Descubrimiento e identificación de posibles componentes activos antimelanogénicos de Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 y Hongjiang Chen1,2*

Resumen

Fondo:Bletilla striata es el medicamento principal de muchas fórmulas clásicas para blanquear la piel en la medicina tradicional china (MTC) y recientemente se usa ampliamente en la industria cosmética. Sin embargo, sus ingredientes activos aún no están claros y sus raíces fibrosas no se utilizan de manera efectiva. El objetivo del presente estudio es descubrir e identificar sus posibles componentes activos antimelanogénicos mediante el modelo de pez cebra y el acoplamiento molecular.

Métodos:losantioxidanteLas actividades se evaluaron mediante la actividad de eliminación de radicales 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-etilbentiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS ) actividad depuradora de radicales y reductora férricaantioxidanteensayo de potencia (FRAP). La actividad antimelanogénica fue evaluada portirosinasainhibitorioactividadin vitro e inhibidores de melanina en pez cebra. Los perfiles químicos se realizaron mediante cromatografía líquida de rendimiento ultra alto combinada con espectrometría de masas en tándem de tiempo de vuelo cuadrupolo (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Mientras tanto, los componentes activos antimelanogénicos potenciales fueron identificados temporalmente por acoplamiento molecular.

Resultados:El extracto de etanol al 95 por ciento de raíces fibrosas de B. striata (EFB) poseía las actividades inhibidoras de DPPH, ABTS, FRAP y tirosinasa más fuertes, con IC50 5.94 mg/L, 11.69 mg/L, 6.92 mmol FeSO4/g, y 58,92 mg/L, respectivamente. Además, EFB y el extracto de etanol al 95 por ciento del tubérculo B. striata (ETB) redujeron significativamente la síntesis de melanina de los embriones de pez cebra de una manera dependiente de la dosis. Se identificaron tentativamente 39 composiciones químicas, incluidos 24 estilbenoides, de EFB y ETB. El acoplamiento molecular indicó que había 83 (incluidos 60 estilbenoides) y 85 (incluidos 70 estilbenoides) compuestos que presentaban afinidades de unión más fuertes hacia la tirosinasa y la adenilato ciclasa.

Conclusión:Los hallazgos presentes respaldaron la justificación del uso de EFB y ETB como agentes naturales para blanquear la piel en las industrias farmacéutica y cosmética.

Palabras clave: Bletilla striata, Antioxidante, Actividad antimelanogénica, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Pez cebra, Acoplamiento molecular

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Fondo

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. F. es una planta herbácea perenne ampliamente distribuida en Asia, como China, Corea y Japón [1]. El tubérculo seco de B. striata, también conocido como Baiji, registrado por primera vez en el Clásico de Materia Médica de Shennong, ha sido ampliamente utilizado como medicina tradicional china (MTC) durante miles de años en China. Las farmacopeas chinas afirman que posee la capacidad de astringencia sobre hemostasia y analgesia, por lo tanto, fue ampliamente utilizado para el tratamiento de hematemesis, hemoptisis, sangrado traumático, úlceras, hinchazón y piel agrietada [2, 3]. Los estudios farmacológicos demostraron que B. striata poseía un amplio espectro de actividades biológicas, como cicatrización de heridas [4, 5], antiulcerosa [6, 7], hemostática [8],anti-inflamación[9], antioxidante[10], antibacteriano [11], antiinfluenza viral [12] y antienvejecimiento [13]. Al mismo tiempo, B. striata contiene varias clases de composiciones químicas, que incluyenpolisacáridos[14], bibencilos, fenantrenos, antraquinonas,flavonoidesy 2-isobutilmalatos [3, 15], etc.

B. striata es el medicamento principal de muchas fórmulas clásicas de blanqueamiento de la piel en la MTC [16] y recientemente se usa ampliamente en la industria cosmética [17]. Sin embargo, sus ingredientes activos aún no están claros e incluso algunos resultados de investigación fueron contrarios. Por ejemplo, los resultados de investigación proporcionados por Chenet al. indicó que el extracto de etanol al 95 por ciento de B. striata poseía una actividad inhibidora de la tirosinasa más alta que la de su extracto acuoso con una tasa de inhibición del 68,36 por ciento in vitro [18], mientras que el resultado de Huang et al. mostró que la actividad inhibidora del extracto acuoso de B. striata sobre la tirosinasa era más fuerte que la del extracto de etanol al 95 % con una tasa de inhibición del 62 % in vitro [19]. Los resultados de la investigación de Luetal.[20]y Linghuetal.[21]demostraron que tanto el agua como el extracto de etanol al 95 % de B. striata, especialmente su fraccionamiento con cloroformo, podrían inhibir el crecimiento de células B16 e inducir su apoptosis de manera dependiente de la concentración.

