio de las células, podemos comprender mejor el mecanismo cognitivo y el mecanismo de la memoria humanos y también ayudar a desarrollar nuevos métodos de tratamiento y métodos de entrenamiento cognitivo. ¡Esperamos con ansias la contribución de la tecnología de cultivo celular a la humanidad en el futuro! Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche tiene efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antienvejecimiento, que pueden ayudar a reducir la oxidación y las reacciones inflamatorias en el cerebro, protegiendo así la salud del sistema nervioso. Además, Cistanche también puede promover el crecimiento y la reparación de las células nerviosas, mejorando así la conectividad y la función de las redes neuronales. Estos efectos pueden ayudar a mejorar la memoria, la capacidad de aprendizaje y la velocidad del pensamiento, y también pueden prevenir la aparición de disfunciones cognitivas y enfermedades neurodegenerativas.

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Las células BV2 se cultivaron en medio EaglesMedium modificado de Dulbecco (DMEM) con 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor (HI FBS) y 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37 grados y 5 % de CO2.

Una vez que las células alcanzaron la confluencia en el matraz de cultivo, se pasaron a un nuevo matraz utilizando tripsina al 05 % y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Para los experimentos, se sembraron células BV2 en DMEM con 5% de HIFBS y 1% de P/S. 24 a 48 horas después, las células se estimularon con 100 ng ml-1 (300 EU ml-1) de LPS durante 3 horas para permitir que las células ingresaran en un fenotipo proinflamatorio (M1) para simular el entorno neuroinflamatorio presente en muchas enfermedades neurológicas.

Luego, las células se trataron conjuntamente con LPS y Tesa o D-Tesa libre en concentraciones variables durante 48 minutos y luego se recogieron el sobrenadante y las células para su procesamiento. Las células nunca tratadas con LPS (sin LPS) y las células tratadas solo con LPS en todo momento (solo LPS) sirvieron como grupos de control. Las soluciones madre libres de Tesa y D-Tesa se esterilizaron utilizando filtros de poli(étersulfonas) 0.2 µm.

D-Tesa era soluble en los medios celulares. Tesa se solubilizó utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final inferior al 0.1% (v/v). Citotoxicidad, ensayo de óxido nítrico y TNF-ELISA. Para el ensayo de citotoxicidad, las células se trataron como se describe anteriormente en una placa de pocillos y luego se evaluó la citotoxicidad de Tesa y D-Tesa libres mediante un ensayo MTT siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para el ensayo de óxido nítrico, las células se trataron como se describe anteriormente en 12-placas de pocillos y luego se recogieron los sobrenadantes de las células tratadas e inmediatamente se cuantificaron los niveles de óxido nítrico siguiendo el protocolo del fabricante para el reactivo de Griess.

Para el TNF-ELISA, las células se trataron como se describe anteriormente en placas 12-pocillos y luego los sobrenadantes de las células tratadas se recogieron y almacenaron a -80 grados hasta que estuvieran listos para su posterior procesamiento.

Luego las muestras se descongelaron en hielo y se realizó el TNF-ELISA siguiendo el protocolo del fabricante. Para estos estudios, tanto D-Tesa como Tesa libre se sonicaron y se agitaron con vórtex hasta que ambos fueron completamente solubles. Para solubilizar Tesa libre, primero se solubilizó en DMSO antes de diluirlo, donde la concentración final de DMSO estuvo por debajo del 0.1% (v/v) para todas las muestras de Tesa libre.

Dado que D-Tesa era soluble en medios de cultivo celular, no se añadió DMSO a esas muestras. Para todos los estudios in vitro, se aplicó una cantidad equivalente de fármaco libre o conjugado a las células de los grupos Tesa libre y D-Tesa.

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Las células se trataron como se describe anteriormente en placas de 12-pocillos y, después de recolectar el sobrenadante, las células se recogieron en el reactivo Invitrogen™ TRIzol™ (de Fisher Scientific) y se extrajo el ARN siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración y la pureza del ARN resultante se analizaron utilizando Nanodrop.

Se convirtieron cantidades equivalentes de ARN de cada muestra en ADNc siguiendo el protocolo del fabricante para el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (de Applied Biosystems de Thermo Fisher Scientific).

El ADNc resultante se utilizó para el análisis qRT-PCR utilizando el reactivo verde FAST-SYBR y siguiendo el protocolo del fabricante. Los valores de Ct se calcularon con la máquina y los datos se analizaron utilizando el método 2-ΔΔCt.

