Efecto de la prescripción de Cistanche Deserticola Bushen Huoxue sobre el estrés oxidativo, PI3K/Akt, Bcl-2/Bax en ratas con insuficiencia renal crónica
Mar 28, 2023
LIN Guan-Hao, HUANG Mei, WU Mei
(Depto. de Farmacia, Hospital de Medicina Tradicional China de Haikou, Haikou 570216 Hainan, China）
Abstracto: Objetivo Investigar el efecto terapéutico y el mecanismo de laFórmula tonificante renal y activadora de la sangre compuesta porCistanche deserticay otras recetas(BHP, un compuesto herbal principalmente con las acciones de reponer los riñones y activar la sangre) en ratas con insuficiencia renal crónica. Métodos Cuarenta ratas SD se dividieron en un grupo normal (10 ratas), un grupo modelo (9 ratas), un grupo de dosis baja de BHP (10 ratas) y un grupo de dosis alta ( 10 ratas）. Excepto por el grupo normal, las ratas de todos los grupos se replicaron con el modelo de insuficiencia renal crónica por sonda de adenina. Después de una replicación exitosa, las ratas en los grupos de dosis alta y baja de BHP recibieron 0.52 y 2.08 g/kg de BHP por sonda, respectivamente, una vez al día durante 28 días consecutivos. . Después del final de la administración, los niveles séricos de función renal indican nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatinina en sangre (SCr) y ácido úrico (UA), y los niveles de estrés oxidativo indican malondialdehído (MDA) y superóxido dismutasa (SOD) en riñón. tejido se midieron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), los cambios histopatológicos del tejido renal de rata se observaron mediante tinción con hematoxilina-eosina (HE), y las expresiones proteicas de fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K), proteína quinasa B （Akt）, linfoma de células B 2 （Bcl-2） y proteína X asociada a Bcl-2 (Bax) en tejido renal fueron detectados por Western Blot. Resultados (1) En comparación con el grupo normal, los niveles de BUN, SCr y UA aumentaron en el grupo modelo (P<0.05) En comparación con el grupo modelo, los niveles de BUN, SCr y UA se redujeron significativamente en los grupos de dosis baja y alta de BHP (P<0.05). (2) En comparación con el grupo normal, el nivel de MAD aumentó y el nivel de SOD disminuyó en el grupo modelo (P <0,05); en comparación con el grupo modelo, el nivel de MAD disminuyó y el nivel de SOD aumentó en los grupos de dosis baja y alta de BHP (P <0,05); (3) en comparación con el grupo normal , cambios patológicos como necrosis leve e infiltración de células inflamatorias, dilatación tubular y deformación glomerular aparecieron en el tejido renal del grupo modelo; en comparación con el grupo modelo, las condiciones patológicas en los grupos de dosis baja y alta de BHP mejoraron. (4) En comparación con el grupo normal, los niveles de expresión de proteínas de PI3K y Akt en el tejido renal en el grupo modelo aumentaron significativamente (P<0,05); en comparación con el grupo modelo, los niveles de expresión de proteínas de PI3K y Akt en el el tejido renal en los grupos de dosis baja y alta de BHP disminuyó significativamente (P<0.05). (5) En comparación con el grupo normal, el nivel de expresión de proteína de Bcl- 2 en el tejido renal en el grupo modelo fue disminuyó y el nivel de expresión de proteína de Bax aumentó (P <0.05); en comparación con el grupo modelo, el nivel de expresión de proteína Bcl-2 en el tejido renal en los grupos de dosis baja y alta de BHP aumentó y el nivel de expresión de proteína de Bax disminuyó (P <0.05). Conclusión BHP tiene un efecto en la mejora de la lesión renal en ratas con insuficiencia renal crónica por un mecanismo relacionado con la inhibición de la vía de señalización PI3K/Akt y la regulación de la expresión de la proteína apoptótica relacionada.
