Diferente cronotoxicidad renal del bromobenceno y sus metabolitos intermedios en ratones

Se sabe que el bromobenceno (BB) representa una grave amenaza para la salud humana. Anteriormente demostramos que BB mostró cronotoxicidad, es decir, fluctuaciones diarias en la gravedad de la hepatotoxicidad inducida en ratones. Aunque BB mostró una nefrotoxicidad leve, no se observó una fluctuación diaria en esta toxicidad. Esto podría atribuirse al hecho de que la cronotoxicidad inducida por BB se observa solo en el hígado y no en elriñonesy que el daño causado por BB es prominente en el hígado, enmascarando la fluctuación diaria de la nefrotoxicidad. Para confirmar estas dos posibilidades, examinamos las fluctuaciones diarias en la nefrotoxicidad debida a los metabolitos intermedios de BB que se dirigen alriñones: 3-bromofenol, bromohidroquinona y 4-bromocatecol. A los ratones se les inyectó 3-bromofenol, bromohidroquinona o 4-bromocatecol por vía intraperitoneal en seis puntos de tiempo diferentes en un día (tiempo zeitgeber (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 o ZT22). Se controló la mortalidad durante 7 días después de la inyección. Los ratones fueron más sensibles a la toxicidad aguda de estos metabolitos alrededor de la exposición ZT14 (fase oscura) que alrededor de la exposición ZT2 (fase clara). Además, los ratones a los que se les administró una dosis no letal de 4-bromocatecol mostraron aumentos significativos en los niveles de nitrógeno ureico en sangre en plasma yrenalmalondialdehído en la exposición ZT14. Además, la glutatión peroxidasa-4, un indicador de ferroptosis, se atenuó con la exposición a ZT14. Estos resultados indican que la toxicidad de los metabolitos de BB fue mayor durante la exposición en la fase oscura y demuestran que la razón por la cual la variación diurna de la nefrotoxicidad por BB no se observó en nuestro informe anterior es querenaldañofue enmascarado debido a daño hepático severo.

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Palabras clave bromobenceno; variación diurna; ritmo circadiano; cronotoxicidad;riñón

INTRODUCCIÓN

El bromobenceno (BB) es un reactivo industrial general que suele utilizarse como materia prima para la síntesis de productos farmacéuticos, colorantes y pesticidas.1,2) El BB es un contaminante orgánico que daña el medio ambiente natural y representa una grave amenaza para la salud humana. . Un estudio afirma que BB induce hepatotoxicidad severa y leverenaltoxicidad en ratones.3) Aunque el propio BB, una forma sin metabolitos, posee baja toxicidad, sus metabolitos intermedios tienen efectos tóxicos en el hígado yriñones. Los CYP450 hepáticos, como CYP1A2, CYP1B1 y CYP2E1, metabolizan BB a cuatro metabolitos: 3-bromofenol (3-BrP), bromohidroquinona (BrHQ), 4-bromocatecol (4- BrC) y BB-3,4-óxido. El óxido de BB-3,4- exhibe una alta hepatotoxicidad y los otros metabolitos muestran nefrotoxicidad,4–6), lo que indica que estos metabolitos tienen diferentes órganos diana.

