La exposición a gases de escape diésel altera la expresión de las redes implicadas en la neurodegeneración del cerebro del pez cebra, parte 3
Mar 04, 2024
Los resultados de la comparación proteómica revelaron la regulación positiva (sobrerrepresentación) de ACTG2 (actina, gamma 2), CAT (catalasa), GSR (glutatión-disulfuroreductasa), GST (glutatión S-transferasa), HMOX1 (hemo oxigenasa 1) y PRDX1 (peroxiredoxina). 1), así como la regulación negativa de la enzima conjugadora de ubiquitina ubcM2, RAP1A (RAP1A, miembro de la familia RASoncogene), UBE2E3 (enzima conjugadora de ubiquitina E2 E3) y ACTA1 (actina, alfa 1).
La proteómica es una tecnología científica a gran escala que estudia los tipos, estructuras, cantidades y funciones de las proteínas en los organismos. En los últimos años, cada vez más estudios han demostrado que la proteómica está estrechamente relacionada con la memoria.
Los investigadores han descubierto que las proteínas del cerebro pueden afectar la señalización entre neuronas, afectando así actividades cognitivas como el aprendizaje y la memoria. Por ejemplo, la mayoría de las moléculas de proteínas necesarias para los procesos de codificación y almacenamiento de la memoria se sintetizan en las sinapsis. Estas moléculas proteicas no sólo participan directamente en la conducción y transducción de señales nerviosas, sino que también pueden afectar las conexiones sinápticas y su estabilidad entre las neuronas, afectando así a la generación y consolidación de la memoria.
La investigación también ha descubierto que ciertas proteínas desempeñan un papel crucial en el proceso de la memoria. Por ejemplo, la proteína quinasa CaMKII en las neuronas regula la fuerza y la estabilidad de las conexiones sinápticas y desempeña un papel importante en el aprendizaje y la memoria. Otra proteína importante es el BDNF, que puede promover el crecimiento de las neuronas, el fortalecimiento sináptico y la supervivencia neuronal, mejorando así la consolidación y el mantenimiento de la memoria.
Además, algunos estudios han encontrado que la salud física y la dieta también tienen efectos significativos sobre la proteómica y la memoria. El sueño adecuado, el ejercicio adecuado y una dieta baja en grasas y alta en proteínas pueden promover la síntesis y reparación de proteínas, lo que es beneficioso para mejorar la memoria y las capacidades cognitivas.
En resumen, la proteómica y la memoria están estrechamente vinculadas. Los científicos que estudian las ciencias biológicas descubren cada vez más cómo modular el proteoma para mejorar la memoria y prevenir tratamientos para trastornos cognitivos como la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, debemos prestar atención a los resultados de la investigación científica y mantener buenos hábitos de alimentación, vida y ejercicio para mantener un cerebro sano y fuerte y tener una mejor memoria. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche deserticola también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.
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Entre ellos, la regulación negativa de ubcM2, un inhibidor de Nrf2, puede conducir a una mayor actividad de esta vía. Dado que los diferentes componentes del citoesqueleto (ACTG2 y ACTA1) se comportan de manera diferencial y considerando la falta de expresión diferencial significativa en Nrf2 o Keap1, se puede concluir que la exposición a DEPe puede inducir el reordenamiento del citoesqueleto (a favor de la translocación de Nrf2 al núcleo) y la activación del Vía Nrf2 indirectamente a través de estímulos de estrés oxidativo (Fig. 4).
Estos hallazgos están bien respaldados por nuestro análisis transcriptómico, que muestra la regulación positiva de PRDX, GSR y GST (genes posteriores). Sin embargo, el análisis del transcriptoma detalló además que c-Fos y FRA1 (dos inhibidores de Nrf2 nuclear) están significativamente regulados a la baja y, por lo tanto, permiten una mayor actividad de Nrf2 durante el tratamiento con DEPe.
Maduración del fagosoma
La maduración del fagosoma facilita el tráfico de partículas internalizadas hacia una serie de estructuras subcelulares unidas a membranas cada vez más acidificadas, lo que resulta en la degradación de las partículas. Después de sellar o escindir la membrana superficial, el fagosoma se fusiona con endosomas tempranos, endosomas tardíos y lisosomas, acompañado de importantes cambios acidificantes en su composición, convirtiéndolo en un medio oxidativo y degradativo.
El movimiento del fagosoma se produce en función de la unión de proteínas citoesqueléticas(microtúbulos), lo que lleva a la fusión de endosomas y lisosomas secuencialmente de manera dinámica (Gotthardt et al. 2002). Durante la maduración, la GTPasa Rab5 impulsa la fusión de los endosomas tempranos mediante la interacción con varias moléculas, incluido el antígeno 1 del endosoma temprano (EEA1), el complejo VPSS34 y las proteínas SNARE.
