Determinación de echinacósido en extracto acuoso de Cistanche Herba mediante HPLC

Abstracto: ObjetivoSe estableció un método de HPLC para la determinación de equinacósido en el extracto acuoso deCistanche herba.MétodosEl echinacósido se determinó mediante HPLC. La separación se realizó en el Inertsil ODS-SP C18 columna con una fase móvil compuesta de acetonitrilo(A)y 0.Solución de ácido fosfórico al 4%(B), por gradienteelución. La longitud de onda de detección se fijó en 333 nm., y la temperatura de la columna fue de 30 grados. El caudal fue 1,0ml·min-1 y el volumen de inyección fue 10μL. ResultadosLa relación lineal deechinacósidodentro de la concentraciónrango de 44.939 7-539.276 4 ug·mL- 1 estuvo bien(r = 0.999 8). Las recuperaciones fueron del 94,59%-105.31%(RSD=2.93%,n = 9). El contenido de equinacósido en los extractos acuosos de Cistanche herba fue de 15.527,7.347,12.267 mg·g-1. 

ConclusiónEl método HPLC establecido con buena repetibilidad es preciso, simple y factible. es adecuadopara la determinación de echinacósido en elextracto acuoso de Cistanche herba. 

Palabras clave:HPLC;extracto acuoso de Cistanche herba; equinacósido; determinación del contenido

NUEVA FORMULACIÓN HERBARIA PARAYANG RENAL NUTRITIVO

Cistanche deserticolaEs un tónico de la medicina tradicional china de uso común en la práctica clínica y se le conoce como "ginseng del desierto" [1]. ElCistanche deserticolaregistrado en la edición 2015 delFarmacopea chinaes el tallo carnoso seco con hojas escamosas deCistanche deserticola YC MaoCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Es cálido, dulce y salado y regresa a los meridianos del riñón y del intestino grueso. Tiene los efectos de nutrir el yang del riñón, reponer la esencia y la sangre, e hidratar los intestinos y ser laxantes [2]. "La Materia Médica de Shen Nong", dice que puede "tonificar el medio, nutrir los cinco órganos internos, fortalecer el yin y nutrir la esencia". Cistanche deserticola contiene principalmente glucósidos feniletanoides, iridoides y sus glucósidos, lignanos y sus glucósidos, polisacáridos, compuestos éster y alcaloides [3].

Los glucósidos feniletanoides son los principales ingredientes activos de Cistanche deserticola, entre los cuales la equinácea y el verbascósido son los componentes índice para la identificación y determinación del contenido de Cistanche deserticola en la farmacopea china. Los estudios farmacológicos [4] muestran que Cistanche deserticola tiene diversos efectos farmacológicos como laxante, protector del hígado, antiosteoporosis, antioxidante, antienvejecimiento y antifatiga. El extracto acuoso de Cistanche deserticola puede promover el gen de la proteína morfogenética ósea 2 en los osteoblastos de rata, así como la fosfatasa ácida resistente al tartrato y el calcio óseo en el suero de ratones ovariectomizados.

La expresión de los genes Smad1, Smad5, factor de crecimiento transformante, etc. en la médula ósea y la médula ósea tiene un efecto antiosteoporótico [5-6].

La equinácea puede promover la proliferación de osteoblastos y promover la diferenciación de células madre mesenquimales de médula ósea cultivadas in vitro en osteoblastos [7-9]. En los últimos años, ha habido muchos informes de investigación sobre la determinación del contenido de echinacósido y verbascósido en el extracto etanólico de Cistanche deserticola y sus preparaciones compuestas [10-12], pero hay pocos informes sobre la determinación del contenido de los componentes índice en Cistanche deserticola. extracto acuoso. En este estudio, se utilizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para determinarel contenido de echinaceasideen elextracto acuoso de Cistanche deserticola.

1 materia

1.1 Instrumentos

Cromatógrafo líquido de alto rendimiento LC-20AT, detector SPD-20A, muestreador automático SIL-20A, horno de columna CTO-10ASvp, estación de trabajo de cromatografía líquida en solución LC, Shimadzu Corporation, Japón; Balanza analítica electrónica MES125P-OCE-DU, Sartorius, Alemania; Bomba de vacío multiusos de agua circulante SHZ-D (III), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Sistema de circulación de enfriamiento del evaporador rotativo RC2B SO25, evaporador rotativo RV 10 D S96, IKA, Alemania; Baño María eléctrico a temperatura constante DK-S26, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Máquina de agua ultrapura serie UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Materiales y reactivos medicinales

Los materiales medicinales de Cistanche deserticola se compraron en Guangzhou Lingnan Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., números de lote: 1801001, 1806001 y 181001. El jefe chino lo identificó como el tallo carnoso seco con hojas de escamas de Cistanche deserticola YCMa de la familia Orobanchaceae. Farmacéutico en Medicina Tu Xingming del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Guangzhou. La muestra se almacena en la Sala de Pruebas de Medicamentos del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Guangzhou; la sustancia de referencia equinacósido, el contenido es del 89,7%, el número de lote es: 111670-201706 del Instituto de Inspección de Alimentos y Medicamentos de China; el acetonitrilo es cromatográficamente puro (Merck, Alemania); el metanol y el ácido fosfórico son analíticamente puros (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); el agua es ultrapura.

