Expresión diferencial de enzimas metabolizadoras de esfingolípidos en ratas espontáneamente hipertensas: un posible sustrato para la susceptibilidad al daño cerebral y renal
Feb 24, 2022
Resumen: Las alteraciones en el metabolismo de los esfingolípidos, una clase de moléculas biológicamente activas en las membranas celulares con efecto directo sobre la homeostasis vascular, se reconocen cada vez más como determinantes importantes en diferentes trastornos vasculares. Sin embargo, no está claro si los esfingolípidos están implicados en la patogenia de la hipertensión cerebrovascular ydaño renal. En este estudio evaluamos la existencia de posibles anomalías relacionadas con el metabolismo de los esfingolípidos en el cerebro yRiñónde dos cepas de ratas espontáneamente hipertensas bien validadas, los modelos propensos a los accidentes cerebrovasculares (SHRSP) y resistentes a los accidentes cerebrovasculares (SHRSR), en comparación con la cepa de ratas normotensas Wistar Kyoto (WKY). Nuestros resultados mostraron una alteración global en el metabolismo de los esfingolípidos tanto a nivel cerebral comorenal tejidos de ambas cepas hipertensas en comparación con la rata normotensa. Sin embargo, algunos defectos, como la reducción de la expresión de enzimas implicadas en el metabolismo/catabolismo de la esfingosina-1-fosfato y en las rutas biosintéticas de novo, se detectaron exclusivamente en el SHRSP. Aunque se necesitan más estudios para comprender completamente la importancia de estos hallazgos, sugieren que los defectos en moléculas lipídicas específicas y/o sus vías metabólicas relacionadas pueden contribuir probablemente a la patogenia del daño de órganos diana hipertensivos y eventualmente pueden servir como objetivos terapéuticos futuros para reducir Las consecuencias vasculares de la hipertensión.
Palabras clave:esfingolípidos; carrera; cerebro; riñón; SHR; WKY
IntroducciónLa hipertensión representa un problema de salud importante que causa daños en órganos específicos y consecuencias clínicas dramáticas, lo que lleva a una mayor tasa de muerte y discapacidad en las sociedades occidentales [1–3]. Para reducir la carga de las complicaciones hipertensivas, se requiere una comprensión más completa de los mecanismos etiopatogénicos subyacentes. La disponibilidad de modelos animales que puedan imitar fielmente la patología humana y, al mismo tiempo, simplificar la complejidad inherente al estudio de las poblaciones humanas, puede ser de gran utilidad en este concurso. En la actualidad, la rata espontáneamente hipertensa propensa a los accidentes cerebrovasculares (SHRSP), que muestra una mayor predisposición a los trastornos cerebrales ydaño renal, particularmente cuando se alimenta con una dieta alta en sal y baja en potasio, representa un modelo ideal. La hipertensión y los factores dietéticos se comportan como factores de riesgo predisponentes tanto para ratas como para humanos [4,5]. El SHRSP muestra una mayor frecuencia de accidentes cerebrovasculares cuando se alimenta con una dieta de estilo japonés (JD) que su control estrictamente relacionado, el resistente al accidente cerebrovascular (SHRSR), a pesar de los niveles similares de presión arterial [6]. De nota,daño renal siempre precede a los eventos de accidente cerebrovascular [6]. Aunque los mecanismos moleculares subyacentes no se comprenden completamente, la evidencia indica que la disfunción vascular resultante y las lesiones estructurales consiguientes favorecendaño renaly desarrollo de accidentes cerebrovasculares.
