Determinación de seis glucósidos feniletanoides en Cistanche Tubulosa y Cistanche Deserticola por QAMS

MA Xue-qin,DONG Yang-hong,GUO Qin,DING Hua (Departamento de farmacia,Laboratorio clave de la Modernización de la Medicina Étnica Hui,Ministerio de Educación,Centro de Investigación de Ingeniería y Tecnología de Ningxia para la modernización de la Medicina Hui,Universidad Médica de Ningxia, Yingchuan, Ningxia 750004, China)

Abstracto: Objetivo Establecer un método de HPLC para la determinación simultánea de 6 compuestos, incluidos echinacósido, cistanósido C, cistanósido A, actósido, 2＇－ acetilactósido y 6＇－ acetilactósido en Cistanche tubulosa y Cistanche deserticola mediante análisis cuantitativo de múltiples componentes con un solo marcador. (QAMS) ． Métodos Mediante el uso de echinacósido como referencia interna, se estableció el factor de corrección relativo (ＲCF) de cistanosido C, cistanósido A, acteoside, 2＇－ acetylacteoside y 6＇－ acetylacteoside, y se determinaron y compararon los 6 constituyentes de glucósidos feniletanoides anteriores mediante QAMS y método de la curva estándar, respectivamente. Ｒresultados Los factores de correlación relativa de acteoside, cistanósido C, cistanósido A, 2＇ － acetylacteoside y 6＇－ acetylacteoside se calcularon mediante métodos validados como 1． 008,1． 871,0． 809,0． 611 y 0． 603, respectivamente. Los resultados de la determinación se compararon con los datos obtenidos por el método de la curva estándar que reflejaron la buena reproducibilidad de los factores de correlación relativa y no se observaron diferencias significativas en los resultados del ensayo entre el método del estándar externo y el método QAMS. Conclusión El método es simple y confiable, que se puede utilizar fácilmente para distinguir y determinar simultáneamente el contenido de varios constituyentes bioactivos en Cistanche tubulosa y Cistanche deserticola, así como su control de calidad.

Palabras clave: Cistanche tubulosa; Cistanche deserticola; glucósidos feniletanoides; QAMS; Control de calidad

Cistanche desertica

Cistanche deserticola YCMa o Cistanche tubulosa (Schenk) Wish, medicina tradicional china para tonificar el riñón, está registrada en la edición de 2015 de la Farmacopea China. Es un tallo suculento del género Cistanche en la familia Lewandaceae, distribuido principalmente en Mongolia Interior, Ningxia, Gansu, Qinghai y Xinjiang. Cistanche deserticola y Tubular Cistanche deserticola tienen un valor medicinal extremadamente alto. Entran en los meridianos del riñón y del intestino grueso. El Compendio de Materia Médica registra que Cistanche deserticola "es una sustancia nutritiva pero no severa, por lo que se llama Cistanche deserticola" y "es cálida pero puede humedecer, reponer pero no secar, suavizar pero no causar diarrea".

Cstanche deserticola

Tiene los efectos de tonificar el yang del riñón, beneficiando la esencia y la sangre, humedeciendo los intestinos y defecando. Tradicionalmente, se utiliza para la deficiencia de yang de riñón, deficiencia de esencia y sangre, impotencia, infertilidad, dolor de cintura y rodillas, debilidad de músculos y huesos, y estreñimiento debido a la sequedad intestinal. Es el medicamento tonificante de yang de riñón más utilizado. en Historia. La investigación farmacológica moderna muestra que Cistanche deserticola tiene muchos efectos, como mejorar la función sexual, combatir el envejecimiento, mejorar la capacidad de aprendizaje y memoria, combatir la enfermedad de Alzheimer, defecar, etc. , y preparaciones simples y productos para el cuidado de la salud [2-5].

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Los principales componentes químicos de Cistanche deserticola son los glucósidos feniletanoides, los iridoides y sus glucósidos, los lignanos y los polisacáridos [6]. Los estudios farmacológicos modernos han demostrado que los glucósidos feniletanoides son las sustancias activas más importantes en Cistanche deserticola y tienen efectos obvios contra la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la isquemia miocárdica y otros. [7].