Como las pruebas in vitro de inhibición de tirosinasa y líneas celulares de melanoma no involucraron las complejas condiciones fisiológicas in vivo y la absorción, metabolismo, distribución y excreción de la muestra de prueba, muchas de las muestras mostraron una actividad inhibidora significativa contra la tirosinasa y las líneas celulares de melanoma en in vitro, sin embargo, se mostró débilmente eficaz o incluso ineficaz in vivo [22,23]. La glabridina mostró una actividad inhibidora significativa de la tirosinasa con IC50 0.43μmol/L, que fue 176 veces más fuerte que la del ácido kójico. Sin embargo, no hubo efectos inhibitorios sobre la pigmentación del pez cebra in vivo [24].

Mientras tanto, las raíces fibrosas (FB) de B. striata fueron los subproductos generados durante el procesamiento de B. striatatuber (TB). Investigaciones modernas indicaron que la FB contiene compuestos similares a la TB y con mayor contenido de fenoles [25]. Además, las actividades antibacteriana [26], antioxidante y antitirosinasa del extracto de FB fueron más fuertes que las del extracto de TB [25]. Sin embargo, los recursos de FB no se usaron de manera efectiva y fueron abandonados en las tierras de cultivo, lo que provocó el desperdicio de recursos de FB y la contaminación ambiental [27].

El pez cebra (Danio rerio), un pequeño pez tropical de agua dulce, es un modelo animal emergente para la farmacología

y la investigación toxicológica in vivo, con muchas ventajas, incluido el bajo costo, ciclo de vida corto, alta transparencia, fácil de mantener, alta fertilidad y requiere menos muestras de prueba [28, 29]. Además, el pez cebra tiene pigmentos de melanina en la superficie, lo que permite una simple observación del proceso de pigmentación, y fue ampliamente utilizado en el estudio antimelanogénico [28, 30].

En el presente estudio, comparamos las actividades antioxidantes e inhibidoras de la tirosinasa del polisacárido crudo y el extracto de TB y FB en etanol al 95 por ciento in vitro, y las actividades antimelanogénicas en el modelo de pez cebra. Mientras tanto, los componentes activos antimelanogénicos potenciales fueron identificados temporalmente por acoplamiento molecular. Descubrimos que el extracto de TB (ETB) y FB (EFB) en etanol al 95 por ciento posee actividades significativamente antioxidantes y anti-tirosinasa, y puede reducir la síntesis de melanina de los embriones de pez cebra de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, ETB y EFB se pueden utilizar como agentes naturales para blanquear la piel en las industrias farmacéutica y cosmética.

Métodos

Sustancias químicas y reactivos

La tirosinasa, la 3-(3,4-dihidroxifenil)-L-alanina (L-DOPA) y la arbutina se adquirieron de la empresa de reactivos Aladdin (Shanghai, China).2,2-difenil{{8 }}picrilhidrazilo (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-etilbentiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS),6-hidroxi-2,5,7 ,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico (Trolox) y 2,4,6-tris (2-piridil)-s-triazina (TPTZ) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Se adquirieron acetonitrilo y metanol (grado HPLC) de Tedia (Fairfield, OH, EE. UU.). El agua desionizada se preparó mediante el sistema de agua Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, EE. UU.).

Procedimiento de recolección y extracción de plantas.

B. striata se recolectó de Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, China). Los especímenes de vales se depositaron en Herbario del Colegio Farmacéutico de Zhejiang (n.º de acceso 190615). Toda la planta estaba dividida en tubérculos y raíces fibrosas. Posteriormente, se cortaron en pequeños trozos y se secaron por liofilización al vacío, respectivamente.