CITANCHE MEJORARÁ LA FUNCIÓN RENAL/RENAL
En los últimos años, algunos de los aspectos mecanicistas y determinantes de las enfermedades cerebrovasculares ydaño renalla ocurrencia ha sido identificada en el modelo SHRSP [7-12]. Sin embargo, aún queda mucho por descubrir. Los esfingolípidos, incluidas las ceramidas (Cer), la esfingosina y su forma fosforilada esfingosina-1-fosfato (S1P), representan los principales constituyentes lipídicos de las membranas biológicas y modulan varias funciones importantes para las poblaciones de células neuronales y no neuronales [13]. No menos importante, sin embargo, es el papel fundamental que desempeñan en la formación y función vascular [13-15], así como en la regulación de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) a través de la modulación de proteínas de unión estrecha [16]. En este sentido, la evidencia indica que la síntesis de novo de esfingolípidos es crucial para preservar las funciones de las células endoteliales [17,18], lo que probablemente contribuya a la integridad vascular y la homeostasis. Se ha descrito que el metabolismo defectuoso de los esfingolípidos es la base de diferentes afecciones cardiovasculares [19,20]. Sin embargo, todavía no se ha proporcionado evidencia directa de un papel causal de los esfingolípidos en la patogenia del daño hipertensivo de órganos diana. A pesar de la falta de detalles sobre el mecanismo, se ha demostrado que la vía de S1P, un lípido bioactivo, es neuroprotectora durante la isquemia [21,22], y la estimulación de sus receptores conduce a efectos beneficiosos en un modelo animal de accidente cerebrovascular [23]. Por lo tanto, es concebible que exista una estrecha interacción entre el accidente cerebrovascular y los esfingolípidos. En este estudio, investigamos el cerebro yrenalexpresión de varias moléculas implicadas en las vías de los esfingolípidos tanto en las cepas SHRSP como SHRSR, con respecto a la cepa normotensa WKY. Nuestros hallazgos destacan, por primera vez, un metabolismo aberrante de los esfingolípidos en el cerebro o en el riñón de ambos modelos animales hipertensos. Es importante destacar que algunos defectos se detectaron exclusivamente en la cepa SHSRP. Esta evidencia sugiere que las alteraciones en moléculas lipídicas específicas y/o sus vías específicas pueden contribuir potencialmente a la patogenia de la hipertensión y del daño hipertensivo de órganos diana.
Resultados
Los niveles de enzimas metabolizadoras de S1P se alteran en SHRSPPara revelar si alguna alteración potencial en el metabolismo de los esfingolípidos era detectable en las cepas SHRSP y SHRSR, primero investigamos la expresión de moléculas implicadas en las vías de síntesis y degradación de S1P (esquemáticas en la Figura 1). Para ello, evaluamos los niveles de SPHK1 y 2, así como de SGPL1 en cerebro yrenaltejidos de ambas ratas espontáneamente hipertensas en comparación con la cepa WKY. Como se indica en la Figura 2, las ratas SHRSP se caracterizaron por una reducción significativa de SPHK2 y de SGPL1 en el cerebro en comparación con WKY y SHRSR. No hay diferencia en elrenalse detectó la expresión de todas las enzimas entre las tres cepas de ratas.
Los niveles de los receptores S1P son aberrantes en ratas espontáneamente hipertensasLa evidencia indica que la modulación de los receptores S1P puede ser beneficiosa en modelos isquémicos [23]. Aquí, con el fin de establecer si algún cambio en su expresión podría asociarse eventualmente con los fenotipos de la enfermedad, evaluamos los niveles de proteína de los receptores más abundantes, S1PR1-3 [24], en las tres cepas de ratas. El análisis de inmunotransferencia reveló una variación en la expresión de los tres receptores de manera dependiente del tejido. Curiosamente, S1PR1 fue el único receptor cuya expresión aumentó tanto en el cerebro como en los riñones de SHRSR (Figura 3A, 3B). Por el contrario, el análisis de los tejidos SHRSP no mostró variación en la expresión de todos los receptores, a excepción de S1PR3 cuyos niveles aumentaron en el cerebro, de manera similar a los detectados en el SHRSR (Figura 3E)
La expresión de ceramida sintasas es defectuosa en múltiples tejidos de los modelos SHRSP y SHRSRLa evidencia previa indica que los niveles de ceramida aumentan en modelos preclínicos de accidente cerebrovascular, así como en pacientes humanos [25–27]. Aquí, para evaluar si el metabolismo de la ceramida podría verse afectado en ratas espontáneamente hipertensas, lo que eventualmente resultaría en un aumento de los niveles de ceramida, investigamos la expresión de las ceramida sintasas, que se informa que son las más abundantes en el cerebro (CerS1 y CerS2). y en elriñones(CerS2 y CerS4) [28]. Como se informa en la Figura 4, el análisis qPCR reveló un trastorno generalizado en la expresión de las sintasas, con algunas diferencias entre las dos cepas espontáneamente hipertensas. SHRSP mostró mayores niveles de ARNm de CerS1 en el cerebro en comparación con WKY o SHRSR (Figura 4A) y niveles reducidos de CerS6 en el cerebro.riñones, similar a lo observado en el SHRSR (Figura 4D). Por el contrario, SHRSR se caracterizó por una expresión reducida de ARNm de CerS2 tanto en el cerebro como en los riñones (Figura 4B, 4C).