En este estudio, nos enfocamos en la "cronotoxicología", ya que sugerimos previamente la relación entre el momento de la administración y la gravedad de la toxicidad de los productos químicos. 7-9) Nuestro estudio anterior demostró fluctuaciones diarias notables en la gravedad de las respuestas tóxicas a BB en ratones, es decir , los ratones fueron más tolerantes a la lesión hepática inducida por BB durante la exposición en la fase oscura (2:00) que durante la exposición en la fase luminosa (14:00).8) Aunque BB mostró una nefrotoxicidad leve , no se observó cronotoxicidad en elriñones. Por lo tanto, la cronotoxicidad inducida por BB posiblemente se observó solo en el hígado y no en elriñones. En nuestro estudio anterior, la estreptomicina, un antibiótico conocido por inducir nefrotoxicidad definida, mostró una clara variación diurna en la nefrotoxicidad inducida en ratones.9) Con base en los datos disponibles, planteamos la hipótesis de que la cronotoxicidad causada por BB es prominente en el hígado y no en lariñones, enmascarando así la cronotoxicidad en este último órgano. Los metabolitos de BB generados a través de diversas vías metabólicas se presentan en bajas concentraciones y, por lo tanto, pueden contribuir a un daño renal insignificante; debido a esto, la nefrotoxicidad inducida por el metabolito BB no puede estimarse clínicamente. En este estudio, examinamos la variación diurna en la nefrotoxicidad de los metabolitos intermedios de BB: 3-BrP, BrHQ y 4-BrC (Fig. 1).

MATERIALES Y MÉTODOS

Tratamiento de animales

Se compraron ratones macho ICR de Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japón) y se mantuvieron en condiciones estándar de temperatura controlada (24 ± 1 grado), humedad (55 ± 5 por ciento) y luz (12:12-h ciclos de luz/oscuridad, encendido de luces a las 08: 00), con libre acceso a agua y comida. Los tratamientos experimentales se realizaron con animales de 7-semanas de edad. Después de completar los experimentos, los ratones supervivientes se sacrificaron usando pentobarbital. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Experimentación y Cuidado Animal de la Universidad Kinjo Gakuin.

Protocolo experimental

Para el ensayo de mortalidad, ratones ICR macho de {{0}}semanas de edad recibieron una única inyección intraperitoneal (ip) de 500 mg/kg de 3-BrP, 180 mg/kg de BrHQ, o 220 mg/kg de 4-BrC (a un volumen de 0,1 ml/10 g de peso corporal; Tokyo Kasei Corp, Tokio, Japón). Esta dosis se decide de acuerdo con el valor LD50 en las fichas de datos de seguridad de cada producto químico. Para la inyección de cada metabolito, los ratones se asignaron a seis grupos de cinco animales cada uno. Los metabolitos de BB se administraron en seis momentos diferentes (hora del reloj: 10:00, 14:00, 18:00, 22:00, 02:{{21) }} y 06 : 00), descritos como tiempos zeitgeber (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 y ZT22, respectivamente. Los ratones de control recibieron el mismo volumen de solución salina. Se controló la mortalidad durante 7 días después de la inyección.

Para analizar las variaciones circadianas enrenallesiónSe administró una inyección ip de 165 mg/kg de 4-BrC en ZT2 o ZT14 a ratones ICR macho de 7-semanas de edad (5-9 ratones). Los ratones de control recibieron el mismo volumen de solución salina que se describe anteriormente. Los animales fueron sacrificados usando pentobarbital, y sus muestras de plasma fueron recolectadas 24 horas después de la inyección. Las muestras de plasma obtenidas se almacenaron a -80 grados. losriñonesde todos los animales fueron cosechados y almacenados a -80 grados.

Niveles de nitrógeno ureico en sangre plasmática (BUN), aspartato aminotransferasa (AST) y malondialdehído renal (MDA)

Los niveles plasmáticos de BUN y AST se determinaron utilizando la prueba BUN Wako y la transaminasa CII-Test Wako (FUJIFILM Wako Chemicals, Osaka, Japón), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.8) TotalrenalLos niveles de MDA se midieron a través de un ensayo de microplaca colorimétrica (Oxford Biomedical Research, MI, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.8)

Análisis de Western Blot

Muestras de proteína (50 µg) extraídas delriñonesse separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 por ciento. anticuerpo monoclonal peroxidasa 4 (GPX4) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.); anticuerpo policlonal de caspasa -3 escindida de conejo (tecnología de señalización celular); y anticuerpo monoclonal de actina de ratón (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Japón).

