Efecto de los extractos de Cistanche Tubulosa sobre la función reproductora masculina en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina-nicotinamida

Palabras clave:diabetes; esterilidad;Cistanche tubulosaextracto(CTE);echinacósido(ECH);antiinflamatorioactividad;antioxidanteactividad;esteroidogénesisefectos

Para obtener más información sobre los beneficios del polvo de extracto de cistanche

1. Introducción

La diabetes mellitus (DM) es una condición en la que hay un aumento de los niveles de glucosa en la sangre debidoa la ineficiencia del páncreas para producir suficiente insulina, o la incapacidad del cuerpo para usarlaefectivamente. Según la OMS, el número de personas con diabetes aumentó de 108 millones en 1980a 422 millones en 2014 [1]. Hay cuatro categorías principales: prediabetes (una etapa previa a la diabetes), tipo 1(cuando el páncreas no produce insulina), tipo 2 (el cuerpo no usa insulina) y gestacionaldiabetes (que ocurre durante el embarazo). El estrés oxidativo se produce debido al desequilibrio entre laproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y antioxidantes [2] finalmente conduce a la condición diabética.Las complicaciones de la diabetes incluyen insuficiencia renal, daño a los nervios, ceguera, accidente cerebrovascular, problemas cardíacosataque, muerte fetal e infertilidad. [1]. Los estudios muestran que los núcleos espermáticos, el ácido desoxirribonucleico (ADN),y las mitocondrias se dañaron significativamente en pacientes diabéticos masculinos [3]. Estrés oxidativo duranteel transporte de esperma alterará el proceso del sistema reproductivo masculino [4,5]. 

El proceso de espermatogénesis está controlado por el hipotálamo-hipófisis-gonadal (HPG)eje. La hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) producida por el hipotálamo estimula elproducción de hormona luteinizante (LH) y hormona estimulante del folículo (FSH). Se encuentran células de Leydigadyacente al túbulo seminífero y produce testosterona bajo el control de la LH. Desencadenantes de FSHla producción de proteína de unión a antígeno (ABP) que ayuda a pasar la hormona masculina. Así, la infertilidady otros problemas surgen principalmente debido a las perturbaciones que se producen en el eje HPG. Administración dela combinación de estreptozotocina-nicotinamida induce diabetes en ratas experimentales. estreptozotocinaes un compuesto químico tóxico para los productores de insulina células en el páncreas y la nicotinamida es unvitamina hidrosoluble que protege el células del daño completo [6]. Cistanche tubulosaes una especie de planta del desierto también conocida como "Rou Cong-Rong" [7]. Es unplanta parásita no clorofílica que crece principalmente en la raíz delCalotropis proceraárbol y esampliamente distribuido en las tierras áridas de Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolia, Irán e India. Lo comúnnombre deCistanche tubulosaes "Jacinto del Desierto". Es ampliamente aceptado en la medicina tradicional china.y se le ha dado el nombre de "Ginseng del Desierto". Es ampliamente utilizado en el campo de la medicina paratratar leucorrea mórbida, metrorragia profusa, enfermedades renales crónicas, estreñimiento, impotencia yesterilidad. constituyentes químicos deCistanche tubulosaconsisten en glucósidos feniletanoides no volátiles(PHG), iridoides, lignanos, aceites volátiles, alditoles, oligosacáridos y polisacáridos [8]. Estudiosmuestran que el equinacósido de esta hierba protege los fibroblastos dañados al regular los niveles de ROS [9]. Este compuesto produce actividades antioxidantes, vasorrelajantes y antiinflamatorias junto conneuroprotección y prevención de la osteoporosis [10,11]. Este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto deCistanche tubulosaextractoque contiene ECH en eldisfunción reproductiva de la rata diabética inducida por estreptozotocina-nicotinamida.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