La expresión de SPTLC1 se reduce en los tejidos SHRSPEstudios recientes han señalado una posible implicación de la biosíntesis de novo de esfingolípidos en la hipertensión y las enfermedades vasculares [29,30]. Para investigar cualquier posible asociación entre las vías de los esfingolípidos de novo y el accidente cerebrovascular, evaluamos los perfiles de expresión de proteínas de SPTLC1 y 2, dos subunidades de SPT, las enzimas limitantes de la velocidad en la biosíntesis de novo de los esfingolípidos [13], tanto en el cerebro como en el cerebro.renaltejidos Como se informa en la Figura 5A,B, las ratas SHRSP se caracterizaron por una reducción significativa de SPTLC1 tanto en el cerebro como en el cerebro.riñonesCuriosamente, SPTCL2 también se redujo en el cerebro de SHRSP en comparación con SHRSR (Figura 5C).
La expresión de 3-ceto-dihidroesfingosina reductasa se reduce en ratas espontáneamente hipertensasLa alteración en la biosíntesis de novo de los esfingolípidos se confirmó aún más mediante el análisis de las enzimas 3-ceto dihidroesfingosina reductasa (KDSR) y ceramida desaturasa (DES), normalmente implicadas en la síntesis de novo de los esfingolípidos [13]. El análisis de qPCR mostró una reducción significativa de los niveles de expresión de ARNm de KDSR en elriñonesde SHRSP y SHRSR (Figura 6B). No se observaron más cambios.
Figura 2. La expresión de enzimas metabolizadoras de S1P es defectuosa en tejidos cerebrales de SHRSP. Inmunotransferencias recortadas representativas y análisis densitométrico de SPHK1 (esfingosina quinasa 1) (A,B), SPHK2 (esfingosina quinasa 2) (C,D) y SGPL1 (S1P-liasa) (E,F) en tejidos cerebrales y renales de WKY, SHRSP y SHRSR. En cada inmunotransferencia, todas las muestras se procesaron en el mismo gel. Las muestras no adyacentes están separadas por una línea negra. Los datos se representan como media ± SD, n {{10}}/7 para cada grupo de ratas. * p < 0.05;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001="" (anova="" unidireccional,="" post-test="" de="" tukey).="" la="" fecha="" sin="" procesar="" para="" generar="" la="" figura="" se="" informa="" en="" la="" tabla="" de="" material="" complementario="">
Discusión
A pesar de los tremendos esfuerzos de investigación realizados por científicos básicos y clínicos, las complicaciones hipertensivas como el accidente cerebrovascular yrenalLas enfermedades siguen representando las principales causas de muerte en todo el mundo [1-3]. Por lo tanto, se necesita el conocimiento de vías patogénicas alternativas y nuevos objetivos farmacológicos para preservar la salud cerebrovascular y renal. Explorar el metabolismo de los esfingolípidos, una clase de moléculas biológicamente activas en las membranas celulares que desempeñan un papel clave en la homeostasis vascular, puede allanar el camino hacia un nuevo horizonte de comprensión. Aunque la evidencia emergente indica que las alteraciones en el metabolismo de los esfingolípidos, como S1P y las ceramidas, pueden tener un papel en los trastornos vasculares y la hipertensión [31], aún no está claro si están implicados en la patogénesis del daño orgánico hipertensivo. En este estudio, intentamos obtener algunos conocimientos sobre el metabolismo de los esfingolípidos en las cepas de ratas SHRSP y SHRSR, dos modelos preclínicos espontáneamente hipertensos con una susceptibilidad diferente arenaly desarrollo de daño cerebrovascular. En particular, realizamos el estudio en ratas de 8-semanas de edad, a una edad en la que se vuelven hipertensas pero aún no tienen daño en los órganos diana. A través de este enfoque, nuestro objetivo fue identificar cualquier firma "esfingobiológica" potencialmente involucrada en los diferentes resultados de la enfermedad hipertensiva en los dos modelos de ratas. Una cepa de ratas normotensas sirvió como control apropiado. Nuestros hallazgos mostraron por primera vez que ambos modelos de ratas hipertensas se caracterizaron por un trastorno global del metabolismo de los esfingolípidos, pero pocos cambios fueron específicos de la cepa SHRSP o SHRSR. En particular, la expresión tanto de SPHK2 como de SGPL1 se redujo significativamente solo en el cerebro de SHRSP. La reducción de los niveles de SPHK2 puede tener efectos extremadamente nocivos en el cerebro, donde es particularmente abundante en las células endoteliales microvasculares y ejerce un papel protector contra la isquemia inducida por el precondicionamiento hipóxico [32]. Por otro lado, la reducción de SGPL1 puede ser potencialmente tóxica para las funciones de las células neuronales [33].