Análisis estadístico

Se realizaron comparaciones múltiples utilizando la prueba post-hoc de Tukey-Kramer. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS 25.0 (Chicago, IL, EE. UU.). Resultados con p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este estudio, comparamos la cronotoxicidad de tres metabolitos intermedios de BB (3-BrP, BrHQ y 4-BrC) que se sabe que inducenrenaltoxicidad. Primero investigamos el efecto del tiempo de inyección en la mortalidad inducida por el metabolito intermedio BB. La figura 2 muestra el número de animales supervivientes y el tiempo medio de supervivencia (MST) 7 días después de la inyección. Cuando se administró 3-BrP en ZT10 y ZT14, todos los ratones murieron (0 por ciento) dentro de las 4 h (Fig. 2A). Por el contrario, cuando se administró 3-BrP en ZT6 y ZT22, sobrevivieron tres ratones (60 por ciento); cuando se administró en ZT2 y ZT18, el número de ratones supervivientes fue uno y dos (20 y 40 por ciento), respectivamente. Después de la administración de BrHQ, se observó la muerte de los ratones solo dentro de las 4 h posteriores a la administración en todos los grupos ZT. A los 7 días después de la administración, ningún ratón sobrevivió en los grupos ZT14 y ZT18 y tres (60 por ciento) sobrevivieron en los grupos ZT2 y ZT6. En los grupos ZT10 y ZT 22, el número de ratones supervivientes fue dos y uno (40 y 20 por ciento), respectivamente (Fig. 2B). Después de la administración de 4-BrC, todos los ratones murieron en 3 días cuando recibieron dosis de ZT14 o ZT18 (0 por ciento) y solo uno o dos (20 o 40 por ciento) sobrevivieron en otros grupos de ZT (Fig. 2C). MST fue casi consistente con la cantidad de ratones sobrevivientes en todos los grupos (Figs. 2D-F). Estos resultados indican la cronotoxicidad letal de los tres metabolitos intermedios de BB. Luego de la administración en ZT14 (fase oscura), los tres metabolitos mostraron una alta toxicidad. Curiosamente, los patrones de cronotoxicidad de estos metabolitos de BB son diferentes de los del propio BB, es decir, los ratones expuestos a BB en la fase oscura tenían una menor sensibilidad a la toxicidad.8) Anteriormente informamos que la estreptomicina, que muestra nefrotoxicidad, era altamente tóxica después de exposición en la fase oscura y menos tóxico después de la exposición en la fase luminosa. 9) Estos hallazgos de los estudios anteriores no contradicen los del presente estudio, lo que sugiere que las diferencias en la toxicidad de BB y los tres metabolitos intermedios de BB se atribuyen a sus órganos diana. . BB se dirige al hígado, mientras que sus metabolitos intermedios se dirigen alriñones.

A continuación, examinamos el efecto del tiempo de inyección en la gravedad de la toxicidad de los órganos utilizando una dosis no letal de 4-BrC (165 mg/kg). Como se observó una muerte prematura dentro de las 4 h con las inyecciones de 3-BrP y BrHQ, descritas anteriormente, solo seleccionamos 4-BrC para los experimentos posteriores. Por conveniencia experimental, elegimos ZT2 y ZT14 como tiempos de inyección. En el grupo de ZT2, el nivel plasmático de BUN, un indicador de nefrotoxicidad, no aumentó después de la exposición a 4-BrC; sin embargo, el nivel de BUN aumentó notablemente en el grupo ZT14 (Fig. 3A). En paralelo con BUN, medimos el nivel de AST en plasma, un indicador de hepatotoxicidad. Descubrimos que la administración de 4-BrC no afectó los niveles plasmáticos de AST tanto en ZT2 como en ZT14 (Fig. 3B), lo que sugiere que 4-BrC era tóxico solo para elriñones. Además, estimamos los niveles de MDA como indicador de estrés oxidativo en elriñones. La administración de 4-BrC aumentó significativamente el nivel renal de MDA en los grupos ZT14 y ZT2. Sin embargo, el nivel de MDA en el grupo de inyección de ZT2 fue significativamente más bajo que en el grupo de ZT14 (Fig. 3C).