Para cada marcador diferente, el valor de ΔΔCt se calculó restando el ΔCt para el grupo sin LPS del ΔCt para cada muestra. El valor de ΔCt fue el valor de Ct para el gen de interés menos el Ct para GAPDH para cada muestra dada.

Una vez que se calculó el 2−ΔΔCt para todos los grupos, se normalizaron todos al grupo sin LPS, dando así al grupo sin LPS un nivel de expresión relativo de 1.0 para todos los marcadores. Las secuencias de cebadores hacia adelante y hacia atrás utilizadas para qRT -PCR se muestran en la siguiente tabla. Todas las secuencias se escriben desde 5′→3′.

Además, se adquirieron cebadores disponibles comercialmente de BIORAD para iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670), TGF- 1 (qmmuCID0017320), IL-10 (qmmuCID0015452), SOCS1 (qmmuced0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmuced0021296), CCL1(qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD86(qmmucid0006086), STAT6 (qmmucid000 6404) y PPAR (qmmucid0018821). Ensayo de fagocitosis.

El impacto de Tesa y D-Tesa libres en la fagocitosis del -amiloide se determinó utilizando un método previamente informado.47 Brevemente, la harina HiLyte™ 488-marcada con -amiloide 1–42 (de Anaspec Inc.) se disolvió en DMSO (concentración final de DMSO). bajo 0.5% (v/v)) y se diluyó a 5 µg ml-1 en PBS.

Después de tratar las células con Tesa y D-Tesa con el esquema de tratamiento descrito anteriormente, se aplicó la solución de amiloide a las células durante 2 horas. Luego, las células se lavaron tres veces con solución salina equilibrada de Hank con cationes divalentes (calcio y magnesio), se retiraron de los pocillos usando tripsina y se resuspendieron en tampón FACS (de Invitrogen).

Las muestras se almacenaron en hielo e inmediatamente se procesaron en una máquina de citometría de flujo Sony Cell Sorter SH800 y los datos se analizaron con el software asociado.

La puerta se estableció utilizando células no tratadas con amiloide fluorescente y los resultados mostrados son el porcentaje de células de cada grupo que exhibieron fluorescencia por encima de la fluorescencia de fondo.

También se informó la intensidad fluorescente media (MFA) del amiloide marcado con HiLyte™ 488-para cada grupo. Este ensayo se realizó por duplicado. Estadística. Todos los datos mostrados son el resultado de tres experimentos separados, cada uno realizado por triplicado a menos que se indique lo contrario. Se utilizaron GraphPad Prism 5 y Microsoft Excel para realizar estadísticas.

Se realizaron pruebas t de Student pareadas de dos colas, con corrección de Bonferroni. Se utilizó la prueba de Grubbs para determinar los valores atípicos. Se utilizó GraphPad Prism 5 para Windows para trazar datos (San Diego, CA). Los datos mostrados son el promedio + SEM.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de D-Tesa.

Para permitir la administración intracelular dirigida a las células microgliales activadas en el cerebro, Tesa se conjugó covalentemente en la superficie de G4-PAMAM-OH con enlaces éster escindibles entre el fármaco y el conector dendrímero (Fig. 1).

En el primer paso, se hizo reaccionar Tesa (1) con azida de tetrametilenglicol (TEG-azida) (2) para producir Tesa-TEG-azida (3), que tiene un enlace éster entre el fármaco y el conector (Fig. 1A).

La HPLC del compuesto (3) mostró un tiempo de retención de 13,4 minutos con una pureza superior al 99% (Fig. S1B†). El espectro de masas de (3) mostró un pico en 610,13 [M + 1]+ correspondiente al peso molecular de Tesa-TEG-azida, lo que confirma aún más la formación del producto (Fig. S2†). Por separado, se hizo reaccionar el dendrímero G4-PAMAM-OH (4) con ácido 5-hexinoico usando una reacción de esterificación para producir D-YNE (5) (Fig. 1B).

Por último, Tesa-TEG-azida (3) y D-YNE (5) se hicieron reaccionar mediante la reacción de clic altamente eficiente de cicloadición catalizada por cobre-alquino (CuAAC) para producir D-Tesa (6) (Fig. 1B).48 La RMN 1H confirmó la síntesis exitosa de todos los intermedios y el producto final; D-Tesa (6) contenía los picos característicos de dendrímero y protones enlazadores de fármacos que demuestran la síntesis exitosa de D-Tesa (Fig. 2A).