A la luz de esto, es concebible que un desequilibrio de las enzimas metabolizadoras de S1P, con una biodisponibilidad defectuosa de S1P consiguiente, pueda dar como resultado un aumento del daño vascular. La posible participación de S1P en la regulación de los mecanismos moleculares potencialmente asociados con el accidente cerebrovascular provino de la evidencia de que los niveles de S1PR1, que recientemente se identificó como un gen candidato posicional para la sensibilidad a la sal en SHRSP [22], aumentaron en los tejidos SHRSR. . Estos resultados sugieren un posible doble papel de S1P en la determinación del daño vascular y el consiguiente evento de accidente cerebrovascular. De hecho, la reducción de la biodisponibilidad de S1P y/o la regulación defectuosa de sus vías relacionadas podría aumentar la susceptibilidad al accidente cerebrovascular en el SHRSP. Por el contrario, el aumento de la expresión de S1PR1, cuya activación se ha informado que es beneficiosa en modelos experimentales de isquemia cerebral [34-36], podría eventualmente representar un factor protector en SHRSR. Nuestros hallazgos revelaron otra diferencia interesante entre las dos cepas de ratas espontáneamente hipertensas. El aumento de la expresión de CerS1, detectado solo en el SHRSP, puede sugerir una biodisponibilidad elevada de ceramida cerebral que puede revelarse tóxica y potencialmente asociada con una mayor susceptibilidad al accidente cerebrovascular. Esto está corroborado por varios estudios que informan la asociación entre el aumento del contenido de ceramida, la enfermedad isquémica de los vasos pequeños y las hiperintensidades de la sustancia blanca [37,38].
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Otra observación importante derivada de nuestro estudio es la reducción significativa tanto de SPTLC1 como de 2 en SHRSP en comparación con SHRSR, en el que no se detectaron variaciones. Aunque ambas cepas hipertensas compartían algunos defectos en la expresión de otros genes implicados en la síntesis de esfingolípidos de novo, la reducción de SPTLC sugiere claramente un papel clave de esta ruta metabólica en la patogenia de la enfermedad cerebrovascular. En este contexto, la evidencia reciente indica que la síntesis endotelial de novo de esfingolípidos regula la presión arterial y la homeostasis endotelial [30], destacando el papel fundamental de los esfingolípidos sintetizados de novo en las enfermedades vasculares. Los datos actuales pueden indicar que la síntesis de novo de esfingolípidos podría verse perturbada en el SHRSP. Nuestro estudio es el primero que aborda aspectos específicos del metabolismo de los esfingolípidos en relación con el accidente cerebrovascular. Aunque no realizamos ningún análisis cuantitativo de esfingolípidos en tejidos de rata, nuestros hallazgos sugirieron una posible alteración en la biodisponibilidad de diferentes esfingolípidos como S1P y ceramida en SHRSP. Dado que S1P estimula la proliferación celular y las vías de supervivencia, mientras que las ceramidas suelen ejercer efectos antiproliferativos y apoptóticos [39], el desequilibrio entre ellos puede afectar la homeostasis cerebral en SHRSP y contribuir potencialmente a la patogenia del accidente cerebrovascular. Teniendo en cuenta la naturaleza correlativa de nuestro estudio, se necesitan más investigaciones para comprender completamente el papel fundamental potencial de las alteraciones de los esfingolípidos en la patogénesis del daño orgánico hipertensivo para desarrollar estrategias terapéuticas "basadas en esfingolípidos" más efectivas. Teniendo en cuenta que varios fármacos, cuyos objetivos moleculares pertenecen a las vías de los esfingolípidos, ya están disponibles para el tratamiento de otras enfermedades [40], creemos que nuestros hallazgos pueden ofrecer apoyo para explorar su potencial terapéutico en el cerebro hipertenso yrenaltrastornos vasculares.