Principales componentes químicos de Cistanche deserticola

En la actualidad, existen muchos métodos para controlar la calidad de los ingredientes efectivos en Cistanche deserticola. La farmacopea ha establecido métodos de determinación del contenido de echinacósido y junto a la piscina en Cistanche deserticola, que es difícil de reflejar y controlar de manera integral la calidad de Cistanche deserticola. En los últimos años, aunque ha habido informes utilizando HPLC para determinar simultáneamente el contenido de cuatro glucósidos feniletanoides en Cistanche deserticolamamá, se requieren múltiples materiales de referencia, lo que aumenta el costo experimental y la aplicación. Sin embargo, no ha habido informes sobre la determinación cuantitativa de seis glucósidos feniletanoides en Cistanche deserticola, así como el método para determinar el contenido de Cistanche deserticola con un estándar y múltiples ensayos. Este experimento estableció un método de análisis cuantitativo de componentes múltiples por un solo fabricante (QAMS) para la determinación simultánea de seis componentes activos en Cistanche deserticola, incluidos equinacósido, antocianina, glucósido C, glucósido A, 2-acetil antocianina y {{ 1}}acetil antocianina, usando una sustancia de referencia de equinacósido como referencia. Al mismo tiempo, el documento realizó un estudio comparativo sobre el contenido de los seis componentes mencionados anteriormente en dos hierbas medicinales, Cistanche deserticola y Cistanche tubulosa, para investigar las diferencias en los componentes efectivos de Cistanche deserticola de diferentes fuentes y proporcionar datos experimentales para el control de calidad de Cistanche deserticola.

1 Materiales e Instrumentos

cromatógrafo de líquidos de alta resolución Agilent 1260; Espectrofotómetro UV Shimadzu UV-2550, Japón; Triturador de medicina tradicional china Shanghai Jinpeng FW100; limpiador ultrasónico KQ-500E (Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); pipeta Eppendorf (Alemania); Balanza analítica AL104 (Mettler Toledo Instrument Co., Ltd.); Agua destilada; Todos los demás reactivos son analíticos puros. echinacetina (número de lote: 111670-200503) del Instituto de China para el Control de Productos Biológicos; glucósido de flor de Maorui (número de lote: Must-12030806, Instituto de China para el Control de Productos Biológicos); El glucósido C de Cistanche, el glucósido A de Cistanche, el 2-acetyl poolside y el 6-acetyl poolside se fabrican ellos mismos en el laboratorio (identificados por espectros de RMN y MS), con una pureza de HPLC superior al 95 %; La cistanche deserticola YCMa del desierto es proporcionada por la base de plantación de cistanche de Ningxia Yongning, y la cistanche tubulosa tubular (Schenk) Wight es proporcionada por Ningxia Mingde Herbal Tablets Co., Ltd. Los materiales medicinales anteriores han sido identificados por el Profesor Asociado Dong Lin de Ningxia Medical Oficina de Docencia e Investigación de la Facultad de Farmacia. Metanol, acetonitrilo (cromatográficamente puro, TEDIA, EE. UU.); Wahaha Agua Pura; Todos los demás reactivos son analíticos puros.

El glucósido de feniletanol es el principal componente activo de Cistanche deserticola

2 Métodos y Resultados

2.1 Revisión de la metodología de una prueba y evaluación múltiple

2.1.1 Preparación de la solución de referencia

Tome una cantidad adecuada de muestras de control secas a peso constante de echinacósido, poolside, cistanche glucósido C, cistanche glucósido A, {{0}}acetil poolside y 6-acetyl poolside, péselos con precisión y agregue metanol para preparar una solución de control mixta con concentraciones de 0.027, 0.{{10}}27, 0,008, 0,014, 0,022 y 0,007 mg · ml-1, respectivamente.

2.1.2 Preparación de la solución de prueba

Tome aproximadamente 4.0 g de polvo medicinal (tamiz de malla 80) de Desert Cistanche deserticola y Tubular Cistanche deserticola respectivamente, péselos con precisión, agregue 50 ml de solución de metanol para extracción ultrasónica durante 40 minutos, enfríelos, agregue metanol para compensar el peso perdido, filtrarlos por separado, tomar 1 ml del filtrado posterior, diluir 20 veces y obtener.