Además, la acidificación ocurre simultáneamente a través de vATPasa (una bomba de protones vacuolar) que transloca H+ a través de la membrana y acidifica aún más la luz (Desjardins et al. 1994).
Aunque no se encontró una participación significativa de esta vía a nivel transcriptómico, nuestro análisis proteómico muestra una regulación negativa de ATP6V1A (subunidad A transportadora de ATPasa H+V1), ATP6V1E1, ATP1B2B, ATP1B3A, ATP6V1F, DYNLRB1 (bloqueo de ruta de cadena ligera de dineína tipo 1), TUBA1C (tubulina alfa 1c), TUBB2A, TUBB4A y VAMP2 (proteína 2 de membrana asociada a vesículas), que sugieren que el tratamiento con DEPe puede conducir a una menor actividad de maduración del fagosoma o a una alteración del pH lisosomal (Fig. 4). Esto es consistente con nuestro informe reciente de que la exposición a DEPe da como resultado un menor flujo autofágico neuronal y sugiere un mecanismo subyacente a la toxicidad neuronal de la contaminación del aire (Barnhill et al.2020).
Procesamiento de amiloide
Las placas amiloides son características distintivas de las lesiones cerebrales neuropatológicas en la EA y la EP con demencia. Estas estructuras están compuestas de péptido A-beta, que es fundamental para la fisiopatología de la EA (Sadigh Eteghad et al. 2015).
La beta amiloide se procesa mediante el complejo gamma-secretasa (Presenilin1/2) y la beta-secretasa (BACE1) de la proteína amiloide transmembrana tipo 1 (APP). Se sabe que la entrada anormal de Ca2+ conduce a la activación aberrante de calpaína, que desempeña un papel en la fosforilación de la proteína Tau asociada a microtúbulos a través de la vía CDK5.
Además, el estrés oxidativo asociado con la acumulación de A-beta contribuye a la activación de varias quinasas, incluidas las MAP quinasas, lo que resulta en la fosforilación de tau. La hiperfosforilación patológica de tau tiene un papel esencial en la desestabilización de los microtúbulos (Sadigh-Eteghad et al. 2015 ). Estos cambios son particularmente relevantes para la patogénesis de la EA y la EP y podrían ser un factor que contribuya a cómo la contaminación del aire aumenta el riesgo.
Nuestros análisis de expresión sugieren un impacto desestabilizador de DEPe en los reguladores del procesamiento de amiloide, ya que tres reguladores, incluidos CAPNS1 (subunidad pequeña 1 de calpaína), MARK1 (quinasa 1 reguladora de la afinidad de los microtúbulos) y PRKAR1B (subunidad beta reguladora de tipo I dependiente de quinasecAMP de proteína) estaban regulados negativamente en el nivel de proteínas (Fig. 4).
Disfunción mitocondrial
Como principales consumidores de oxígeno en una célula, las mitocondrias contienen una multitud de transportadores redox para transferir electrones al oxígeno, lo que da como resultado la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS).
Estos orgánulos contienen un sistema de defensa antioxidante para desintoxicar los ROS y evitar el daño oxidativo a otros componentes celulares. La exposición a DEPe provocó cambios en la expresión de proteínas clave que probablemente provocaron disfunción mitocondrial. Como se muestra en la Fig. 4, hay una disminución significativa en el nivel de proteína de ATP sintasa (ATP5F1D, ATP5mea), citocromo c oxidasa (COX7A2), NADH deshidrogenasa (NDUFA10, NDUFS8), 2-oxoglutarato deshidrogenasa (OGDH), y la subunidad 2 del complejo citocromo b-c1 (UQCRC2) que desempeñan funciones fundamentales en el transporte de electrones.
Esto podría alterar la producción de ATP y también provocar directamente una elevada producción de ROS y toxicidad. Se ha propuesto que la disfunción mitocondrial contribuye a la patogénesis de la EA y la EP y, como ocurre con algunas de las vías antes mencionadas, la contaminación del aire podría alterar el riesgo al alterar la función de este orgánulo crítico.
Señalización de guía axonal
La formación de conexiones neuronales requiere la extensión de axones que migran hacia sus objetivos sinápticos. En el borde de ataque del axón, el cono de crecimiento axonal contiene receptores con la capacidad de detectar señales de guía atractivas y repulsivas que son necesarias para la navegación del axón.
Además de BMP, Shh y Wnt (que se han implicado recientemente en la guía axonal), existen al menos cuatro grupos principales de señales de guía: (i) netrinas y receptores DCC/UNC-5; (ii) Receptores de plexina, semaforinas y neuropilina; (iii) Rendijas y receptores Robo; y (iv) Efrinas y receptores Eph. Estas proteínas pueden secretarse y asociarse con la matriz extracelular (Slits, Netrins y algunas semaforinas) o anclarse a la superficie celular (Ephrins y algunas otras semaforinas) (Stoeckli 2018). El tratamiento con DEPe afecta varios aspectos de la guía axonal.