Las muestras secas y en polvo (TB y FB) se extrajeron a reflujo con etanol al 95 por ciento tres veces (1,5 h cada vez). El extracto se filtró utilizando un papel de filtro What man (No.1). El filtrado se concentró a sequedad en un evaporador rotatorio (Hei-VAP, Heidolph, Alemania) a 50 grados y posteriormente se secó mediante un liofilizador al vacío. Los rendimientos de la extracción con etanol de TB (ETB) y FB (EFB) fueron 5,21 y 6,53 por ciento, respectivamente. Los sedimentos se usaron para extraer el polisacárido crudo dispersándolo en agua a 80 grados durante 4 horas y precipitando con etanol [31]. Los rendimientos de polisacáridos de TB (PTB) y FB (PFB) fueron 14,75 y 6,45 por ciento, respectivamente.

extracto de cistanche

Análisis químico

El análisis químico se realizó en una cromatografía líquida de rendimiento ultra alto combinada con espectrometría de masas en tándem de tiempo de vuelo de cuadrupolo (UPLC-Q-TOF-MS/MS). La separación cromatográfica se realizó en un Waters Acquity UPLC tem (Waters Corp., Milford, MA, EE. UU.) con una columna WatersBEH Shield RP C18 (100×2,1 mm, 1,7 μm) a 3{ {43}} grado. La fase móvil estaba compuesta por ácido fórmico al 0,1 % en agua (A) y acetonitrilo (B), con un gradiente lineal: 0–3 min, 5–16 % B; 3–8min, 16–30 por ciento B; 8–10 min, 30–35 por ciento B; 10–15 min, 35–55 por ciento B; 15–18 min, 55–80 % B; 18–19 min, 80–5 % B; 19–20 min, 5 por ciento de B. La velocidad de flujo fue de 0,3 ml/min y el volumen de inyección fue de 2 μL.

Los experimentos TOF-MS/MS se realizaron utilizando una espectrometría de masas AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, CA, EE. UU.) equipada con una ionización por electropulverización (ESI). La detección de MS se realizó en el método de ionización negativa. Los parámetros se establecieron como sigue: la fuente y la temperatura de desolvatación fueron 100 grados y 450 grados respectivamente; el caudal de gas de desolvatación fue de 900 l/h; el voltaje capilar era de 2 kV; el voltaje del cono era de 40 V; la energía de colisión fue de 22 eV; y el scanspectra completo fue de 100 a 2000 Da.

Ensayos de antioxidantes Actividad de eliminación de radicales DPPH

La actividad eliminadora de radicales DPPH se determinó de acuerdo con Ali et al. con ligeras modificaciones [32]. Brevemente, 50 μL de solución de muestra de prueba se mezclaron con 150 μLDPPH de solución de etanol (0,2 mM) en 96-placas de pocillos y se mantuvieron en la oscuridad durante 30 min. . La absorbancia de la mezcla a 517 nm (A1) se evaluó mediante un espectrofotómetro de microplacas (Thermo Fisher Scientific, América). La solución en blanco sin muestra de prueba mezclada con solución de DPPHetanol se estableció como el grupo positivo (A0). La solución en blanco sin DPPH mezclada con la solución de muestra de prueba se estableció como el grupo en blanco (A2). Todos los experimentos se ejecutaron por triplicado. La tasa de eliminación de radicales DPPH se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Tasa de barrido de radicales DPPH (porcentaje) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 por ciento.

Actividad de eliminación de radicales ABTS

La capacidad de captación de radicales ABTS se midió utilizando el método descrito por Ali et al. [32]. Brevemente, se mezcló una solución acuosa de 7 mMABST con persulfato de potasio 2,45 mM en una proporción de 1:1 (v/v) y se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 16 h para obtener la solución madre ABST plus. La solución madre se diluyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para ajustar la absorbancia de (0.72±0.2) a 734 nm. Se mezclaron completamente muestras de prueba de 20 μL a diferentes concentraciones con 180 μL de solución ABTS plus. Las mezclas reactivas se mantuvieron en la oscuridad durante 5min y posteriormente se midió la absorbancia (B1) a 734nm. Las absorbancias de las mezclas sin muestra de prueba y ABST plus se establecieron como B y B , respectivamente. Todos los experimentos se ejecutaron por triplicado. La tasa de barrido de radicales ABTS se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

Tasa de barrido de radicales ABTS (porcentaje) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 por ciento.