2.1.3 Condiciones cromatográficas

sistema de cromatografía líquida Agilent 1260; Columna cromatográfica Columna TSK GEL C18 (4,6 id × 250 mm; cinco μ m); Gradiente de elución con acetonitrilo (B) -0.5 por ciento de agua con ácido acético (A): 0-10 minutos, 83 por ciento -80 por ciento de A; 10 - 30 min, 80 por ciento - 75 por ciento A; 30 － 40 min, 75 por ciento - 70 por ciento A; Caudal: 1,0 ml · min-1; Longitud de onda de detección 333 nm; Volumen de inyección: 5 μ l; Prueba de temperatura ambiente. Bajo las condiciones cromatográficas anteriores, los cromatogramas de la sustancia de referencia mixta y la solución de prueba se muestran en las Figuras 1-3, respectivamente.

1. Equinacetina; 2. Cistanche glucósido A; 3. Glucósido de flores de Maorui; 4. Cistanche glucósido C; 5.2- acetil pilósido; 6.6- Acetilpilósido

Figura 1 Cromatograma HPLC de solución de referencia mixta

1. Equinacetina; 2. Cistanche glucósido A; 3. Glucósido de flores de Maorui; 4. Cistanche glucósido C; 5.2- acetil pilósido; 6.6- Acetilpilósido

Figura 2 Cromatograma de HPLC de la solución de prueba Desert Cistanche

1. Equinacetina; 2. Cistanche glucósido A; 3. Glucósido de flores de Maorui; 4. Cistanche glucósido C; 5.2- acetil pilósido; 6.6- Acetilpilósido

Figura 3 Cromatograma HPLC de la solución de prueba de Cistanche deserticola

2.1.4 Relación lineal

Tome la solución de referencia mezclada anteriormente y tome 1, 2, 3, 4, 5 y 6, respectivamente μ Inyecte la muestra para detección de acuerdo con las condiciones cromatográficas anteriores y realice una regresión lineal con la cantidad de inyección de muestra de referencia (X) como el eje x y el área del pico (Y) como el eje y. Los resultados se muestran en la Tabla 1, lo que indica que la relación lineal de cada muestra de control es buena dentro de sus respectivos rangos de inyección.

Tabla 1 Relación lineal de seis sustancias de referencia de glucósidos feniletanoides

2.1.5 Prueba de estabilidad

Tome la misma solución de prueba e inyecte muestras a las 0, 2, 4, 8 y 12 horas después de la preparación para determinar los valores de área pico de echinacósido, poolside, glucósido C de cistanche, glucósido A de cistanche, 2- junto a la piscina de acetilo y 6-junto a la piscina de acetilo. Calcule las RSD de 1,51 por ciento, 1,80 por ciento, 1,80 por ciento, 1,71 por ciento, 1,85 por ciento y 1,82 por ciento, respectivamente, lo que indica que la solución de prueba es estable en 12 horas.

2.1.6 Prueba de precisión

Tome la misma solución de referencia mixta y repita la inyección 6 veces según las condiciones cromatográficas anteriores. Determinar los valores de área de pico de echinacoside, poolside, cistanche glucósido C, cistanche glucósido A, 2-acetyl poolside y 6-acetyl poolside. Calcule los RSD como 0.23 por ciento, 0.01 por ciento, 0.10 por ciento, 0.20 por ciento, 0,54 por ciento y 0,32 por ciento, respectivamente, lo que indica una buena precisión del instrumento.

2.1.7 Prueba de repetibilidad

Pese con precisión 6 partes de la muestra de prueba en polvo de Desert Cistanche deserticola, prepare la solución de prueba de acuerdo con el método en "2.1.2" e inyecte 5 muestras de acuerdo con las condiciones cromatográficas anteriores μ Los valores promedio de los contenidos de echinacósido, poolside, cistanche glucósido C, cistanche glucósido A, 2-acetyl poolside y 6-acetyl poolside se determinaron en 8,48, 8,25, 2,35, 1,49, 6,63 y 1,65 mg · g-1 , respectivamente. Las RSD calculadas fueron 1,58 %, 1,44 %, 1,58 %, 1,59 %, 1,05 % y 1,43 %, lo que indica una buena repetibilidad del método.