A nivel de proteínas, varios factores y reguladores importantes se alteraron durante el tratamiento. La representación excesiva de PLXNB2 (plexina B2) y la representación insuficiente de varias proteínas, incluida ARHGEF11 (factor de intercambio de nucleótidos de guanina Rho 11), CHMP1A (proteína corporal multivesicular cargada 1A), COPS5 (subunidad 5 del señalosoma COP9), GNAT1 (subunidad alfa transducina 1 de la proteína G), GNAT2. (Subunidad de proteína G alfa transducina 2), GNB5 (subunidad de proteína G beta 5), MYL1 (cadena ligera de miosina 1), MYL2 (cadena ligera de miosina 2), NCK1 (proteína adaptadora 1), PLXNA1 (plexina A1), PRKAR1B (proteína quinasa Subunidad beta reguladora tipo I dependiente de AMPc), RAC3 (pequeña GTPasa 3 de la familia Rac), RAP1A (un miembro de la familia de oncogenes RAS), SHANK2 (SH3 y múltiples dominios repetidos de anquirina 2), TUBA1C (tubulina alfa 1c), TUBB2A (tubulina beta 2A clase IIa ) y TUBB4A (tubulina beta 4A clase Iva) sugieren un deterioro significativo de la guía del axón en el embrión en desarrollo (Tabla complementaria 5).
Curiosamente, la vía de guía axonal no se vio afectada significativamente a nivel transcriptómico, lo que sugiere que la participación de esta vía puede ser un resultado posterior a través del cual algunas de las proteínas efectoras/reguladoras se han degradado.
Los cambios en las vías de guía axonal descritas aquí podrían reflejar vías neurotóxicas relevantes para la EA y la EP o simplemente reflejar una interferencia del desarrollo neuronal en los embriones en desarrollo. El análisis de los perfiles de expresión en adultos expuestos a DEPe ayudaría a resolver esta cuestión.
Otros caminos
Nuestros análisis proteómicos y transcriptómicos también demostraron la participación de varias vías y rutas metabólicas, incluida la degradación de la melatonina, el ritmo circadiano, la señalización de la unión entre células de Sertoli y las células de Sertoli, la señalización de la unión epitelial adherente, el metabolismo II de la hormona tiroidea (mediante conjugación y/o degradación), la señalización de RhoA, la inosina. Biosíntesis II de -5′-fosfato, vía de señalización GP6, señalización RhoGDI, vía de activación extrínseca de la protrombina y sistema de coagulación. Muchos de estos cambios podrían reflejar alteraciones debidas a la interrupción del desarrollo.
Por ejemplo, los análisis proteómicos y transcriptómicos revelaron que la vía de fototransducción tiene los mayores cambios en expresión tras el tratamiento con DEPe. Como se muestra en la Tabla complementaria 5, varios genes, incluidos Opsin, GRK, S-arrestin, Transducin-, Transducin-, PDC y GUCA, tienen un nivel atenuado de transcripción debido a la exposición a DEPe. Debido a la falta de evidencia de inducción de algún elemento en esta vía, el tratamiento con DEPe parece perjudicar el desarrollo del sistema visual. Esto es consistente con nuestra observación de que los ojos nunca se desarrollaron completamente y son pequeños después del tratamiento.
Evaluación funcional
En este informe, la importante regulación positiva del citocromo P450 (Cyp1A) fue el efecto más destacado de la exposición al DEPe. Cyp1A metaboliza muchos compuestos endógenos y exógenos y una mayor expresión en el cerebro puede proteger contra la toxicidad o contribuir a ella. Para comprender mejor el papel de Cyp1A en la toxicidad de DEPe, utilizamos CRISPR/Cas9 para generar un modelo de eliminación de Cyp1A. Dado que es probable que el procedimiento de edición de genes en el pez cebra sea un proceso parcial que dé como resultado embriones en mosaico, utilizamos el término "knockdown" (KD) en lugar de "knockout". Utilizando un ARN guía de secuencia específica, convertimos el primer sitio CCA PAM en un codonina TGA (de parada) en el primer exón de Cyp1A. Alternativamente se utilizó un ARN guía no objetivo como control de codificación (SC).
Luego se aisló el ARN total de las cabezas de hasta 20 embriones KD y SC (5 pdf) y se validó la eficiencia de la eliminación mediante análisis qPCR. De manera similar a lo que se observó en el estudio RNA-Seq de alto rendimiento, este experimento demostró una fuerte inducción (30,{4}} veces desde el valor inicial) de Cyp1A tras el tratamiento con DEPe en los embriones SC, mientras que los embriones KD carecieron de tal aumento en la expresión ( Figura 5a).