Ensayo de poder antioxidante reductor férrico (FRAP)

La actividad reductora del hierro férrico se determinó según los procedimientos de Kosakowska et al. [33]. Se mezclaron 30tampón de acetato 0 mM, TPTZ 10 mM (2,4,6-tris (2-piridil)-s-triazina) y FeCl3 20 mM a (v/v/v) proporción de 10:1:1 para preparar el reactivo de trabajo. Se mezclaron 100 μl de cada solución de muestra de prueba con 100 μl de reactivo de trabajo TPTZ, se incubaron a 37 grados durante 20 min y se determinó la absorbancia a 593 nm. Mientras tanto, se utilizó una serie de soluciones estándar de FeSO4 en los rangos de concentración de 0 a 1000 ug/mL para preparar la curva de calibración. Se calculó la capacidad reductora férrica en la formación de un complejo azul intenso de Fe2 más -TPTZ. Los resultados se expresaron como Fe2 más capacidad antioxidante (mmol FeSO4/g de extracto).

Actividad inhibidora de la tirosinasa

Las actividades inhibidoras de la tirosinasa se determinaron mediante un método espectrofotométrico usando L-DOPA como sustrato [34]. Brevemente, 50 μL de soluciones de muestra a diferentes concentraciones se mezclaron con 50 μL de tirosinasa (200 unidades/mL, disueltas en tampón de fosfato de pH 6,8) en 96-bien placas e incubadas durante 15 min a 25 grados. Luego se inició la reacción con la adición de L-DOPA (50 μL). Después de una incubación de 30 min a 25 grados, se determinó la absorbancia a 490 nm (Aa) usando un espectrofotómetro de microplacas multiskan sky (ThermoFisher Scientific, América). De manera similar, la absorbancia de los pocillos de muestra sin tirosinasa (Ab) y los pocillos de control con enzima pero sin muestra (Ab) se detectaron al mismo tiempo. La actividad inhibidora de la tirosinasa se calculó mediante la siguiente ecuación:

Tasa inhibitoria de tirosinasa (porcentaje)=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 por ciento.

El IC50 se calculó utilizando la ecuación GraphPad Prism como se muestra a continuación:

Y=min plus (max − min)/1 plus 10(x−logIC50)×Pendiente de la colina

X representó la concentración de inhibidor; Y representaba los datos de inhibición (porcentaje) junto con sus valores mínimo (mín) y máximo (máx); La pendiente de la colina es el factor de pendiente.

Cistanche inhibe la actividad de la tirosinasa.

inhibidor de melanina en pez cebra

El pez cebra de línea AB de tipo salvaje (proporcionado por Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, provincia de Zhejiang) se alojó en agua de pescado (0.2 por ciento de sal marina instantánea en agua desionizada, pH 6.9–7.2, conductividad 48{ {18}}–510 mS/cm, y dureza 53,7–71,6 mg/L CaCO3) en un fotoperíodo de 14/10 h de luz/oscuridad a una temperatura constante de 28±0,5 grados, y alimentados con camarones de salmuera vivos dos veces al día. Los embriones de pez cebra se obtuvieron del desove natural y se recolectaron en 30 minutos. El ensayo de pez cebra fue acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). El presente estudio fue aprobado por el IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales) en Hunter Biotechnology, Inc. y el número de aprobación del IACUC fue 001458.

Los embriones en la etapa de 6 h post fertilización (hpf) fueron tratados con cada extracto a seis concentraciones (10, 30, 62.5, 125, 250 y 500 mg/L) durante 72 h para evaluar la concentración máxima no letal (MNLC). ). Como resultado, los MNLC de todo el extracto fueron superiores a 62,50 mg/L. Se colocaron 10 embriones en 6-pozo y se expusieron a muestras analizadas a concentraciones de 10 y 30 mg/L desde 6 hpf hasta 54 hpf (48 h de exposición). ). Se usaron DMSO (0,05 por ciento, v/v) y arbutina (10 y 30 mg/l) como control normal y positivo, respectivamente.