Palabras clave:Fórmula tonificante renal y activadora de la sangre compuesta porCistanche deserticay otras recetas; insuficiencia renal crónica; estrés oxidativo; fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K); proteína quinasa B (Akt); linfoma de células B 2 (Bcl-2); Bcl-2 asociado X proteína (Bax); ratas
La insuficiencia renal crónica (CRF, por sus siglas en inglés) es un tipo de síndrome clínico que daña el riñón debido a una reacción autoinmune, herencia, dieta, infección y otros factores, lo que lleva a una función renal debilitada o incluso a la pérdida total de la función. La tasa de incidencia aumenta año tras año y es difícil de curar [1-3]. En los últimos años, el efecto terapéutico de la medicina tradicional china en la insuficiencia renal crónica ha recibido una atención cada vez más amplia. La insuficiencia renal crónica pertenece a la categoría de "Guange" y "edema" en la medicina tradicional china. La enfermedad ocurre principalmente en el riñón, que es un síndrome de deficiencia y exceso. La patogenia principal es la deficiencia renal y la estasis sanguínea, y el tratamiento principal es reponer el riñón y promover la circulación sanguínea [4]. Estudios anteriores han demostrado que el método de tonificación del riñón y activación de la circulación sanguínea puede mejorar de manera efectiva la condición de los pacientes con insuficiencia renal crónica, mejorar la microcirculación sanguínea e inhibir las reacciones inflamatorias en el cuerpo [5-6]. Sin embargo, el mecanismo terapéutico del método de tonificación del riñón y activación de la circulación sanguínea para la insuficiencia renal crónica no está del todo claro. Por lo tanto, este estudio estableció un modelo de rata de insuficiencia renal crónica para observar más a fondo los efectos y mecanismos de la fórmula autoformulada de tonificación del riñón y activación de la circulación sanguínea, con la intención de proporcionar una base de referencia para la aplicación clínica del método de tonificación del riñón. renal y activador de la circulación sanguínea para el tratamiento de la insuficiencia renal crónica. Los resultados de la investigación se informan a continuación.
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1 Materiales y Métodos
1.1 Animales de experimentación
Se compraron 40 ratas SD macho sanas de 6-semanas de edad con un nivel SPF, con un peso corporal de 130~170 g, de Beijing Innokai Technology Co., Ltd. con un número de licencia de producción animal de SCXK (Beijing) { {6}}. Antes del experimento, las ratas fueron alimentadas de forma adaptativa durante 2 semanas, alimentadas libremente con agua, con una temperatura ambiente de (24 ± 1) grados, humedad relativa de 40 por ciento a 60 por ciento y un ciclo de luz de 12 horas luz y 12 horas oscuro. Este esquema de investigación ha sido aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Medicina Tradicional China de Haikou.
1.2 Fármacos, reactivos e instrumentos
La receta para tonificar el riñón y activar la circulación sanguíneaconsta de 10 g de rehmannia cocida, 10 gramos deCistanche desertica,10 g de bazo de Xianling, 15 g de astrágalo crudo, 5 g de vino de ruibarbo, 10 g de salvia miltiorrhiza y 15 g de angélica. Todos los materiales de medicina tradicional china se compran en el Hospital de Medicina Tradicional China de Haikou. Decocción convencional, filtración, concentración a 4 g/mL de fármaco crudo, conservación para espera. adenina (Shanghai Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., número de lote: A800684); kit de prueba de creatinina sérica (SCr) (Beijing Lingbao Technology Co., Ltd.); Kit de detección de nitrógeno ureico (BUN) y ácido úrico (UA) (Beijing Boaze Technology Co., Ltd.); kit de detección de malondialdehído (MDA) y superóxido dismutasa (SOD) (Shanghai Qizheng Biotechnology Co., Ltd.); anticuerpo policlonal de conejo anti-fosfatidilinositol 3 quinasas intracelulares (PI3K), anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína quinasa B (Akt) (Shanghai Jinsui Biotechnology Co., Ltd.); anticuerpo de conejo anti-B linfocitos tumor 2 genes (Bcl-2), anticuerpo de conejo anti-Bcl-2 proteína X relacionada (Bax) (Guangzhou Chuanrong Biotechnology Co., Ltd.); Anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra (Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.). marcador enzimático MPR A100 [Yasuwang (Shanghai) Trading Co., Ltd.]; generador de imágenes de gel (Bio-Rad Company, EE. UU.); Analizador bioquímico totalmente automático ADVIA2400 (Siemens Company).
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1.3 Modelado, agrupación y administración
Seleccione 10 ratas como grupo normal y las 30 ratas restantes para construir un modelo de insuficiencia renal crónica. Determine si el modelo tiene éxito en función del nivel sérico de los indicadores de la función renal y los cambios patológicos renales en las ratas modelo [7]. Método de modelado [8]: Se administraron 250 mg/kg de adenina por sonda una vez al día durante 28 días consecutivos. Una rata murió durante el proceso de modelado. Las ratas modeladas con éxito se dividieron aleatoriamente en el grupo modelo (9 ratas), el grupo de dosis baja de Fórmula Bushen Huoxue (10 ratas) y el grupo de dosis alta de Fórmula Bushen Huoxue (10 ratas). Después de completar el modelo, la dosis diaria de adultos se convirtió en la dosis de ratas de acuerdo con los "Métodos experimentales farmacológicos", y se estableció como una dosis baja de fórmula tonificante renal y activadora de la sangre. Los grupos de dosis baja y alta de Fórmula Bushen Huoxue recibieron 0,52 y 2,08 g/kg de solución de Fórmula Bushen Huoxue por sonda. El grupo normal y el grupo modelo recibieron volúmenes iguales de solución salina fisiológica por sonda. Una vez al día durante 28 días consecutivos.