2.1.8 Tasa de recuperación de muestras

Tome 9 partes de polvo deserticola del desierto con contenido conocido en "2.1.7", 3 partes se dividen en 1 grupo, y cada parte es 0.1 g, pesado con precisión. Agregue con precisión cada solución de referencia a cada grupo y calcule la tasa promedio de recuperación de muestras. Los resultados se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2 Tasa de recuperación de deserticola del desierto después del muestreo

2.2 Determinación del factor de corrección relativo

2.2.1 Determinación de los factores de corrección relativos para cada componente

Usando echinacetina como material de referencia y usando el método de calibración multipunto [8-11], tome la solución de referencia mixta en "2.1.1", inyecte la muestra para el análisis y registre el área del pico de cada componente. Calcule el factor de corrección relativo (fk/s) de cada componente en función de la fórmula siguiente, utilizando el equinacósido como material de referencia. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

fk/s=fk /fs=( Ck × As) /( Cs × Ak )

En la fórmula, As es el área del pico de la sustancia de referencia s, Cs es la concentración de la sustancia de referencia s, Ak es el área del pico de cierto componente k que se va a analizar y Cs es la concentración de cierto componente k.

Tabla 3 Factores de corrección relativos fk/s para cada componente usando equinacetina como material de referencia

Los factores de corrección relativos para poolside, cistanche glucósido C, cistanche glucósido A, {{0}}acetyl poolside y 6-acetyl poolside fueron 1.008, 1,871, 0,809, 0,611 y 0,603, respectivamente, con RSD inferior al 1,5 por ciento.

2.2.2 Efecto de diferentes volúmenes de inyección en f

Examinó diferentes volúmenes de inyección (1, 2, 3, 4, 5 μ l) Como se muestra en la Tabla 4, los factores de corrección relativos f para diferentes volúmenes de inyección de poolside, cistanche glucósido C, cistanche glucósido A, 2-acetil poolside y 6-acetil junto a la piscina son 1,80 por ciento, 2,26 por ciento, 1,46 por ciento, 2,99 por ciento y 3,27 por ciento, respectivamente, lo que indica que los diferentes volúmenes de inyección no tienen un efecto significativo en la f de cada componente.

2.2.3 Efecto de diferentes columnas cromatográficas en f

Investigamos los efectos de cuatro columnas cromatográficas (YMC-Triart C18, Agilent Eclipse 5 XDB-C18, TOSOH TSK GEL ODS-100V y Agilent ZORBAX SB-C18) en cada factor. Los factores de corrección relativos f para poolside, cistanche glucósido C, cistanche glucósido A, 2-acetyl poolside y 6-acetyl poolside en diferentes columnas cromatográficas fueron 2,55 por ciento, 1,89 por ciento y 3,45 por ciento, respectivamente, 2,49 por ciento y 2,21 por ciento (Tabla 4) indican que las diferentes columnas cromatográficas no tienen un efecto significativo en la f de cada componente.

2.2.4 Impacto de diferentes instrumentos en f

Se investigaron los efectos de tres métodos HPLC diferentes (Agilent 1220, Agilent 1260, Agilent 1260 II) en cada f. Como se muestra en la Tabla 4, los factores de corrección relativos f para poolside, Cistanche C, Cistanche A, 2-acetyl poolside y 6-acetyl poolside bajo diferentes instrumentos fueron 1.69 por ciento, 2.52 por ciento, 1.66 por ciento, 2.06 por ciento y 2.26 por ciento, respectivamente (Cuadro 4), Indica que los diferentes instrumentos no tienen un impacto significativo en la f de cada componente.

2.2.5 El impacto de personal diferente en f

Se investigaron los efectos de tres individuos diferentes en cada f, como se muestra en la Tabla 4. Los factores de corrección relativos f para poolside, cistanche glucósido C, cistanche glucósido A, 2-acetyl poolside y 6-acetyl poolside fueron 1,80 por ciento, 2,26 por ciento, 1,46 por ciento, 2,99 por ciento y 3,27 por ciento, respectivamente, a diferentes volúmenes de inyección. Esto indica que los diferentes volúmenes de inyección no tienen un efecto significativo en la f de cada componente.

Tabla 4 Efectos de diferentes factores sobre el factor de corrección relativo fk/s de cada componente

2.3 Determinación del tiempo de retención relativo de cada componente

Los tiempos de retención relativos de los componentes de poolside, cistanche glucósido C, cistanche glucósido A, 2-acetyl poolside y 6-acetyl poolside fueron 1,91, 2,60, 1,42, 2,99 y 3.{{11} }, respectivamente, con RSD inferior al 1,5 por ciento. La repetibilidad era buena.

