La exposición a gases de escape diésel altera la expresión de las redes implicadas en la neurodegeneración del cerebro del pez cebra, parte 1

Abstracto

Las enfermedades neurodegenerativas son una de las principales causas de discapacidad en el mundo, pero sus etiologías siguen siendo en gran medida difíciles de alcanzar. Los factores genéticos sólo pueden representar una minoría del riesgo de la mayoría de estos trastornos, lo que sugiere que los factores ambientales desempeñan un papel importante en el desarrollo de estas enfermedades.

Las enfermedades neurodegenerativas se refieren a un tipo de enfermedad que provoca la degeneración de las células cerebrales por diferentes motivos. Las más comunes incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, etc. Estas enfermedades afectan las neuronas del cerebro, lo que provoca un deterioro de la función cerebral y síntomas como la memoria, el pensamiento y cambios de comportamiento.

Sin embargo, no es necesario que perdamos nuestra actitud positiva debido a estas enfermedades. Hay muchas formas de ayudar a los pacientes a mejorar la memoria y aliviar los síntomas. Echemos un vistazo a algunos de estos métodos:

Primero, haz algo de ejercicio físico. Las investigaciones muestran que la actividad física mejora la circulación sanguínea en el cerebro y aumenta la liberación de sustancias químicas como la dopamina y las endorfinas, que ayudan a proteger y mejorar la función de las neuronas. Al mismo tiempo, el ejercicio también puede ayudar a reducir problemas como la ansiedad, la depresión y el insomnio, haciendo que los pacientes afronten la vida de forma más placentera.

En segundo lugar, mantener las relaciones sociales. También es muy importante que nuestras redes sociales estén estrechamente conectadas con áreas relacionadas del cerebro, y la interacción social no solo puede reducir el estrés, sino también mejorar la salud del cerebro al aumentar la felicidad, combatir la depresión y más.

Por último, come bien y duerme lo suficiente. Ambos aspectos pueden tener efectos importantes en la salud del cerebro. Una buena dieta no sólo debe incluir suficientes nutrientes, sino que también debe evitar el consumo repetido de demasiada azúcar, grasas saturadas y colesterol. Además, dormir lo suficiente puede ayudar a combatir los problemas de memoria en diversas etapas, especialmente enfermedades como el Alzheimer.

En definitiva, las enfermedades neurodegenerativas no implican renunciar a las expectativas de vida. Manteniendo una actitud positiva, también es necesario adoptar métodos científicos y eficaces para mejorar la calidad de vida. Más risas y más sol te ayudarán a mantenerte saludable. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche deserticola es un material medicinal tradicional chino que tiene muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de Cistanche deserticola proviene de los múltiples ingredientes activos que contiene, incluidos ácido tánico, polisacáridos, glucósidos flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro a través de una variedad de vías.

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Recientemente se ha identificado que la exposición prolongada a la contaminación del aire aumenta el riesgo de sufrir las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, pero no se comprenden bien los mecanismos moleculares por los que actúa.

Los embriones de pez cebra expuestos al extracto de partículas de escape de diésel (DEPe) provocan autofagia disfuncional y pérdida neuronal. Aquí, expusimos embriones de pez cebra a DEPe y realizamos análisis de expresión proteómica y transcriptómica de alto rendimiento de sus cerebros para identificar vías patógenas inducidas por la contaminación del aire. El tratamiento con DEPe alteró varios procesos biológicos y vías de señalización relevantes para los procesos neurodegenerativos, incluido el metabolismo xenobiótico, la maduración de los fagosomas y el procesamiento de amiloide. La mayor inducción de expresión génica en el cerebro se produjo en Cyp1A (más de 30- veces).

La relevancia de este cambio de expresión se confirmó bloqueando la inducción usando CRISPR/Cas9, lo que resultó en un aumento dramático en la sensibilidad a la toxicidad de DEPe, confirmando que la inducción de Cyp1A era un mecanismo protector compensatorio.

Estos estudios identificaron vías moleculares alteradas que pueden contribuir a la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos. En última instancia, determinar la base molecular de cómo la contaminación del aire aumenta el riesgo de neurodegeneración ayudará en el desarrollo de terapias modificadoras de enfermedades.

Palabras clave

Contaminación del aire · Demencia · Enfermedad de Parkinson · Enfermedad de Alzheimer · Transcriptómica · Proteómica.

Introducción

La contaminación del aire es un importante contribuyente a la mortalidad y está asociada con enfermedades respiratorias, enfermedades cardíacas, accidentes cerebrovasculares, cáncer de pulmón y diabetes. La evidencia epidemiológica emergente respalda un vínculo entre la exposición a la contaminación del aire y el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, incluidas las enfermedades de Alzheimer y Parkinson (EA y PD) (Fu et al. 2019). Hay escasez de investigaciones que investiguen los mecanismos por los cuales la contaminación del aire puede aumentar el riesgo de EA y EP, pero las pocas que existen apoyan una relación causal (Fu et al. 2019).