La supervivencia de seis grupos de embriones durante un 7-curso diurno (n mayor o igual a 40) se muestra en la Fig. 5b. Brevemente, a 7pdf, la supervivencia promedio fue 89,1%, 74,4%, 79,4%, 68,5%, 48,8% y 7,6% para WT/DMSO, WT/DEPe, SC/DMSO, SC/DEPe, KD/DMSO y KD/DEPe, respectivamente. Por lo tanto, la KD de Cyp1A resultó en una supervivencia reducida, pero se redujo drásticamente en los peces tratados con DEPe en comparación con los controles.
Además, la KD también resultó en una tasa significativamente mayor de malformaciones morfológicas (Fig. 5c). Por tanto, la inducción de la expresión de Cyp1A por DEPe parece ser un mecanismo compensatorio protector. Una limitación significativa de nuestros hallazgos es que medimos la inducción de la expresión de Cyp1A en los cerebros del pez cebra, pero KDexperiments redujo la expresión en todo el embrión.
Importancia e implicaciones para las enfermedades neurodegenerativas.
Se sabe que la contaminación del aire afecta negativamente la calidad de vida y desempeña un papel importante en el desarrollo de enfermedades humanas y animales. Utilizando análisis de expresión de alto rendimiento, demostramos que el tratamiento con DEPe alteró varios procesos biológicos y vías de señalización en las cabezas de los embriones de pez cebra. Las alteraciones en la formación de fagosomas, el procesamiento de amiloide y la función mitocondrial son particularmente relevantes para la neurodegeneración.
Sorprendentemente, nuestros resultados no indicaron ninguna participación clara de la inflamación, que se ha planteado la hipótesis de que desempeña un papel importante en la toxicidad de la contaminación del aire. Es probable que esto se deba a que medimos la expresión solo en las cabezas de 5-pez cebra de un día y no en todo el cuerpo. Estos estudios pretendían determinar cómo el cerebro se ve afectado por la exposición al DEPe.
El cerebro contiene microglía, que probablemente sea activada por DEPe, pero componen una fracción tan pequeña de las células del cerebro que cualquier cambio puede ser indetectable. Además, la microglía no está presente ni funcionando en el cerebro de las larvas en desarrollo hasta las 3-5 pdf. Debido a esto, la exposición temprana puede no ser la más relevante para estudiar las respuestas inflamatorias. La inducción del metabolismo xenobiótico probablemente también sea relevante como respuesta compensatoria o protectora a la contaminación del aire.
Nuestro modelo Cyp1AKD validó el papel protector de esta vía y representa un excelente ejemplo de cómo los estudios de expresión pueden proporcionar pistas importantes para determinar los mecanismos de sustancias tóxicas como la contaminación del aire. No se sabe si los polimorfismos en el gen Cyp1A alteran el riesgo de EA o EP en humanos expuestos a la contaminación del aire, pero estos resultados sugieren una posible interacción gen-ambiente y merecen más investigación.
Una cuestión importante a abordar es la relevancia de la exposición del DEPe a la contaminación del aire. DEPe es la mezcla más común utilizada en la investigación de la contaminación del aire para cultivos celulares y otros modelos que no son compatibles con cámaras de inhalación. Los extractos de DEP en diclorometano contienen restos hidrofóbicos, como los HAP, que tienen más probabilidades de ingresar al torrente sanguíneo y bioacumularse en el cerebro. Un estudio reciente determinó la concentración de varios HAP en cerebros de autopsias humanas y encontró que contenían concentraciones de HAP muy similares a las utilizadas en los estudios presentados aquí (Pastor-Belda et al. 2019). Por lo tanto, las exposiciones a los cerebros de pez cebra son muy relevantes, ya que contienen HAP y otras fracciones que se ha observado que se bioacumulan en el cerebro humano.
Agradecimientos Agradecemos a las siguientes agencias por financiar este trabajo: The Levine Foundation (JMB), subvenciones del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, NIEHST32ES015457 (LMB, SK) y The Parkinson's Alliance (JMB).
Contribución de los autores Concepción y diseño del estudio (MSJ, LMB, JMB); Adquisición de datos (MSJ, HM, LMB, SL): Análisis e interpretación de datos (MSJ, LMB, JMB); Redactar el artículo o revisarlo críticamente en busca de contenido intelectual importante (MSJ, HM, LMB, JMB).
Financiamiento Estos estudios fueron apoyados por la Fundación Levine (JMB), subvenciones del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, NIEHS T32ES015457 (LMB, SK) y The Parkinson's Alliance (JMB).
Disponibilidad de datos Todos los datos están disponibles en nuestros archivos complementarios.
Declaraciones
Aprobación ética Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de UCLA.
Consentimiento para publicación Todos los autores aprueban este envío para publicación.
Intereses en competencia Los autores declaran no tener intereses en competencia.
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