1.4 Indicadores y métodos de observación
1. 4. 1. Detección de indicadores de función renal
Después de la intervención, se recogió sangre de la aorta abdominal de las ratas y las muestras de suero se aislaron después de la centrifugación. Se utilizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para detectar los niveles de SCr, BNU y UA en ratas de cada grupo. La operación se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del kit.
1. 4. 2 tinción HE
Se tomó tejido renal de rata, se fijó, se deshidrató, se incluyó en parafina, se seccionó, se tiñó, se deshidrató y se volvió a sellar. Se observaron y fotografiaron cambios patológicos en tejido renal de rata.
1. 4. 3 Detección de indicadores de estrés oxidativo en tejido renal
Tomar tejido de riñón de rata, preparar el homogeneizado, centrifugar y separar el sobrenadante. De acuerdo con las instrucciones del reactivo, utilice un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para detectar los niveles de MDA y SOD.
1. 4. 4 Prueba de inmunotransferencia de proteínas
Después de tomar el homogeneizado de tejido de riñón de rata, agregue RIPA para extraer la proteína total, centrifugue a 3000 r/min (radio de centrifugación: 15 cm) durante 10 minutos, tome el sobrenadante y mida el contenido de proteína. Después de la separación de proteínas mediante electroforesis en gel, transferencia de membrana, sellado y limpieza de TBST, los anticuerpos primarios PI3K, Akt, Bcl-2, Bax y actina (diluidos en una relación de volumen de 1:1000) se incubaron durante la noche a 4ºC. grado, se lavó la película y se añadió un segundo anticuerpo (diluido en una proporción de volumen de 1:5000) para continuar la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. ECL se expuso para el desarrollo y el valor gris de las bandas electroforéticas se analizó utilizando el software ImageJ. Resultados Basados en la representación de la proporción de valor en escala de grises de la proteína diana y la proteína de referencia interna (acción).
1.5 Métodos estadísticos
Para el análisis de los datos se utilizó el software estadístico SPSS 25.0. Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar (x ± s). Se realizó un análisis de varianza univariante para la comparación entre múltiples grupos, y se usó una prueba t para la comparación entre los dos grupos. La diferencia fue estadísticamente significativa cuando P<0.05 was used.
2 resultados
2.1 Comparación de los niveles del índice de función renal de las ratas en cada grupo
La Tabla 1 muestra que, en comparación con el grupo normal, los niveles de BUN, SCR y UA en el grupo modelo aumentaron (P<0.05); Compared with the model group, the levels of BUN, SCr, and UA in the low and high dose groups of Bushen Huoxue Formula decreased (P<0.05) in a dose-dependent manner. Comparison of renal histopathological changes of rats in each group Figure 1 shows that the renal tissue structure of rats in the normal group is complete, with an orderly arrangement of glomeruli and renal tubules, without significant abnormal changes; Compared with the normal group, the model group had mild necrosis and inflammatory cell infiltration in the renal tissue, renal tubular dilation, glomerular deformation, and other pathological changes; Compared with the model group, the pathological conditions of the low and high dose groups of Bushen Huoxue Recipe were improved.
Tabla 1 Comparación de los niveles de indicadores de función renal entre varios grupos de ratas（x ± s）
Nota: ① P ＜ 0.05, en comparación con el grupo normal; ② PAG<0.05, compared with the model group; ③ P<0.05, compared with the low dose group of Bushen Huoxue Formula
Figura 1 Comparación de cambios histopatológicos de tejidos de riñón de rata entre varios grupos（HE tinción,×400）
Comparación de los niveles del índice de estrés oxidativo en tejido renal de ratas en cada grupo
La Tabla 2 muestra que, en comparación con el grupo normal, el nivel de MDA en el tejido renal de las ratas del grupo modelo aumentó, mientras que el nivel de SOD disminuyó (P<0.05); Compared with the model group, the MDA level in the kidney tissue of rats in the low and high dose groups of Bushen Huoxue Recipe decreased, while the SOD level increased (P<0.05).