La acumulación de inclusiones de proteínas en el cerebro es una característica universal de los trastornos neurodegenerativos y probablemente sea una vía común que conduce a la disfunción neuronal y la muerte. Por ejemplo, la formación de estructuras beta-amiloide (A-beta) y tau son las características patológicas de la EA y los agregados de -sinucleína (-syn) o cuerpos de Lewy en la EP (Ross y Poirier 2004; Woulfe 2008).

Las alteraciones en la proteostasis parecen subyacer, al menos parcialmente, a la formación de estos agregados, pero los mecanismos precisos aún se desconocen y pueden variar en los individuos dependiendo de factores de riesgo genéticos y ambientales. Sabemos que una mayor expresión o una menor degradación de A-beta o -syn pueden provocar EA y EP (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Otras características comunes en los trastornos neurodegenerativos son la inflamación y el estrés oxidativo. La microglía activada, las células inflamatorias del SNC, puede apreciarse fácilmente en las autopsias de cerebros con EA y EP y probablemente contribuya a la patogénesis de la neurodegeneración (Kannarkat et al. 2013). Se cree que esta inflamación y posiblemente disfunción mitocondrial provoca estrés oxidativo, que también se aprecia en los cerebros sometidos a autopsias (Picca et al. 2020).

La mayoría de los estudios mecanicistas sobre la contaminación del aire y la neurodegeneración hasta la fecha se han centrado en la inflamación (Jayaraj et al. 2017). La contaminación del aire parece aumentar tanto la inflamación del SNC como el estrés oxidativo en el cerebro de animales y humanos (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a, b y c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw et al. 2017; Yokota et al.2013a, b).

De particular interés son los hallazgos de que la contaminación del aire aumenta la expresión de algunos genes inflamatorios en el bulbo olfatorio (OB) de los ratones, una región del cerebro donde la patología de la EP se observa muy temprano en la enfermedad (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a). . También se observó inflamación en los perros que vivían en áreas urbanas en comparación con los que vivían en áreas rurales, y los autores especularon que estos cambios se debían a los altos niveles de contaminación del aire (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Los mismos autores también sugirieron que -syn se acumulaba en los cerebros de las personas que vivían en las ciudades debido a la contaminación del aire (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). En un estudio reciente en un modelo de pez cebra, se informó que la exposición al DEPe causa neurotoxicidad y una disminución significativa en el número de neuronas al alterar la autofagia (Barnhill et al. 2020).

El DEPe contiene muchos de los componentes tóxicos de la contaminación del aire y se usa comúnmente para modelar la exposición en sistemas de cultivo celular (Costa et al. 2014; Hesterberg et al. 2010; Levesque et al. 2011b). La autofagia es un mecanismo intracelular esencial para la eliminación y erradicación de proteínas mal plegadas y orgánulos dañados.

De hecho, la actividad autofágica precisa es necesaria para la homeostasis celular, y la autofagia disfuncional en las neuronas conduce a una supervivencia alterada y a una neurodegeneración (Kesidou et al. 2013). Existen limitaciones claras en muchos de estos estudios, pero todos sugieren que la exposición a la contaminación del aire aumenta el riesgo de EA. y PD. Nuestra comprensión de los mecanismos por los cuales la contaminación aumenta este riesgo es limitada, pero las partículas ultrafinas y varios componentes de la contaminación del aire pueden ingresar al cerebro directamente a través del bulbo olfatorio o a través de los pulmones a través del torrente sanguíneo (Kilian y Kitazawa 2018).

Estas partículas están compuestas de un núcleo de carbono y compuestos adsorbidos como hidrocarburos aromáticos policíclicos, metales, nitratos, sulfatos y otros elementos y constituyen una proporción importante de los contaminantes del aire, especialmente en las zonas urbanas. Muchos de estos compuestos han estado implicados en el estrés oxidativo y celular. La toxicidad añade plausibilidad a una asociación causal entre la contaminación del aire y la neurodegeneración.

Las investigaciones multidisciplinarias detalladas, incluidos modelos celulares y animales, pueden brindar información sobre las causas de las enfermedades y dirigir enfoques terapéuticos futuros (Cannon y Greenamyre 2011). Entre los organismos modelo utilizados para estudios in vivo, Danio rerio (pez cebra) es un modelo poderoso para estudiar toxicología, genética molecular, toxicogenómica y descubrimiento de fármacos.

La mayoría de las vías biológicas están altamente conservadas en los vertebrados y la mayoría de los genes humanos funcionales tienen homólogos en el pez cebra (Vaz et al.2018). Además, los embriones de pez cebra se desarrollan rápida e independientemente, lo que permite el análisis en cualquier etapa de desarrollo deseada. Estas características, junto con la rápida reproducción y el bajo costo de cría, hacen del pez cebra un modelo favorable para estudiar los efectos tóxicos de la exposición ambiental.