Hasta la fecha, se han informado varias vías de muerte celular, como apoptosis, necroptosis y ferroptosis.11) Además, se ha informado que la muerte celular causada por 4-BrC está mediada principalmente a través de la necrosis.6) Para investigar la tipo de muerte celular inducida por 4-BrC, analizamos los niveles de proteínas relacionadas con la muerte celular: caspasa escindida-3 para apoptosis, RIP1/RIP3 para necroptosis y GPX4 para ferroptosis. No se observaron cambios evidentes en los niveles de caspasa-3, RIP1 y RIP3 escindida en ningún grupo, lo que sugiere que la apoptosis y la necroptosis no son inducidas por 4-BrC (Fig. 4). Por el contrario, se observó una disminución en el nivel de GPX4 después de administrar 4-BrC en ZT14 (Fig. 4). No observamos la necrosis renal inducida por 4-BrC mediante análisis histopatológico (datos no mostrados). Esto sugirió que la concentración de 4-BrC utilizada en este estudio causó daño renal leve y no provocó necrosis. A partir de estos resultados, se puede sugerir que 4-BrC causa ferroptosis, que muestra una variación diurna.

En este estudio, mostramos cronotoxicidad inducida por metabolitos intermedios BB en elriñón. Por el contrario, nuestro resultado anterior mostró nefrotoxicidad inducida por BB. Sin embargo, la cronotoxicidad renal no cambió entre la fase clara y la fase oscura. 8) Aunque la razón fundamental de la diferencia entre la investigación anterior y la actual aún no está clara, creemos que se produjo para enmascarar la cronotoxicidad renal al inducir una enfermedad hepática grave. lesión. En el experimento futuro, necesitamos medir las cantidades acumuladas de cada metabolito intermedio BB, ya que estas cantidades podrían alterarse por los niveles de CYP y/o lesión.

Muchos factores biológicos muestran un ritmo circadiano en sus niveles de expresión. Por ejemplo, Xu et al. han informado una variación diurna en la expresión del gen antioxidante hepático en ratones.12) El glutatión (GSH) es un antioxidante fundamental para mantener la salud y proteger contra los compuestos tóxicos. Se ha informado que tanto 4-BrC como 3-BrP reducen el nivel renal de GSH.4,13) La ferroptosis se propuso en 2012 como la forma de muerte celular inducida por la elastina, que inhibe la importación de cisteína, lo que lleva al agotamiento de GSH y la inactivación de GPX4.14) Nuestros resultados mostraron que GPX4 solo fue reprimido en ZT14 por 4-BrC. Por lo tanto, las proteínas o genes relacionados con GSH pueden estar asociados con la cronotoxicidad.

Para concluir, nuestro presente estudio demuestra que BB induce daño renal y daño hepático a través de sus metabolitos, como 3-BrP, BrHQ y 4-BrC. La razón por la que la variación diurna de la nefrotoxicidad por BB no se observó en nuestro informe anterior es que el daño renal estaba enmascarado debido al fuerte daño hepático.

REFERENCIAS

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Hiroki Yoshioka, a,b,# Sarah Tominaga, a,# Mai Nishikawa, a Yasuro Shinohara, a Makoto Nakao, a Masae Yoshikawa, a Tohru Maeda,*, a y Nobuhiko Miura*,c

una Facultad de Farmacia, Universidad Kinjo Gakuin; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Japón: b Centro de Investigación Craneofacial, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston, Facultad de Odontología; 1941 East Road, Houston, TX 77054, EE. UU.: y cDepartamento de Ciencias de la Salud, Universidad de Farmacia de Yokohoma; 601 Momono-Cho, Totsuka-Ku, Yokohama 245–2006, Japón. Recibido el 30 de agosto de 2020; aceptado el 25 de octubre de 2020

para más información: Ali.ma@wecistanche.com