ECH y CTE se adquirieron de Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwán). AvanzadoLos productos finales de glicación (AGE) se adquirieron de Biovision (San Francisco, CA, EE. UU.). CL-540y las líneas celulares TM3 se compraron del Instituto de Investigación y Desarrollo de la Industria Alimentaria(Hsinchu, Taiwan). Se compraron ratas macho Sprague-Dawley (SD) de cinco semanas de edad de laCentro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán). Dieta de laboratorio de alimentación® fue comprado de PMINutrition International, Inc. (Taipei, Taiwán). Se obtuvo 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Metanol y 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico(HEPES) también se adquirieron de Sigma. Eagle medium/F12 modificado de Dulbecco ytripsina-EDTA se obtuvieron de GIBCO (Nueva York, NY, EE. UU.). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT), diacetato de dicloro-dihidro-fluoresceína (DCFH-DA), dimetilsulfóxido (DMSO) y nitroazul de tetrazolio (NBT) se adquirieron de Sigma. glucosa enzimáticaLos kits se obtuvieron de Kyokutoseiyaku, Tokio, Japón. Se compraron kits ELISA de insulinade Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Suecia). Extracción de proteína tisular T-PEREl reactivo se adquirió de Thermo Scientific (Chicago, IL, EE. UU.). Anti-Humano/Ratón/Rata nuclearfactor-kappa B NF-κLos anticuerpos policlonales B se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, California, Estados Unidos. Receptor anti-ratón/rata para productos finales de glicación avanzada (RAGE) policlonalanticuerpos policlonales anti-Humano/Ratón/Rata StAR y anti-Humano/Ratón/RataLos anticuerpos monoclonales de citocromo P450 17A1 se adquirieron de Gene Tex (Irvine, CA, EE. UU.).Los anticuerpos policlonales anti-humano/ratón/rata CYP11A1 se obtuvieron de Cell SignalingTecnología (Beverly, PA, EE. UU.). El reactivo easy-Blue se adquirió de Invitrogen, Thermo FisherCientífico (Carlsbad, CA, EE. UU.). La agarosa y el marcador de ADN de 100 pb se obtuvieron de Promega,Corporación (Madison, WI, EE. UU.). El kit RNeasy Lipid Tissue Mini se adquirió de QIAGEN,Hilden, Alemania.

un 5 por ciento de CO2 incubadora (CO2 incubadora, Napco 5410, Taiwán). La línea celular TM3 se cultivó en Dulbecco'smedio Eagle modificado (DMEM) suplementado con glucosa (4.5 g/L), piruvato de sodio (0.5 mM),L-glutamina (2,5 mM), bicarbonato de sodio (1,2 g/L), 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónicoácido (HEPES, 15 mM), y suero fetal de ternera (FCS, 10 por ciento) o suero de caballo (5 por ciento) a 37◦C en un 5 por cientoCO2 incubadora.

Determinación de la viabilidad celular del equinacósido (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-Se usó reactivo de bromuro de difeniltetrazolio (MTT) para el ensayo de viabilidad celular. La concentracion de celulasse ajustó a 2× 105células/ml en una 96-placa de pocillos. Entonces, 20µL de ECH (diluido en 2 por ciento de medio)se añadió y se incubó durante 24 h a 37◦C en un 5 por ciento de CO2 incubadora. Más tarde, 100µL de reactivo MTT fueañadido e incubado durante 4 h a 37◦C en condiciones de oscuridad. La absorbancia se midió a 570 nm(lector ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Suiza).Viabilidad celular relativa (porcentaje)=[(Amuestra a 570 nm− Aen blanco a 570 nm)]/[(Acontrolar en 570− Aen blanco en 570)] × 100.

Análisis del contenido de especies reactivas de oxígeno (ROS):

El número de celda se ajustó a2 × 105células/mLen una 12-placa de pocillos que contiene un 2 % de FBS. Entonces, 50µL/ml de ECH, RES y AGEse agregaron a la placa y se incubaron a 37◦C durante 24 horas. Después de 24 horas, 20 ,70 -diclorofluoresceína-diacetato(DCFH-DA) y se incubó a 37◦C durante 30 min. Después de la centrifugación (400× g, 5 minutos),

y AGE se añadieron y se incubaron a 37◦C en un 5 por ciento de CO2 incubadora durante 24 h. después, 400µL de T-PERse agregaron, se rasparon las células y se centrifugaron a 125,000× g durante 20 minutos (4◦C). el sobrenadantefue recolectado y almacenado en−80 ◦C (−80 ◦C congelador, Nuaire, Plymouth, MN, EE. UU.) para su posterior análisis.

Se utilizó el kit de ácido bicinconínico (BCA) para la cuantificación de proteínas. Entonces, 10µL de solución celular estándary 200µSe añadieron L de reactivo BCA a 8-placas de pocillos y se incubaron a 37 ºC.◦C en un 5 por ciento de CO2 incubadoradurante 30 min. La absorbancia se midió a 562 nm. Se realizó un análisis de identificación de proteínas.mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS) (SDS-PAGE). Las muestras fueronpreparado agregando lisado de proteínas al tampón de carga de proteínas y se realizó un análisis de transferencia Westernpara detectar las proteínas específicas.