2.4 Comparación de resultados de medición entre métodos de evaluación múltiple de una prueba y método estándar externo

Tome aproximadamente 4.0 g de polvo medicinal de cistanche tubular y de desierto de diferentes lotes, péselos con precisión y prepare la solución de prueba de acuerdo con "2.1.2". Utilice el método estándar externo para determinar el contenido de componentes de echinacoside, poolside, cistanche glucósido C, cistanche glucósido A, 2-acetyl poolside y 6-acetyl poolside, y luego calcule el contenido utilizando el QAMS establecido. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Determinación simultánea de seis glucósidos de feniletanol en Cistanche deserticola y Cistanche tubulosa mediante el método estándar externo y el método QAMS mg · g-1

- "significa no detectado; n=3

Como se muestra en la Tabla 5, la desviación relativa entre los valores medidos del estándar externo y los valores calculados de QAMS está dentro del 3 por ciento, lo que indica que no hay una diferencia significativa en los resultados de medición entre los dos métodos. El método QAMS se ha establecido para la evaluación de la calidad de varios glucósidos feniletanoides en Cistanche deserticola.

3 Discusión

La edición 2015 de la Farmacopea China estipula que la cantidad total de echinacósido y poolside en Cistanche deserticola no debe ser inferior al 0,3 por ciento, y el contenido de ambos en Cistanche tubulosa no debe ser inferior al 1,5 por ciento. Los glucósidos de feniletanolamina, como principal componente activo de la Cistanche deserticola, están presentes en un alto contenido, además del equinacósido y las antocianinas. Otros componentes como Cistanche deserticola glucósido C, Cistanche deserticola glucósido A, 2-acetil antocianinas y 6-acetil antocianinas también están presentes en un alto contenido. Los estudios han demostrado que el glucósido A de Cistanche puede tener un efecto protector significativo sobre el daño hepático inducido por tetracloruro de carbono y alcohol en ratones, y puede mejorar la tasa de eliminación de radicales libres. Los glucósidos feniletanoides totales de Cistanche deserticola tienen efectos antiinflamatorios y antioxidantes. Además, la investigación ha encontrado que el contenido de Cistanche glucósido A y 2-acetil junto a la piscina en las hierbas medicinales recolectadas en primavera es relativamente alto, y estos dos componentes efectivos tienen actividades farmacológicas similares a las del equinacósido y junto a la piscina. Se recomienda añadir Cistanche glucósido A y 2-acetilo junto a la piscina a los componentes indicadores para determinar el contenido de Cistanche [15]. Por lo tanto, solo medir el contenido de echinacósido y junto a la piscina no puede reflejar completamente los efectos farmacológicos y la calidad medicinal de Cistanche deserticola. Este experimento adopta múltiples métodos de evaluación de una prueba, utilizando echinacetina como material de referencia, para establecer los factores de corrección relativos del glucósido C de Cistanche, el glucósido A de Cistanche, 2-acetyl poolside y 6-acetyl poolside con Equinacetina. 

extracto de cistanche en polvo

A través de la determinación de una sustancia de referencia de echinacetina, se analizaron cualitativa y cuantitativamente un total de seis glucósidos feniletanoides en el material medicinal, lo que garantiza de manera integral la calidad del material medicinal.

El experimento investigó los efectos de diferentes volúmenes de inyección, columnas cromatográficas, instrumentos y personal experimental en el factor de corrección relativo y los resultados no mostraron una desviación significativa (RSD<5%); The QAMS method was validated using the external standard method, and the results showed that there was no significant difference between the calculated values of the QAMS method and the measured values of the external standard method, indicating that the relative correction factor established in this experiment is accurate and reliable.

Además, los resultados experimentales también mostraron que había una diferencia significativa en el contenido de seis glucósidos de feniletanolamina en la desertica desertica desertica y tubular, y también hubo una diferencia significativa en el contenido de ingredientes efectivos en el mismo material medicinal de diferentes lotes. , que está estrechamente relacionado con el tipo de material medicinal, el entorno de crecimiento y el período de cosecha. En resumen, este experimento ha establecido un método para determinar el contenido de Cistanche deserticola con múltiples métodos de evaluación. Mediante el uso de una sustancia de referencia, se puede calcular con precisión el contenido de seis glucósidos feniletanoides en Cistanche deserticola y Cistanche deserticola, incluido el equinacósido, poolside, glucósido C, glucósido A, 2-acetyl poolside y 6-acetyl poolside Además, ha logrado la determinación del contenido de componentes multiindicadores en caso de escasez de materiales de referencia, proporcionando un método más científico y conveniente para el control de calidad de Cistanche deserticola.

referencia

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