Para comprender mejor los mecanismos moleculares detrás de la patogénesis de la enfermedad, se ha desarrollado una amplia gama de enfoques de elaboración de perfiles de expresión genética de alto rendimiento. La proteómica basada en espectrometría de masas y la secuenciación de ARN de alto rendimiento son particularmente prometedoras para identificar vías biológicas de interés. Estas técnicas han sido ampliamente utilizadas para comprender la respuesta de modelos celulares y animales a estímulos ambientales (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

En este estudio, hemos realizado análisis de expresión de los efectos del tratamiento con DEPe en los perfiles del proteoma y del transcriptoma dentro de las cabezas de embriones de pez cebra. El aislamiento de muestras de la cabeza, que está compuesta principalmente por tejido cerebral, permitió obtener perfiles más específicos de tejido y minimizar los defectos originados en otros tejidos. Aquí describimos la expresión genética alterada y los perfiles de proteínas en varias vías implicadas en la neurodegeneración en las cabezas de pez cebra expuestas a DEPe. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre los posibles mecanismos por los cuales la contaminación del aire aumenta el riesgo de EA y EP.

material y métodos

Tratamiento de peces y eliminación genética mediada por CRISPR/Cas9-

Todos los estudios fueron aprobados por el Comité de Derechos Animales de UCLA. Los peces cebra (AB) se criaron mediante estimulación luminosa durante 1 h y se incubaron un total de 200 huevos durante 24 h a 28 grados. Los embriones resultantes se descorionaron en pronasa (2 mg/ml) y se trataron con DEPe (Materiales de referencia estándar, NIST, Gaithersburg, MD) a una concentración final de 20 ug/ml o con vehículo hasta 5 días después de la fertilización (DPF).

Se seleccionó esta concentración porque provocaba la pérdida de neuronas como se informó anteriormente, pero sin una mortalidad significativa (Barnhillet al. 2020). El pez derribado Cyp1A se preparó de la siguiente manera. Utilizando herramientas disponibles en http://crispr.mit.edu, el ARN CRISPR (Cyp1A-crRNA ) se diseñó en función de la ubicación de sitios PAM adecuados en el primer exón del gen Cyp1A.

El mejor diseño se adquirió en IDT DNA (www.idtdna.com) junto con el ARNtracr CRISPR-Cas9 estándar. El ARNcr para el gen Cyp1A y el ARNtracr se resuspendieron por separado en Tris-EDTA 10 mM para producir una concentración final de 100 μM. Luego, el ARNtracr se combinó con ARNcr en tampón dúplex 1x (acetato de potasio 100 mM; HEPES 30 mM, pH 7,5; ADN IDT) para producir una concentración final de 10 µM. La mezcla se calentó a 95 grados durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo y se enfrió lentamente a temperatura ambiente para permitir la hibridación de las secuencias de nucleótidos complementarias de ARNcr y ARNtracr y la formación de ARN guía funcional (ARNg).

Luego se combinó un volumen de 3 μL de ARN recocido con el mismo volumen de ADN monocatenario de un donante (ADNss; 200 μM) como secuencia modelo para Cyp1A mutante. Se añadió a la mezcla una cantidad de 3 ug de nucleasa Cas9 (IDT) en tampón de inyección 1x (KCl 5 mM; fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,8) para formar los complejos finales CRISPR/ribonucleoproteína Cas9 (Cyp1A-RNP).

Para la preparación del Scramble RNP (SC-RNP), el Cyp1A-crRNA específico se sustituyó por un Scramble-crRNA comercial sin objetivo en el genoma. La secuencia de todos los oligonucleótidos utilizados en este trabajo se enumera en la Tabla complementaria 1. Se inyectaron huevos bajo un microscopio estereoscópico con aproximadamente 3 nL de mezcla de inyección de RNP.

Se realizaron cinco inyecciones biológicas replicadas (cada réplica incluía de 400 a 600 óvulos inyectados con Cyp1A-RNP y de 100 a 200 inyectados con SC-RNP), y todas las microinyecciones se completaron en 60 minutos. Los huevos se colocaron en placas de Petri de plástico de 100 mm y se incubaron a 28 grados en agua para huevos. La tasa de supervivencia de los embriones se controló durante hasta 7 días.

Se revisaron imágenes de peces supervivientes para detectar malformaciones. Cada larva se calificó de forma ciega para determinar la presencia de 4 malformaciones del desarrollo, incluidas malformación de la cabeza, malformación de la cola, edema cardíaco y edema vitelino. Las larvas con las 4 malformaciones recibirían una puntuación de 4, mientras que las larvas en desarrollo normal obtendrían una puntuación de 0. Se utilizó la prueba T estadística para evaluar las diferencias significativas.

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