El nivel de expresión de las proteínas PI3K y Akt en tejido renal de ratas en cada grupo
Al comparar la Tabla 3 y la Figura 2, los resultados mostraron que, en comparación con el grupo normal, los niveles de expresión de las proteínas PI3K y Akt en el tejido renal del grupo modelo aumentaron significativamente (P<0.05); Compared with the model group, the expression levels of PI3K and Akt proteins in the kidney tissue of rats in the low and high dose groups of Bushen Huoxue Formula decreased (P<0.05).
Tabla 2 Comparación de los niveles de indicadores de estrés oxidativo en tejidos renales entre varios grupos de ratas （x ± s）
Nota: ① P ＜ 0.05, en comparación con el grupo normal; ② PAG<0.05, compared with the model group; ③ P<0.05, compared with the low dose group of Bushen Huoxue Formula
Tabla 3 Comparación de los niveles de expresión de proteínas de PI3K y Akt en tejidos renales entre cada grupo de ratas（x ± s）
Nota: ① P ＜ 0.05, en comparación con el grupo normal; ② PAG<0.05, compared with the model group; ③ P<0.05, compared with the low dose group of Bushen Huoxue Formula
Niveles de expresión de proteínas Bcl-2 y Bax en tejidos renales de ratas en cada grupo
Al comparar los resultados de la Tabla 4 y la Figura 3, se muestra que, en comparación con el grupo normal, el nivel de expresión de la proteína Bcl-2 en el tejido renal de las ratas del grupo modelo disminuyó significativamente, mientras que el nivel de expresión de Bax proteína aumentó significativamente (tanto P<0.05); Compared with the model group, the expression level of Bcl-2 in the kidney tissue of rats in the low and high dose groups of Bushen Huoxue Formula increased, while the expression level of Bax decreased (both P<0.05).
Figura 2 Electroferogramas de Western Blot de proteínas PI3K y Akt en tejidos renales en cada grupo de ratas
Tabla 4 Comparación de los niveles de expresión de proteínas de Bcl-2 y Bax en tejidos renales entre varios grupos de ratas （x ± s）
Nota: ① P ＜ 0.05, en comparación con el grupo normal; ② PAG<0.05, compared with the model group; ③ P<0.05, compared with the low dose group of Bushen Huoxue Formula
Figura 3 Electroferogramas de Western Blot de proteínas Bcl-2 y Bax en tejidos renales en cada grupo de ratas
3 Discusión
El modelo de insuficiencia renal crónica inducida por adenina es un método común para la detección de fármacos terapéuticos para la insuficiencia renal crónica y para aclarar el mecanismo de acción del fármaco [9]. El metabolito muscular SCr, el producto final del metabolito de purina UA y el compuesto plasmático que contiene nitrógeno BUN se acumulan en la sangre durante el daño de la función renal y son indicadores importantes para detectar la función renal [10-11]. En este estudio, se estableció un modelo de insuficiencia renal crónica por daño renal inducido por adenina en ratas. Los resultados del modelo mostraron que en el grupo modelo, los niveles de SCr, BUN y UA en la sangre aumentaron, se produjo infiltración de células inflamatorias en el tejido renal, dilatación tubular renal, deformación glomerular y otros cambios patológicos, lo que indica que el modelo fue exitoso. Después del tratamiento con diferentes concentraciones de Bushen Huoxue Formula, los niveles de SCr, BUN y UA en la sangre de las ratas disminuyeron, y la estructura del tejido renal y la función fisiológica mejoraron en diversos grados, lo que sugiere queFórmula tonificante renal y activadora de la sangre compuesta porCistanche deserticay otras recetastiene un efecto protector sobre los riñones de ratas con insuficiencia renal crónica.
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Algunos estudios han demostrado que el estrés oxidativo puede promover la progresión de la insuficiencia renal, y el grado de estrés oxidativo en el tejido renal aumenta con el aumento gradual del grado de daño de la función renal. SOD es una clase de factores que pueden defender contra reacciones inflamatorias, y MDA es el producto de descomposición de la peroxidación de lípidos en el cuerpo [13]. Por lo tanto, la mejora de los niveles de SOD, la reducción de los niveles de MDA y la reducción de los niveles de estrés oxidativo en el tejido renal pueden inhibir eficazmente la progresión de la insuficiencia renal crónica. Los resultados de este estudio también confirmaron que después de la intervención de Bushen Huoxue Formula, el nivel de indicadores de estrés oxidativo en ratas disminuyó, lo que indica queFórmula tonificante renal y activadora de la sangre compuesta porCistanche deserticay otras recetaspuede desempeñar un papel en el estrés antioxidante y las reacciones antiinflamatorias, e inhibir el desarrollo de insuficiencia renal.