Los embriones sincronizados se recolectaron y observaron bajo un microscopio estereoscópico (SZX7, Olympus, Japón) equipado con una cámara digital (VertA1, China). La acumulación de melanina, directamente correlacionada con las áreas de pigmentación del pez cebra, se calculó utilizando el programa de manipulación de imágenes GNU (GIMP versión 2.10.2) y se expresó como porcentaje con respecto al control negativo (acumulación de melanina 100 por ciento) [28, 30].

estudio de acoplamiento molecular

158 compuestos aislados de B. striata en la literatura[2], incluidos 19 glucósidos, 28 bibencilos, 19 fenantrenos, 18 bifenantrenos, 23 dihidrofenantrenos, 5 antocianinas, 11 esteroides, 8 triterpenoides, 12 ácidos fenólicos, 5 quinonas, y otros 10 compuestos, se usaron como ligandos. Las estructuras 3D fueron dibujadas por ChemBio3D y optimizadas usando MM2 y Autodock Tools. La estructura cristalina 3D de la tirosinasa (PDBID:5M8N) y la adenilato ciclasa (PDB ID:5IV3) se obtuvieron del banco de datos de proteínas RCSB (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Todas las moléculas de agua y los heteroátomos se eliminaron de las estructuras cristalinas utilizando Chimera y MGL Tools. Finalmente, Autodock

Vina se usó para acoplar la proteína receptora con los ligandos de molécula pequeña. Los parámetros del sitio de acoplamiento de la proteína del receptor se establecieron como -36.700, 7.034, -19.104 y -17.467, -22.807, 2.786, respectivamente, según el ligando original mimosina y LRE1 [35]. Para lograr una mayor precisión computacional, se generaron 20 parámetros de exhaustividad para cada receptor, y la conformación con la mayor afinidad se seleccionó como la conformación de acoplamiento final y se visualizó en Pymol2.3. Mientras tanto, los ligandos originales mimosina y LRE1 se tomaron como control positivo [36].

Predicción ADMET in silico

Los 3 mejores resultados de B. striata poseían una mejor afinidad de unión con la tirosinasa y la adenilato ciclasa y se sometieron a análisis ADMET. QikProp en Schrodingersuite se usó para calcular sus propiedades físicas y características relacionadas con las drogas, incluido el peso molecular (MW), el coeficiente de partición octanol/agua previsto (QPlogPo/w), la solubilidad acuosa prevista (QPlogS), la célula Caco-2 aparente prevista permeabilidad para la barrera sanguínea intestinal (QPPCaco), coeficiente de partición cerebro/sangre previsto (QPlogBB), permeabilidad de la piel prevista (QPlogKp), IC50 previsto para el bloqueo de canales HERGK plus (QPlog HERG) y absorción oral humana prevista. Las propiedades se evaluaron con base en la regla de cinco de Lipin-ski y la literatura [37, 38].

Simulación de dinámica molecular

Con el fin de examinar la estabilidad y las fluctuaciones dinámicas del complejo ligando-proteína en un entorno biológico simulado, y validar aún más los resultados del acoplamiento, se eligió el compuesto blestrin D (75) como ligando para el estudio de simulación de dinámica molecular (MD), basado en el resultado del acoplamiento molecular. Se realizaron simulaciones MD del complejo de blestrin D con tirosinasa y adenilato ciclasa y se corrieron durante 100 ns, utilizando el modo de agua TIP3P. Los valores de desviación cuadrática media (RMSD) de los átomos de la columna vertebral de la proteína en relación con la estructura inicial se calcularon para examinar la estabilidad de la proteína en el transcurso del período de simulación [39].

Resultados

Composición química

Los cromatogramas de cromatograma de pico base típicos de ETB y EFB se muestran en la Fig. 1. Se utilizó el software PeakView para identificar los constituyentes. La fórmula molecular se asignó con precisión con un error de masa de 10 ppm. El peso molecular exacto y las fragmentaciones se usaron para identificar los componentes de acuerdo con la literatura y la base de datos de estructura química libre, como ChemSpider y Massbank. Como resultado, se identificaron tentativamente 39 composiciones químicas, incluidos 24 estilbenoides (bibencilos, fenantrenos y sus derivados), 6 glucósidos, 4 ácidos fenólicos, 3 quinonas, 1 esteroide y 1 otro compuesto de EFB y ETB. Al mismo tiempo, se realizó su semicuantificación relativa midiendo las áreas de los picos de cada compuesto en modo MS usando los cromatogramas de iones extraídos [40]. concentración) se resumen en la Tabla 1.