La RMN del conjugado final D-Tesa reveló que un promedio de diez moléculas de Tesa estaban unidas a cada dendrímero. La HPLC confirmó una conjugación covalente exitosa, ya que D-Tesa mostró un cambio tanto de D-YNE como de TesaTEG-azida (Fig. 2B y S1†).

Tesa tiene una solubilidad acuosa pobre, estimada en 0.0035 mg mL-1.49 La conjugación de Tesa con dendrímero hidroxilo mejoró su solubilidad en agua en varios órdenes de magnitud con respecto a esta estimación. D-Tesa tenía una solubilidad en agua de 22 mg ml-1, y dado que Tesa comprende aproximadamente el 19% de la masa de D-Tesa, se solubilizaron 4,2 mg ml-1 equivalentes de Tesa (Fig. 3A).

La mayor solubilidad que ofrece el dendrímero aumenta la facilidad de formulación y elimina la necesidad de excipientes potencialmente tóxicos.50 Todos estos beneficios se suman a la capacidad superior del dendrímero para administrar fármacos libres a través de la BHE a la microglía in vivo, y potencialmente reducir la dosis necesaria para lograr el efecto terapéutico.18–28 Por último, D-Tesa tenía un tamaño promedio de 7,75 ± 0.29 nm (Fig. S3†) y un potencial zeta de 2,86 ± 0,38 mV. (N=5 y N=3 medición, respectivamente).

liberación de drogas

Diseñamos D-Tesa para liberar Tesa intracelularmente dentro del entorno de pH bajo y alta concentración de esterasa en los endosomas/lisosomas de la microglía activada. Anteriormente hemos informado que los dendrímeros PAMAM ingresan principalmente a las células a través de endocitosis en fase fluida, y las vesículas que contienen los conjugados se transforman en lisosomas.51

Incubamos D-Tesa a 37 grados en tampón de citrato de sodio (pH 5,5) en presencia de esterasas para imitar las condiciones de los lisosomas, como se realizó anteriormente. 52-54 También investigamos la liberación en condiciones que imitan las condiciones del plasma (solución salina tamponada con fosfato [PBS] ] tampón, pH 7,4).

En condiciones plasmáticas, sólo se libera alrededor del 1,5% de Tesa después de 48 horas, y menos del 20% de Tesa se libera el día 25, lo que sugiere la estabilidad plasmática del conjugado (Fig. 3B).

En condiciones lisosomales, aproximadamente el 60% de Tesa se libera de D-Tesa dentro de las primeras 48 horas, y dentro de 19 días, se libera casi el 100% de Tesa. Estos resultados demuestran que D-Tesa proporciona una liberación sostenida y provocada del fármaco libre durante las dos primeras semanas de incubación en condiciones lisosomales fisiológicamente relevantes.

Además, la liberación mínima de Tesa en las condiciones plasmáticas simuladas (grupo de pH 7,4) durante las primeras 48 horas es significativa, dado que este es el tiempo de circulación típico de G4-PAMAM-OH antes del aclaramiento renal, es probable que se libere una cantidad mínima de Tesa del plasma. conjugados antes de que lleguen a la microglía.24

D-Tesa disminuyó la expresión de marcadores M1 y aumentó los marcadores M2

Para evaluar la capacidad de D-Tesa para inducir un cambio de fenotipo de M1 a M2, evaluamos la capacidad de D-Tesa para alterar la expresión de los marcadores M1 y M2 in vitro utilizando una línea celular microglial murina (BV2).

Las células BV2 se crearon inmortalizando células microgliales murinas y demostraron ser una alternativa adecuada a las células microgliales primarias para estudiar la respuesta inflamatoria microglial.55,56 En nuestros experimentos, para imitar el entorno neuroinflamatorio presente en múltiples enfermedades neurológicas, tratamos previamente la microglia con 100 ng ml-1 (300 unidades de endotoxina (UE) por ml) de LPS durante 3 horas.

Luego, cotratamos las células con LPS y Tesa o D-Tesa libre durante 48 horas y luego recolectamos las muestras. Tratamos las células a concentraciones de 1,5, 15 y 150 µM de Tesa o D-Tesa libre, en base a un fármaco equivalente.

El ensayo MTT demostró que Tesaor D-Tesa libre en estas concentraciones no causaba citotoxicidad (Fig. S4†). Se realizó un estudio inicial de búsqueda de dosis con Tesa y D-Tesa para determinar la dosis más eficaz de Tesa y D-Tesa.

