Diferencias en la composición y eficacia medicinal de los productos crudos y del vino elaborado al vapor de Cistanches Herba

Abstracto:

ObjetivoComparar los cambios en la composición química y la eficacia medicinal del Roucongrong (Cistanches Herba) antes y después del procesamiento, para aclarar el principio de guisado con vino.

Métodos Se aplicó LC-MS para identificar los tipos de composición química antes y después de la preparación de Cistanches Herba, combinado con análisis estadístico multivariado para encontrar la disparidad en los componentes antes y después de guisar con vino. La diferencia de eficacia se demostró mediante el modelo de rata de deficiencia de cortisona hidrogenada en el riñón yang.

ResultadosSe identificaron un total de 45 componentes químicos a partir deMuestras de Cistanches Herba; Los compuestos contribuyeron a las diferencias entreCistanches Herba y Cistanches Herba guisados ​​al vinosonechinacósido, verbascósido, isoacteósido y tubulosido B; El extracto total de glucósidos feniletanoides de Cistanches Herba tiene un mejor efecto en la mejora de modelos de rata con deficiencia de yang renal que Cistanches Herba guisado con vino. Conclusión La composición de Cistanche cambia después de ser guisado con vino y se ha potenciado el efecto sobre la deficiencia de yang del riñón. Los ingredientes de transformación de Cistanches Herba guisados ​​con vino Cistanches Herbato pueden ser ingredientes activos que refuerzan el riñón y apoyan el yang.

Palabras clave: Cistanches Herba; Cistanches Herba guisados ​​al vino;deficiencia de yang del riñón;echinacósido;verbascósido; isoacteósido; tubulosido B

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Se le conoce como "ginseng" y se distribuye principalmente en Mongolia Interior, Ningxia (Azuqi), Gansu (Changma), Xinjiang y otras regiones [1]. Cistanche es de naturaleza cálida, de sabor dulce y salado, y ingresa a los meridianos del riñón y del intestino grueso. Tiene los efectos de nutrir el hígado y los riñones, beneficiar la esencia y la sangre, humedecer los intestinos y aliviar el estreñimiento. Puede utilizarse para la deficiencia de yang del riñón, la impotencia y la infertilidad, el dolor de cintura y las rodillas, la debilidad de los músculos y los huesos, la sequedad intestinal y el estreñimiento [2]. Las investigaciones modernas muestran que los tallos carnosos con hojas de escamas de Cistanche contienen principalmente una variedad de componentes químicos como glucósidos de feniletanol, terpenos de éter de ciclopentano y sus glucósidos, lignanos, azúcares, etc. [3], y tienen múltiples efectos farmacológicos comoantienvejecimiento,antioxidante,anti-demencia,antifatiga, humedeciendo los intestinos y aliviando el estreñimiento [4].

Después de ser guisado con vino, se potencia el efecto tonificante de los riñones y potenciador del yang de Cistanche. El principio de procesamiento no se ha explicado claramente. Fan Yanan et al. [5-7] estudió los efectos de Cistanche sobre la defecación de ratas, la función inmune, los neurotransmisores entéricos y las expresiones genéticas relacionadas antes y después del procesamiento. Da et al. utilizó la influencia de los glucósidos de feniletanol antes y después del procesamiento para explicar su principio de procesamiento; Zhang Chao et al. [8] utilizaron los cambios en el contenido de glucósidos de feniletanol antes y después del procesamiento para explicar el principio de procesamiento; Zhang Shuyun et al. [9] utilizaron los cambios en el contenido de betaína antes y después del procesamiento para explicar el efecto del procesamiento en Cistanche. La literatura existente sobre el procesamiento de Cistanche se centra principalmente en la farmacología, y la investigación sobre los componentes también se centra en los cambios en el contenido de componentes específicos, careciendo de un estudio sistemático de las diferencias entre los componentes. Este experimento utilizó tecnología de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) combinada con análisis estadístico multivariado para identificar los componentes químicos en Cistanche, para encontrar los marcadores de diferencia entre Cistanche crudo y productos guisados ​​con vino, y para estudiar la diferencia en la eficacia de Cistanche crudo y productos guisados ​​con vino a través de un modelo de rata de deficiencia de yang renal inducida por hidrocortisona, para explicar la base material deCistanche para tonificar el riñón y promover el yang.y el principio de elaboración del Cistanche guisado con vino.