Capacidad antioxidante

Es bien sabido que la radiación ultravioleta A (UVA) puede inducir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y mediar la melanogénesis excesiva en las células de la piel. El polifenol natural fue el inhibidor de la generación de ROS y podría ser responsable de la actividad antimelanogénica de los extractos de plantas [41 , 42]. Por lo tanto, en el presente estudio, la capacidad antioxidante se evaluó a través de DPPH, actividad de eliminación de radicales ABTS y ensayo FRAP. Los resultados (Tabla 2 y Fig. 2) mostraron que el EFB (IC50=5.94 mg/L) posee la mayor actividad in vitro de eliminación de radicales DPPH en comparación con el PTB (IC50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285.81 mg/L), y ETB (IC50=65.25mg/L). Se observó una tendencia similar en los ensayos ABTS y FRAP. Los extractos etanólicos al 95 por ciento de TB y PB tuvieron una actividad antioxidante más fuerte in vitro que sus polisacáridos crudos. Además, EFB exhibió una actividad antioxidante más fuerte que ETB, lo cual fue consistente con los resultados de investigaciones anteriores [25].

Actividad inhibidora de la tirosinasa

La tirosinasa fue la enzima limitante de la velocidad clave en la ruta de biosíntesis de melanina y se usó ampliamente para identificar el potencial de los productos naturales con efecto anti-melanogénesis [43]. Los resultados (Fig. 3) mostraron que ETB y EPB tenían una actividad inhibidora de la tirosinasa más potente que PTB y PPB in vitro, lo que coincidía con los resultados de investigaciones anteriores [25]. EFB exhibió una actividad de inhibición de tirosinasa más fuerte de manera dependiente de la dosis (entre 20 y 200 mg/L) con IC50=58.92mg/L que ETB(IC50=75.44mg/L) y el compuesto positivo arbutina (IC{ {11}}.02 mg/L).

inhibidor de melanina en pez cebra

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), lo que indica que el vehículo con 0,05 por ciento de DMSO no afectó la producción de melanina en los embriones de pez cebra. Sin embargo, después de la exposición a las muestras analizadas y la arbutina durante 48 h, los embriones de pez cebra exhibieron diversos grados de depósito de melanina (Figs. 3B, 4), excepto el grupo de PFB 10 mg/L. Es notable que los contenidos relativos de melanina en los grupos de 10 mg/L (78,38 %) y 30 mg/L (64,72 %) de ETB fueron significativamente más bajos que los de los grupos de 10 mg/L (93,06 %) y 30 mg/L (82,02 %) de PTB (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

acoplamiento molecular

La tirosinasa es la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de melanina: hidroxilación de tirosina a 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) y oxidación de DOPA todopaquinona. Por lo tanto, la tirosinasa ha sido considerada como un objetivo crítico para el desarrollo de inhibidores de la melanogénesis [44]. Además, la adenilatociclasa es una enzima clave de la melanogénesis inducida por AMPc. La unión del polipéptido alfa de melanotropina (-MSH) a los receptores MC1R indujo la activación de la adenilato ciclasa, el aumento del nivel de AMPc, la expresión regulada al alza del gen de la tirosinasa y, posteriormente, el aumento de la síntesis de melanina [45]. Por lo tanto, realizamos un estudio de acoplamiento molecular de los 158 compuestos aislados de B. striata previamente [2], con tirosinasa y adenilato ciclasa. Las energías de unión de los ligandos estudiados con tirosinasa y adenilatociclasa se resumen en la Tabla S1. Había 83 (incluidos 60 estilbenoides) y 85 (incluidos 70 estilbenoides) compuestos que mostraban afinidades de unión más fuertes hacia la tirosinasa y la adenilato ciclasa, en comparación con los ligandos originales mimosina (-6,4 kcal/mol) y LRE1 (-8,5 kcal). /mol). 1,8-bis(p-hidroxibencil)-4-metoxifenantreno-2,7-diol (56), blestrina D (75) y 2,7-dihidroxi -1,6-bis(p-hidroxibencil)-4-metoxi-9,10-dihidrofenantreno (93) fueron los principales tres ligandos hacia la tirosinasa, con energía de unión −10,2, 10,0 y 9,7 kcal/mol, respectivamente. Mientras que blestrina D(75), blestrina B (73) y 3,3′-dihidroxi-5-metoxi-2,5′,6-tris(p-hidroxibencil) bibencilo (42) fueron los tres principales ligandos hacia la adenilato ciclasa, con energía de unión - 12,1, - 11,9 y - 11,6 kcal/mol, respectivamente. Sus afinidades teóricas de unión e interacciones ligando-aminoácido se resumen en la Tabla 3.