El tratamiento con Tesa y D-Tesadid libres 1,5 y 15 µM no altera la secreción de óxido nítrico o TNF-, según lo determinado por el reactivo de Griess y un ELISA de TNF-, respectivamente (Fig. S5†). Según estos resultados, no analizamos estas concentraciones más bajas en nuestros ensayos qRT-PCR.

En muchas enfermedades neurodegenerativas, una función neurotóxica importante de la microglía proinflamatoria M1 es su secreción de especies reactivas de oxígeno (por ejemplo, óxido nítrico) que matan directamente a las neuronas.57,58 Posteriormente, se ha postulado que una posible estrategia terapéutica sería disminuir la secreción de estas moléculas.

Evaluamos la capacidad de D-Tesa para lograr este efecto. Después de la estimulación con LPS, D-Tesa disminuyó los niveles de ARNm de óxido nítrico secretado y de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) 3,7-veces (p < 0.0001) y 2-veces (p {{ 7}}.011), respectivamente, en comparación con las células tratadas únicamente con LPS (solo LPS) (Fig. 4A y B).

Por otro lado, Tesa libre disminuyó el óxido nítrico secretado de forma más moderada (1,4-veces, p=0.004) y no condujo a una disminución significativa en la expresión del ARNm de iNOS (Fig. 4A y B). ).

D-Tesa fue mucho más eficaz que el Tesain libre suprimiendo la secreción de óxido nítrico. A continuación, dependiendo de si la microglía está en un fenotipo M1 o M2, la microglía regula positivamente ya sea iNOS o Arginasa 1 (Arg1) para metabolizar la L-arginina para producir óxido nítrico para su respuesta de eliminación de patógenos M1, orornitina y urea para la respuesta de curación de heridas M2, respectivamente. 59

De acuerdo con su regulación negativa de iNOS, D-Tesa aumentó los niveles de ARNm de Arg1 2- veces (p=0.011) en comparación con el control solo con LPS, mientras que Tesa libre no aumentó significativamente la expresión (p=0 .40) (Figura 4C).

D-Tesa, y en menor medida Tesa libre, hicieron que la microglía pasara de liberar óxido nítrico citotóxico a metabolizar L-arginina para la cicatrización de heridas, lo que tiene implicaciones para reducir y potencialmente revertir la neurotoxicidad causada por la microglía en la neurodegeneración.5–7,10

La regulación negativa de los niveles de iNOS y óxido nítrico secretado con el tratamiento con D-Tesa se debe a trabajos previos que demostraron que el ligando natural de PPAR (15-desoxi-Δ12,14-prostaglandina J2) disminuyó la expresión y secreción de iNOS y óxido nítrico en pacientes tratados con LPS. microglía primaria.60

IL-10, IL-4 y TGF- 1 son citocinas secretadas por la microglía M2 activada alternativamente que puede inducir un entorno neuroprotector y antiinflamatorio en el cerebro.58,61,62Hacia Con este fin, D-Tesa aumentó la expresión de IL-105.5-veces (p=0.011) e IL-4 8.2-veces (p { {15}}.013) en comparación con el control solo con LPS (Fig. 4D y E).

Free Tesa no aumentó significativamente ni los niveles de IL-10 ni IL-4, aunque los promedios fueron 1,7-veces (p=0.066) y 2,{{7} }veces (p=0.11) mayor, respectivamente, para la microglía tratada con Tesa en comparación con los controles solo con LPS (Fig. 4D y E). Además, D-Tesa aumentó la expresión de TGF- 1 2.3-veces (p=0.015) y Tesa libre no cambió significativamente la expresión (Fig. 4F).

Así, D-Tesa induce la secreción de citoquinas antiinflamatorias después del tratamiento de la microglía con LPS, lo que puede mitigar el ambiente neurotóxico y proinflamatorio presente en las enfermedades neurodegenerativas.5–7,10

Expresión inducida por D-Tesa de marcadores del subtipo M2-

CD206, Ccl1 y TLR8 son marcadores específicos para los subtipos de microglía M2a, M2b y M2c, respectivamente.58 D-Tesa upregulatedCD206 expresión 4.{{10 }}veces (p < 0,001), Ccl1 3.5-veces (p < 0,005) y TLR8 5-veces (p < 0,01), mientras que Tesa libre no aumentó significativamente la expresión de cualquiera de estos tres marcadores (Fig. 5A-C).