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1 Materiales

1.1 Instrumentos

Espectrómetro de masas de alta resolución con trampa de iones en tándem de campo electrostático Ultimate 3000 UPLC-LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), estación de trabajo Theraio Xcaliber; Balanza electrónica BT125D 1/100000 (Sartorius Instrument System, Alemania); Limpiador ultrasónico CNC KQ500DE (Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); dispersor de alta velocidad XHF-D (Guangzhou Hu Ruiming Instrument Co., Ltd.); lector de microplacas Multiskan FC (Thermo Scientific); Centrífuga de alta velocidad HC-3518 (Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., Ltd.); BW-YLS-1B registrador multifuncional de actividad voluntaria de ratas (Shanghai Ruanlong Technology Development Co., Ltd.).

1.2 Drogas

Metanol de calidad para espectrometría de masas (Fisher); ácido fórmico de grado de espectrometría de masas (fracción de masa 99%, Sigma Aldrich); agua (agua destilada Watsons); Pastillas Jinkui Shenqi (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd. Pharmaceutical Factory, número de lote 1701653); sal sódica de succinato de hidrocortisona (Tianjin Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., número de lote 011705067); el kit de superóxido dismutasa (SOD) (número de lote 20170115) y el kit de malondialdehído (MDA) (número de lote 20170117) se adquirieron de Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.; La testosterona (T) y el estradiol (E2) se determinaron en el Centro de Inspección de Calidad Kechuang de Qingdao, y la creatinina (CREA) y el nitrógeno ureico en sangre (BUN) se determinaron en el Centro de Análisis y Pruebas de la Universidad Médica de Mongolia Interior.

1.3 animales

Se compraron 100 ratas SD macho, que pesaban 180-200 g, de la granja de animales experimental Xinglong en el distrito de Haidian, Beijing, número de licencia: SCXK (Beijing) 2016-0003. Este experimento con animales ha sido aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina China de Beijing, número de ética: BUCM-4-2022091301-3095.

1.4 Muestras

Seis lotes de Cistanche deserticola fueron identificados como auténticos por el profesor Li Xiangri de la Facultad de Medicina China de la Universidad de Medicina China de Beijing, y se derivaron de tallos carnosos secos con hojas de escamas de Cistanche deserticola YC Ma, una planta de la familia Orobanchaceae. La información detallada sobre las muestras se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 Ficha informativa de muestras de Cistanches Herba

2 métodos

2.1 Preparación de muestras

2.1.1 Preparación de los productos crudos Tomar Cistanche deserticola limpia, ablandarla, cortarla en rodajas gruesas y secarla.

2.1.2 Preparación de productos guisados ​​con vino.

Tomar 100 g de rodajas de Cistanche deserticola, añadir 30 ml de vino de arroz, mezclar bien y cocer a fuego lento hasta que se absorba el vino. Se cuece en agua durante 12 h, se saca, se deja enfriar un poco y se seca. Consulte la Figura 1 para ver muestras de Cistanche deserticola cruda y de Cistanche deserticola guisada con vino.

2.2 Estudio sobre la diferencia de componentes de Cistanche deserticola antes y después de guisado en vino

2.2.1 Preparación de la solución

Tomar aproximadamente {{0}}.2 g de muestra seca en polvo (pasada a través de un 65-tamiz de malla), pesar con precisión, colocar en un matraz volumétrico marrón de 50 ml, agregar 25 ml de metanol al 50 %. solución acuosa, sellar herméticamente, pesar la masa, remojar durante 30 minutos, tratar ultrasónicamente durante 40 minutos (potencia 250 W, frecuencia 35 kHz), enfriar, pesar nuevamente, agregar una solución acuosa de metanol al 50 % para compensar la masa perdida, agitar Bueno, dejar reposar, filtrar el sobrenadante a través de una membrana filtrante microporosa de 0,22 μm, y colocar el filtrado en una botella de fase líquida de color marrón para obtener la solución.

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2.2.2 Condiciones cromatográficas

Columna cromatográfica Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (100 mm x 2,1 mm, 1,7 μm), temperatura de la columna de 35 grados; temperatura de la cámara de muestra de 10 grados, volumen de inyección de muestra de 3 μL, metanol (A)-0.Solución acuosa de ácido fórmico al 1% (B) como fase móvil, elución en gradiente: 0-4 min, 10%{ {13}}% de metanol; 4-18 min, 26 %-40 % de metanol; 18-24 min, 40 %-100 % de metanol; 24-28 min, 100 % metanol. El caudal volumétrico fue de 0,3 ml/min y la longitud de onda de detección fue de 330 nm.

2.2.3 Condiciones de espectrometría de masas

Se utilizó una fuente de ionización por electropulverización (ESI), escaneo en modo de iones negativos, la temperatura capilar fue de 350 grados, el caudal volumétrico del gas envolvente fue de 30 arb, el caudal volumétrico del gas auxiliar fue de 10 arb, el voltaje de pulverización fue de 3

KV, el voltaje capilar fue −35 V, el voltaje de la lente del tubo fue −110 V, el rango de escaneo fue m/z 100-1 000, el sistema de recolección de datos fue Xcalibur 2.1.