Vale la pena señalar que el blestrin D (75), un compuesto de bifenantreno, entró en el bolsillo de unión de la tirosinasa y la adenilato ciclasa (Fig. 5), y exhibió afinidades de unión significativas hacia la tirosinasa y la adenilato ciclasa. Las interacciones de Van der Walls contribuyen al valor general de la interacción energética, mientras que el grupo hidroxilo produce enlaces de hidrógeno con residuos de aminoácidos Glu 451, Arg114 de tirosinasa y Val 167 de adenilato ciclasa, respectivamente (Tabla 3 y Fig. S1). El compuesto 93 también exhibió afinidades de unión significativas hacia la tirosinasa a través de la formación de 6 enlaces de hidrógeno con los residuos de aminoácidos Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 y Gln236.

Predicción ADMET in silico

Los valores pronosticados de varios parámetros importantes junto con su rango aceptable se resumen en la Tabla 4. Aparte de los QPlogS de 3,3′,5-trimetoxibibencilo, blestrina B y blestrina D, y QPlogBB de 3,3′,{{6} }trimetoxibibencilo, todas las demás propiedades ADMET calculadas de los tres éxitos principales estuvieron dentro de los rangos esperados, mientras tanto, el QPlog HERG de los tres éxitos principales fue inferior a −5, lo que indica que tenían potencial farmacológico para uso humano. El QPlog Kp de los tres resultados principales tanto para la tirosinasa como para la adenilatociclasa, excepto 3,3',5-trimetoxibibencilo, estuvo en el rango favorable, lo que indica que estos compuestos pueden penetrar fácilmente en la piel.

Simulación dinámica molecular

El gráfico RMSD mostró que los valores RMSD del complejo proteína-ligando no fluctuaron significativamente durante todo el período de simulación. Los valores RMSD (Fig. 6A) de blestrin D con tirosinasa y complejo de adenilato ciclasa se determinaron en un rango de 1,5 a 2,8 Å, y de 2,0 a 3,6 Å, respectivamente. El valor de RMSF que refleja la flexibilidad de cada residuo durante las simulaciones. Los residuos con valores más altos de RMSF revelaron que eran más flexibles (Fig. 6B). Se encontró que los valores de RMSF de los residuos de aminoácidos en las regiones del bucle fluctúan mucho. Mientras que los residuos del sitio activo mantuvieron un valor de RMSF pequeño (menos de 1.0Å), como Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 y Arg230 en tirosinasa, y Val167, Leu102, Phe45, Lys95 y Leu166 en adenilato ciclasa, indicando que los bolsillos de encuadernación se mantuvieron estables. Las interacciones moleculares de blestrina D con tirosinasa y adenilato ciclasa se muestran en la Fig. 7.

Las energías libres de enlace se calcularon mediante el método del área de superficie nata generalizada de mecánica molecular (MM-GBSA) [39]. La energía libre de unión predicha de blestrin D con tirosinasa y adenilatociclasa fue de −96,94 kcal/mol y −139,69 kcal/mol, respectivamente, lo que implica que las interacciones de unión fueron espontáneas (Tabla 5). Además, las contribuciones que favorecieron la unión del ligando fueron la interacción de solvatación no polar, la interacción de van der Waals y la electrostática.

Vale la pena señalar que los tipos y contenidos de los componentes químicos en EFB eran más que en ETB. Las áreas de los picos de todos los compuestos identificados en EFB eran aproximadamente el doble que en ETB. La mili-tarina fue el compuesto más abundante tanto en EFB como en ETB, que poseía importantes actividades antioxidantes, antiinflamatorias y neuroprotectoras, y fue elegido como marcador químico para el control de calidad de B. striata en la edición 2020 de la Farmacopea china [46]. El área máxima relativa de militarina en EFB (38,39 × 106) fue ligeramente superior a la de ETB (30,48 × 106). Gastrodin es un compuesto bien conocido en muchas hierbas medicinales chinas, como Gastrodia elata, que presenta efectos significativos inhibidores de la tirosinasa y eliminadores de radicales [30]. El área máxima relativa de gastrodina en EFB (1,43 × 106) fue ligeramente inferior a la de ETB (2,17 × 106).