2 métodos y resultados

2.1 Preparación del extracto acuoso de Cistanche deserticola

Tomar el polvo crudo de Cistanche deserticola, agregar 10 veces la cantidad de agua destilada, calentar y refluir para extraer dos veces, cada vez durante 1 h, filtrar, combinar el filtrado y concentrar el filtrado a 0,100 g·mL. -1 de medicamento crudo por evaporador rotatorio y guárdelo a 4 grados para su uso posterior.

2.2 Condiciones cromatográficas e idoneidad del sistema.

Columna cromatográfica: columna Inertsil ODS SP C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); fase móvil: acetonitrilo (A)-0.Solución de ácido fosfórico al 4% (B), elución en gradiente: 0 ~ 5 min, 17%A; 5 ~ 25 min, 20 % A; 25 ~ 30 min, 17 % A; longitud de onda de detección: 333 nm; temperatura de la columna: 30 grados; caudal: 1,0 ml·min-1; Volumen de inyección: 10 µL. Bajo esta condición cromatográfica, la separación entre el equinacósido y los picos de los componentes adyacentes es superior a 1,5, y el número de placas teórico basado en el pico del equinacósido no debe ser inferior a 4,000. El cromatograma se muestra en la Figura 1.

Figura 1 Cromatogramas de HPLC de echinacósido (A) y extracto acuoso de Cistanche herba (B)

2.3 Preparación de la solución

2.3.1 Solución de referencia

Pese una cantidad adecuada de referencia de equinacósido, pésela con precisión, colóquela en un matraz volumétrico de 10 ml, agregue metanol para disolverlo y prepare una solución de referencia que contenga 898,794 ug de equinacósido por ml y guárdela a 4 grados para su uso posterior.

2.3.2 Solución de prueba

Medir con precisión 2.0 mL de extracto acuoso de Cistanche deserticola, evaporar a sequedad en baño maría, agregar metanol para disolverlo, llevar al volumen en un matraz aforado de 10 mL, agitar bien, y filtrarlo a través de una membrana filtrante microporosa de 0,22 μm para obtener la solución.

2.4 Investigación de relaciones lineales

Mida con precisión {{0}}.25, 0,50, 1,00, 2,00, 2,50, 3,00 ml de la solución de referencia según 2.3.1 y colocarlo en un matraz aforado de 5 mL, agregar metanol para completar el volumen, agitar bien y obtener una solución de referencia con un gradiente de concentración de 44.939 7, 89.879 4, 179.{ {21}}, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·ml-1,y filtrar a través de una membrana microporosa de 0.22 μm. Mida de acuerdo con las condiciones cromatográficas del punto 2.2 y registre el área del pico.

Realice una regresión lineal con la concentración de masa de referencia como eje horizontal (X, ug·mL{{0}}) y el área del pico como eje vertical (Y), y obtenga la ecuación de regresión: Y{{1 }}.0X-32 273.0, r=0.999 8. Los resultados mostraron que el equinacósido tenía una buena relación lineal en el rango de concentración de 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Prueba de precisión

Tome 539,276 4 ug·mL- 1 solución de referencia, inyecte y mida continuamente 6 veces de acuerdo con las condiciones cromatográficas indicadas en 2.2, y registre el área del pico. La RSD del área del pico de equinacósido fue del 1,81 %, lo que indica que el instrumento tenía buena precisión.

2.6 Prueba de estabilidad

Medir con precisión 2,0 mL de extracto acuoso de Cistanche deserticola, evaporar a sequedad en baño maría, disolver en metanol, diluir a 10 mL de matraz aforado, agitar bien, filtrar con 0 Membrana de filtro microporosa de 0,22 μm, inyectar y medir a las 0, 2, 4, 8, 12 y 24 h de acuerdo con las condiciones cromatográficas indicadas en 2.2, y registrar el área del pico. Resultados La RSD del área del pico de echinacósido fue del 1,16%, lo que indica que la solución de prueba tenía buena estabilidad dentro de las 24 h.

2.7 Prueba de repetibilidad

Mida con precisión 6 porciones de 2,0 ml de extracto acuoso de Cistanche deserticola, prepare 6 porciones de solución de prueba en paralelo según el método descrito en 2.3.2, e inyéctelas y mídalas según las condiciones cromatográficas indicadas en 2.2, y registre el área del pico. Resultados La RSD de la concentración másica de echinacósido fue del 1,28%, lo que indica que el método tenía buena repetibilidad.

2.8 Prueba de recuperación de muestras

Mida con precisión 9 porciones de 1,0 ml de extracto acuoso de Cistanche deserticola, agregue 0.8, 1,0 y 1,2 ml de solución de referencia (1,552 mg·mL{{11). }}) respectivamente, evaporar a sequedad en baño maría, disolver en metanol y diluir a un matraz aforado de 10 mL; Agite bien, filtre con una membrana de filtro microporosa de 0,22 μm para obtener concentraciones alta, media y baja de la solución de prueba, prepare 3 porciones de cada concentración en paralelo y mida de acuerdo con las condiciones cromatográficas descritas en 2.2, registre el área del pico y calcule. la recuperación de la muestra. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

2.9 Determinación del contenido de la muestra

Medir con precisión 2,0 mL de extracto acuoso de Cistanche deserticola en 3 porciones, evaporar a sequedad al baño maría, disolver en metanol, diluir a 10 mL en un matraz aforado, agitar bien, filtrar con una membrana de filtro microporosa de 0,22 μm y determinar de acuerdo con las condiciones cromatográficas del punto 2.2, registrar el área del pico y calcular el contenido de echinacósido. Los resultados se muestran en la Tabla 2.