2.2.4 Análisis de componentes principales (PCA)

Después de obtener la matriz bidimensional de pares de datos precisos de tiempo de retención de masa, el panel de instrumentos mostrará toda la información precisa del tiempo de retención importada automáticamente y se utilizará el método PCA del módulo de estadísticas extendidas para el análisis.

2.2.5 Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) El LCMS combina la alta separación de la cromatografía líquida con la alta sensibilidad de la espectrometría de masas. Los datos recopilados son bastante grandes y se requiere un análisis estadístico multivariado para procesarlos. OPLS-DA divide los datos en dos grupos y utiliza un modelo estadístico supervisado para obtener una gran cantidad de espectros ortogonalizados, que muestran claramente las diferencias entre los dos grupos de muestras. En el formato de gráfico S de figura adicional, cada punto representa un par de datos de tiempo de retención de masa preciso, el eje X representa la variable, cuanto más lejos esté el punto de datos del punto cero, mayor será la contribución del punto a la diferencia de la muestra. ; el eje Y representa la correlación entre muestras en el mismo grupo de muestras; cuanto más lejos esté el par de datos precisos de masa y tiempo de retención del punto cero, más fuerte será la correlación. Por lo tanto, los pares de datos de tiempo de retención con precisión de masa en ambos extremos de la curva en forma de S representan los iones característicos más confiables de cada grupo de muestra.

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2.2.6 Análisis de la estructura por espectrometría de masas

Después de obtener los iones característicos, la composición del elemento y la combinación de compuestos se realizaron calculando la masa molecular relativa precisa y combinando la base de datos existente y la literatura relevante para identificar los componentes diferenciales.

2.3 Estudio sobre la diferencia de eficacia antes y después de guisar con vino

2.3.1 Preparación del extracto de Cistanche deserticola

Cistanche deserticola (número de lote 160901) y el correspondiente polvo de Cistanche deserticola guisado con vino se extrajeron de acuerdo con las condiciones indicadas en "2.2.1", se filtraron después de un tratamiento ultrasónico, se repitió dos veces, el filtrado se combinó, se concentró mediante destilación al vacío y se congeló. seco.

2.3.2 Agrupación de experimentos con animales y administración de fármacos.

Fig. 1 Cistanches Herba A y Cistanches Herba B guisados ​​en vino

(1) Agrupación: las ratas tuvieron libre acceso al agua y a la dieta. Después de 1 semana de alimentación adaptativa, se dividieron aleatoriamente en 5 grupos (Tabla 2), con 10 ratas en cada grupo, a saber, grupo normal, grupo modelo, grupo Cistanche deserticola cruda (PR), grupo Cistanche deserticola guisada con vino (PW). y control positivo del grupo de píldoras Jinkui Shenqi (JK). (2) Modelado: excepto el grupo normal, a los otros cuatro grupos se les inyectó succinato sódico de hidrocortisona por vía intramuscular, con una dosis de 20 mg/kg, durante 14 días consecutivos. Al grupo normal se le inyectó la misma dosis de solución salina normal. Se observó el estado general de las ratas de cada grupo para determinar si presentaban síntomas como miedo al frío, preferencia por el calor, extremidades frías, orina clara y larga, espalda enroscada y arqueada, cabello opaco y desordenado y depresión mental. Al mismo tiempo, se midieron el peso corporal, el número de actividades espontáneas, la ingesta de alimentos, la ingesta de agua, la diuresis y otros indicadores de las ratas de cada grupo.

(3) Administración: La dosis en ratas se calculó en función de la dosis clínica de Jinkui Shenqi Pills y Cistanche deserticola. La dosis de cada grupo de Cistanche deserticola fue de 1,80 g/kg en términos de cantidad de fármaco crudo. La dosis específica se muestra en la Tabla 2. Cada extracto de Cistanche deserticola y Jinkui Shenqi Pills se prepararon en soluciones de una cierta concentración con agua desionizada. La solución se administró por vía intragástrica todos los días con un volumen intragástrico de 10 ml/kg durante 30 días consecutivos. Al grupo normal y al grupo modelo se les administró por vía intragástrica un volumen igual de agua desionizada todos los días. El peso corporal se midió semanalmente y el volumen intragástrico se ajustó de acuerdo con el peso corporal de las ratas. Después de la administración, las ratas permanecieron en ayunas durante 12 h. Después de la anestesia con pentobarbital, se extrajo sangre de la aorta abdominal para la detección del índice sérico. Se extirparon los riñones, los testículos, el epidídimo, las vesículas seminales y la próstata para la detección del índice relevante.