Materiales y métodos
modelos animalesTodos los experimentos se realizaron utilizando cepas de ratas macho de dos meses de edad, propensas a los accidentes cerebrovasculares espontáneamente hipertensas (SHRSP), resistentes a los accidentes cerebrovasculares espontáneamente hipertensas (SHRSR), y se compararon con una cepa de ratas normotensas de la misma edad y sexo, WistarKyoto (WKY) . SHRSP y SHRSR son los modelos animales más utilizados en estudios preclínicos de hipertensión y de accidente cerebrovascular asociado [5,6]. Se mantuvieron en las instalaciones para animales del IRCCS Neuromed, se mantuvieron a temperatura ambiente constante y ciclos día/noche de 12 h, y se alimentaron con comida para ratas regular y agua ad libitum. Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta de Revisión de Cuidado Animal Neuromed del IRCCS y por el "Istituto Superiore di Sanità" (número de permiso ISS: 1086/2020) y se realizaron de acuerdo con la Directiva de la UE 2010/63/UE para experimentos con animales. .
inmunotransferenciasLas ratas fueron sacrificadas por decapitación y los tejidos (cerebro yriñones) se ultracongelaron en N2 líquido y se pulverizaron en un mortero con maja. El tejido pulverizado se homogeneizó en tampón de lisis que contenía Tris 20 mM, pH 7,4, Nonidet P-40 al 1 %, EDTA 1 mM, NaF 20 mM, Na3VO4 2 mM y una mezcla de inhibidores de proteasa 1:1000 (Sigma-Aldrich) y sonicado con pulsos de 2 x 10 s. Para la inmunotransferencia, se inmunotransfirieron 20 µg de lisado de proteína total con los siguientes anticuerpos: anti-SPHK1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EE. UU.), anti-SPHK2 (1:1000) (Abcam, Cambridge, Reino Unido) ), anti-SGPL1 (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.), anti-S1PR1 (1:1000) (Ciencias Inmunológicas), anti-S1PR2 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology) , anti-S1PR3 (1:1000) (Ciencias Inmunológicas), anti-SPTLC1 (1:1000) (Abcam) y anti-SPTLC2 (1:1000) (Abcam). Para la normalización de proteínas se utilizó anti-actina (1:2000) (Ciencias Inmunológicas, Roma, Italia). Las bandas de proteínas fueron detectadas por ECL Prime (GE Healthcare) y cuantificadas con el software de cantidad uno (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.).
Extracción de ARN y qPCR.
El ARN total se extrajo utilizando el kit Rneasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sintetizaron 1000 ng de ARN total usando transcriptasa inversa Super Script III (Invitrogen) y el ADNc resultante se amplificó usando Power SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis cuantitativo de qPCR se realizó utilizando cebadores específicos: Kdsr FW: 50-TAAAGCAGGCACAGGAGAAG-30; Kdsr RV: 50-GCCTGAGAGGACACAAACA -30; Des FW: 50-AGAGGAGTTCGAATGGGTCTA-30; Des RV: 50- GATAGCCAGAGTCATGGAATGG-30; CerS1 FW: 50- CCTGGAAGCTTCTGTTCTACTT-30; CerS1 RV: 50- CATGTACACGGTGGCATAGA-30; CerS2 FW: 50- CATGGCTGTCACTGTGGATAA-30; CerS2 RV: 50- GAGAAGCAGAGGAGAATGATGG-30; CerS6 FW: 50- CAGGAGTGGACAAAGCAAGA-30; CerS6 RV: 50- TGGTTTGGCTATGAATCTCTCG-30; Gapdh FW: 50- AACGACCCCTTCATTGACCTC-30; Gapdh RV: 50- CCTTGACTGTGCCGTTGAACT-30.
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