Los extractos etanólicos al 95 por ciento de TB y PB tuvieron una actividad antioxidante más fuerte in vitro que sus polisacáridos crudos. Además, EFB exhibe una actividad antioxidante más fuerte que ETB, lo cual es consistente con los resultados de investigaciones anteriores [25]. Este fenómeno puede atribuirse a que el EFB contiene un nivel más alto de compuestos antioxidantes, como militarina y estilbenoides (polifenoles vegetales naturales). Por ejemplo, el área relativa del pico de 4,8,4′,8′-tetrametoxi-[1,1′-bifenantreno]-2,7,2′,7′-tetrol, un bifenantreno con cuatro grupos hidroxilo fenólicos, fue de 9,15×106 en FB, mientras que fue de 0,01×106 en TB.

En el presente estudio, PPB y PTB mostraron una ligera actividad de inhibición de la tirosinasa de manera dependiente de la dosis. Sin embargo, demostró que no se detectó actividad en el extracto acuoso de PB (contiene PPB) [25]. Este fenómeno puede deberse a la diferente preparación de la muestra. El extracto acuoso de PB se utilizó para evaluar la actividad inhibidora de la tirosinasa en el experimento de Jiang [25], mientras que en el presente estudio, el extracto acuoso se precipitó con etanol para obtener el polisacárido crudo.

Recientemente, el modelo de pez cebra se usó ampliamente en la evaluación del efecto anti-melanogénesis in vivo [47, 48]. Se estableció como control positivo la arbutina, un compuesto de glucósido de hidroquinona existente en varias plantas, que se ha utilizado comercialmente en la industria cosmética. Las actividades anti-melanogénesis de ETB y EFB fueron más fuertes que las de la arbutina, lo que indica que ETB y EFB se pueden aplicar como agentes para aclarar la piel en la industria cosmética.

El área máxima relativa de blestrina D en EFB (1,91 × 106) es aproximadamente cuatro veces la de ETB (0,46 × 10). El área máxima relativa del compuesto 56 (8,73 × 106) y 93 (0,64 × 106) en EFB también es significativamente mayor que en ETB (menos de 0,01 × 106 y 0,10 × 106). Esta puede ser una de las razones por las que EFB exhibe efectos antimelanogénicos más fuertes que ETB. Es interesante notar que los tres principales ligandos hacia la tirosinasa y la adenilato ciclasa pertenecen a los estilbenoides (bibencilos, fenantrenos y sus derivados). Los estilbenoides son los polifenoles naturales de las plantas, que ha despertado gran interés en los últimos años debido a sus notables bioactividades, como la actividad antiinflamatoria, antimicrobiana y antioxidante [49]. El resveratrol es el estilbenoide más común. La investigación anterior indicó que el resveratrol y sus derivados pueden inhibir significativamente la actividad catalítica, la expresión génica y las modificaciones postraduccionales de la tirosinasa. Por lo tanto, se mostraron potencialmente útiles como agentes aclaradores de la piel y antienvejecimiento en cosméticos [41, 50].

Cistanche mostró ser potencialmente útil como agente aclarador de la piel y antienvejecimiento en cosméticos.

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Conclusiones

En este estudio, se investigó sistemáticamente la actividad antioxidante y antimelanogénica del polisacárido crudo de B. striatatuber (PTB) y raíces fibrosas (FPB), y el 95 % del extracto de etanol de B. striata tuber (ETB) y raíces fibrosas (EFB). . Los resultados mostraron que EFB poseía la mayor actividad de eliminación de radicales DPPH, ABTS y actividad reductora de hierro férrico. Además, ETB y EFB pueden reducir significativamente la actividad de tirosinasa in vitro y la síntesis de melanina en embriones de pez cebra de forma dependiente de la dosis. El acoplamiento molecular indicó que había una gran cantidad de compuestos, en su mayoría pertenecientes a estilbenoides, que mostraban afinidades de unión más fuertes hacia la tirosinasa y la adenilato ciclasa, en comparación con la afinidad de unión del ligando original. Los hallazgos presentes respaldaron la justificación del uso de ETB y EFB como agentes naturales para blanquear la piel en las industrias farmacéutica y cosmética.