Estos datos muestran que la microglía tratada con D-Tesa demuestra una regulación positiva significativa de los marcadores de los tres subtipos M2, lo que concuerda con el entendimiento de que el fenotipo de la microglía es plástico y no binario.63–65

La nomenclatura M1/M2 simplifica demasiado la complejidad de que la microglia pueda existir en un espectro de estados de activación; A lo largo de este continuo, se han caracterizado tres fenotipos M2 distintos (M2a, M2b y M2c), y D-Tesa induce la expresión de marcadores consistentes con cada uno de estos estados. proteínas mediante la regulación positiva de los receptores carroñeros, la reparación de tejidos y acciones antiinflamatorias.

La microglía M2b es similar a la microglía M1 en que expresa IL-1, TNF- e IL-6; sin embargo, M2b se diferencia de la microglía M1 en que expresa IL-10 en niveles altos y regula negativamente la expresión de iNOS. Los macrófagos y la microglia de M2b estimulan las células T Th2, lo que es indicativo de una de las funciones de M2b en la inducción de una respuesta antiinflamatoria.

La microglía M2 está implicada en la cicatrización de heridas, la remodelación de tejidos, el secuestro de hierro y la activación de STAT3 que reduce la señalización proinflamatoria.58,61,63,66 La actividad PPAR de Tesa estimula un bucle de retroalimentación que da como resultado una mayor expresión de PPAR y su proteína de señalización ascendente (STAT6). que son ambos marcadores M2a. 58D-Tesa aumentó la expresión de PPAR 2.3-veces (p=0.0036)y STAT6 3.4- veces (p < 0,001), mientras que Tesa libre aumentó STAT6 1.8-veces (p=0.011) sin un aumento significativo en la expresión de PPAR (aumento de 1,58-veces, p= 0.17) (Fig. 5D y E).

El aumento de la expresión de STAT6 y PPAR da como resultado la producción de genes antiinflamatorios y la inhibición de señales proinflamatorias al inhibir la actividad de NF-κB. Dado que la microglía M2a se puede inducir tratando la microglía con IL-4, que envía señales a través de STAT6 y PPAR, la regulación positiva de estas dos proteínas de señalización posteriores puede dar como resultado una polarización anticipada de M2a.68

En nuestros ensayos, la activación de LPS aumentó los niveles de IL-6, TNF- e IL-1, y el tratamiento con D-Tesa aumentó aún más la expresión de estas citocinas (Fig. S6A-D†), lo que probablemente debido a que D-Tesa induce el fenotipo M2b (Fig. 5B).

Free Tesa aumentó la expresión de IL-6 y no cambió significativamente la expresión de TNF- e IL-1 (Fig. S6A – D†). Si bien estas citocinas son secretadas por la microglía M1, la microglía M2b también las expresa.58,61 CD86 es un marcador de la microglía M1 y M2b, y aumenta con el tratamiento con D-Tesa (Fig. S6E†).

Además, el supresor de la señalización de citocinas (SOCS) es una familia de proteínas intracelulares que regulan la polarización fenotípica de la microglía mediante la supresión de múltiples vías de señalización activadas por citocinas.69 SOCS1 es un miembro de esta familia y se ha demostrado que inhibe LPS/TLR4. mediada por la señalización de NF-κB y JAK2, reduciendo así la cantidad de TNF-, IL-1 e IL-6 liberada por la microglía M1 a través de la vía LPS/TLR4.

D-Tesa regula positivamente la expresión de SOCS1 en comparación con el control solo con LPS (Fig. S6F†), lo que sugiere que el aumento de IL-6, TNF- e IL-1 exhibido por D-Tesa podría deberse a la inducción de la Fenotipo M2b y no mediante mejora del fenotipo inductor de LPS/TLR4, M1-.

Además, el LPS envía señales a través de TLR4 y, para evitar una activación celular excesiva, la microglía posee un mecanismo de retroalimentación negativa mediante el cual la activación de TLR4 conduce a una disminución de la expresión de TLR4.70

El tratamiento con Tesa y D-Tesa libres aumentó los niveles de TLR4 3,6-veces (p < 0.001) y 3,7-veces (p < 0,001), respectivamente (Fig. 5F), lo que sugiere que Tesa y D-Tesa alteraron la vía de señalización de retroalimentación negativa típica de LPS/TRL4.

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