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PI3K es una importante vía de transducción de señales en el proceso de transducción de señales del factor de crecimiento. Akt es una serina proteína quinasa que pertenece al factor aguas abajo de PI3K. En el proceso de insuficiencia renal crónica, la vía PI3k/Akt está involucrada en reacciones inflamatorias, apoptosis de células parenquimatosas, diferenciación y formación y depósito de colágeno. Mentira Beifeng et al. [14] encontraron que la expresión de Akt fosforilada en tubulointersticio renal de ratas modelo de nefropatía diabética aumentó, lo que indica que la vía de señalización PI3K/Akt puede participar en el proceso de lesiones tubulares renales. En ratas modelo de insuficiencia renal crónica, la vía de señalización PTEN/PI3k/Akt está implicada en el proceso de fibrosis intersticial renal [15]. Otros estudios han demostrado que 5/6 ratas nefrectomizadas pueden inhibir el TGF por la vía de señalización de /PI3K/Akt, lo que reduce efectivamente la SCr, alivia la fibrosis renal y mejora la función renal en ratas [16]. Runyan et al. [17] encontraron que TGF en células glomerulares: estimular la fosforilación de Akt y administrar inhibidores de PI3k a las células glomerulares puede reducir la expresión de TGF-. Los resultados de este estudio indican que Bushen Huoxue Formula puede inhibir la expresión de la proteína PI3k/Akt en el tejido renal de ratas con insuficiencia renal crónica, inhibir la vía de señalización de PI3k/Akt y, por lo tanto, retrasar la progresión de la enfermedad en ratas con insuficiencia renal crónica. falla. Para el tejido renal, la apoptosis tiene un doble efecto [18]: por un lado, la apoptosis puede eliminar las células de invasión inflamatoria y las células proliferativas anormales, promoviendo la reparación de la estructura del tejido renal y la recuperación de la función renal; Por otro lado, la apoptosis a menudo conduce a una disminución en el número de células renales, lo que juega un papel clave en la aparición de glomeruloesclerosis y atrofia tubular, y puede exacerbar la progresión de la enfermedad renal. La investigación [19] muestra que el número de apoptosis en las células tubulares renales en pacientes con enfermedad renal es significativamente mayor que en individuos sanos, y el número de apoptosis en el tejido renal está estrechamente relacionado con el índice de lesión intersticial renal, el índice de fibrosis renal, el índice urinario. nivel de proteína y el grado de deterioro de la función renal. La familia de proteínas apoptóticas Bcl-2 se puede dividir en tres categorías: proteínas promotoras proapoptóticas, proteínas efectoras proapoptóticas y proteínas antiapoptóticas. El antagonismo entre las proteínas proapoptóticas y las proteínas antiapoptóticas determina el proceso de apoptosis de este gran número de células [20]. La investigación [18] muestra que inducir la regulación al alza de la expresión de Bcl-2 puede reducir la apoptosis celular. En modelos de lesión renal aguda y modelos de insuficiencia renal crónica, la anulación de los genes Bax y Bak en las células epiteliales tubulares renales proximales puede reducir la apoptosis de las células epiteliales tubulares renales y aliviar el grado de insuficiencia renal [18]. Los resultados de este estudio indican que la expresión de la proteína Bcl-2 aumenta y la expresión de la proteína Bax disminuye en ratas con insuficiencia renal crónica tratadas conFórmula tonificante renal y activadora de la sangre compuesta porCistanche deserticay otras recetas. Esto puede deberse a que la Receta Bushen Huoxue inhibe la expresión de las proteínas Bcl-2 y Bax relacionadas con la apoptosis aguas abajo de la vía de señalización PI3K/Akt, inhibe la apoptosis de las células renales, aliviando así la fibrosis renal y retrasando el deterioro de la función renal.
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En resumen,Fórmula tonificante renal y activadora de la sangre compuesta porCistanche deserticay otras recetaspuede aliviar el daño de la función renal en ratas con insuficiencia renal crónica, y su mecanismo puede estar relacionado con la inhibición de la vía de señalización de PI3K/Akt y la regulación de la expresión de las proteínas apoptóticas Bcl-2 y Bax. Además, la fibrosis renal y el deterioro de la función renal en ratas con administración intragástrica de adenina pueden estar más estrechamente relacionados con la lesión tubular renal, y es necesario estudiar más a fondo los mecanismos más profundos.
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