2.2.2. Análisis in vivo

Diseño de modelo animal: Se compraron ratas macho Sprague-Dawley (SD) de 4-semanas de edad de laCentro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán). Cada rata se alojó individualmente en desinfectantejaulas de acero inoxidable a temperatura controlada (23± 1 ◦C) y humedad (40–60 por ciento) con 12 hciclo luz/12 h oscuridad. Se proporcionó alimento y agua ad libitum. Cada rata fue domesticada en los primerossemana y se les administró la dieta para roedores de laboratorio 5001 como dieta principal. Todos los procedimientos siguieron el estándar.del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Aprobación IACUC No. 101026) de laUniversidad Oceánica de Taiwán, Taiwán. Después de la domesticación, las ratas se dividieron en dos grupos: el controlgrupo (Con) que fue alimentado con la dieta de laboratorio 5001, y el grupo diabético que fue alimentado con una dieta alta en grasas(HFD, 40 por ciento) para todo el experimento. Después de ser alimentado con el HFD durante 4 semanas, el grupo de diabéticosa ratas se les inyectó estreptozotocina (65 mg/kg) (STZ) para inducir diabetes mellitus (DM). Dentro deA los 15 min de inyectar STZ, se inyectó nicotinamida (230 mg/Kg de peso corporal). Una semana después de la inyección,Se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) para determinar la inducción exitosa de diabetesMellitus (DM). Después de eso, los animales se dividieron en seis grupos: el control (alimentado con dieta de laboratorio5001); grupo DM (DM más 45 por ciento HFD); grupo DMR (DM más rosiglitazona: 0,571 mg/kg BW) más 45 por ciento HFD;grupo DME1 (DM más CTE: 80 mg/kg BW) más 45 por ciento HFD; Grupo DME2 (DM más CTE: 160 mg/kg BW)más 45 por ciento HFD; y grupo DME4 (DM más CTE: 320 mg/kg BW) más 45 por ciento HFD. La rosiglitazona (RSG) fuetomado como control positivo. Se utilizaron tres dosis de CTE (80, 160 y 320 mg/kg) segúnla recomendación de la Administración de Drogas y Alimentos de Taiwán (TFDA) alimentos saludables funcionalespautas de evaluación. Los tratamientos se dieron hasta el final del experimento. Todas las ratas experimentalesfueron sacrificados después de 6 semanas. La sangre extraída de las ratas se centrifugó a 3000 rpm durante15 minutos a las 4◦C. El sobrenadante se examinó para el siguiente análisis:Glucosa total, triglicéridos y colesterol

Determinación:

La determinación de glucosa fuellevado a cabo por kits enzimáticos de glucosa. Entonces, 20µL de muestras de plasma sanguíneo se agregaron a lareactivos y se mantienen a 37◦C durante 5 min. Los triglicéridos totales y la concentración de colesterol total fuerondeterminado mediante el uso de kits enzimáticos de triglicéridos y colesterol. Entonces, 10µL de plasma sanguíneo fueronse agregó a los reactivos y el experimento se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.La absorbancia se midió a 510 nm.Glucosa total en plasma/triglicéridos/colesterol (mg/dL)=(Amuestra− AVacío)/(Aestándar− AVacío) × 200. Una muestra: Absorbancia de muestras de sangre, AVacío: Valor de absorbancia de kits sin muestra, Estándar: valor de absorbancia del reactivo estándar, 200: reactivos estándar a una concentración de200 mg/dl.Evaluación de la insulina, la leptina y el modelo homeostático: determinación de la resistencia a la insulina (HOMA-IR):El nivel de insulina se determinó mediante kits ELISA de insulina. Aquí, 25µSe añadieron L de plasma sanguíneo a lareactivos y la absorbancia se midió a 450 nm. El contenido total de leptina se determinó utilizandokit de ensayo inmunométrico de la enzima leptina. Entonces, 100µL de plasma fueron analizados y la absorbanciase midió a 450 nm usando un lector de ELISA. Todo el experimento se llevó a cabo de acuerdo conlas instrucciones del fabricante. El valor HOMA-IR se determinó a partir del modelo de homeostasisecuación de evaluación=Concentración de insulina plasmática en ayunas (mU/mL)× glucosa plasmática en ayunasconcentraciones (mmol/L)/22,5.Peroxidación de lípidos en plasma: Aquí, 0.5 mL de plasma sanguíneo se mezclaron con 1 mL de reactivo (15 por ciento,p/v ácido tricloroacético en {{0}}.25 N ácido clorhídrico (HCl) y 0.375 por ciento,w/v ácido tiobarbitúrico en0.25 N HCl) y se colocan en un baño de agua (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Suiza) a 100◦C para15 minutos. Después de enfriar, se añadió 1 mL de n-butanol, se agitó vigorosamente y se centrifugó a 1500× g durante 10 min. Se recogió el sobrenadante y se midió la absorbancia a 532 nm [12]. Concentración de malondialdehído (MDA) (nM/mL)=[(Una muestraa 532nm− Aen blanco a 532 nm)/ (Estándara 532nm− Aen blanco a 532 nm)] × 5. Determinación de los niveles plasmáticos de testosterona y hormona luteinizante (LH): la testosteronaEl kit ELISA se utilizó para medir el nivel de testosterona en el plasma sanguíneo. El kit RIA se utilizó paradeterminar la concentración de LH. Entonces, 50µSe añadieron L de plasma y los cálculos se basaronde la concentración de la hormona LH-RP-3 (estándar). Los pasos posteriores se llevaron a cabo de acuerdoa las instrucciones del fabricante.Determinación del Factor de Necrosis Tumoral (TNF)- e interleucina-6 (IL-6) Concentración:El anticuerpo capturado se diluyó 250 veces en tampón de recubrimiento, se añadió a una 96-placa de pocillos (100µL/bien),y se mantuvo a las 4◦C para pasar la noche. El sobrenadante fue aspirado y lavado quince veces con lavadotampón (1 vez PBS, 0.05 por ciento Tween 20). Después de la incubación (1 h) con 200µg de diluyente de ensayo, las células selavado 5 veces con tampón de lavado y 100µL de TNF- solución estándar o muestras de prueba fueronse añade a cada pocillo y se incuba durante 2 h. Después del lavado, 100µSe agregaron L de IL-6 anticuerpos detectadosy se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante fue aspirado y lavado 5 veces. Después,480 µSe añadieron L de enzima avidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente.la temperatura. El sobrenadante se aspiró y se lavó cinco veces con tampón de lavado. Entonces, 100µL de solución de sustrato se añadieron y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Más tarde, 50µL de paradasolución (ácido fosfórico 1 M) a cada pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm.Análisis de Parámetros de Espermatozoides y TestículosRecolección de muestras de esperma: La recolección de muestras de esperma se realizó de acuerdo con lasmétodo previamente informado en [13]. Los espermatozoides se recolectaron del sobrenadante y se usaron paraanálisis mas extenso.La cantidad de espermatozoides, la motilidad de los espermatozoides y los espermatozoides anormales: la cantidad de espermatozoides fuecalculado utilizando el hemocitómetro y la solución de azul de tripano. Entonces, 100µL de líquido de esperma fueronse mezcló con una solución de azul tripán y se determinó el número de espermatozoides, la motilidad y los espermatozoides anormales.calculado usando un hemocitómetro y un microscopio [14]. Nitro azul tetrazolio NBT Reducción y peroxidación lipídica de espermatozoides y testículos: el lípidola peroxidación y la reducción de NBT se analizaron según el mismo procedimiento de análisis de plasma.

Determinación de Superóxido Dismutasa (SOD) y Actividad Catalasa: Superóxido dismutasaLa actividad de (SOD) se analizó utilizando el kit RANSEL. Aquí, 0.05 ml de homogeneizados testicularesse añadieron a 1,7 ml de solución de reacción (0.0xantina 5 mM, 2-(4-yodofenil)- 0,025 mM{{0}}(4-nitrofenol)-5-cloruro de feniltetrazolio (INT)). Después de mezclar, 0,25 ml de xantina oxidasa (80 U/L)se añadió y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 s a temperatura ambiente. La absorbancia fuemedida a 505 nm. La concentración de proteína del homogeneizado testicular se determinó mediante laSe calculó el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad DC y su actividad específica (U/mg de proteína). la catalasa(CAT) la actividad se determinó de acuerdo con un método informado previamente [15]. Tinción H&E (hematoxilina y eosina)Los testículos se empaparon en formalina al 10 por ciento durante 24 h y se almacenaron a 4◦C. Cortar los tejidos en eltamaño micro y pegado al portaobjetos. Después de la fijación (95 por ciento de metanol más 5 por ciento de ácido acético), los portaobjetos sesumergidos en hematoxilina durante 3 min, lavados con agua corriente durante 5 min y luego empapados con50 por ciento, 70 por ciento y 90 por ciento de alcohol durante un minuto. Posteriormente, los portaobjetos se tiñeron con eosina durante 10 s yempapado en alcohol al 100 por ciento durante un minuto hasta que se desvaneciera. Finalmente, el portaobjetos se empapó en xileno durante unaminuto. Posteriormente, el portaobjetos se secó al aire y se selló. El tubo teñido se colocó en un contraste de fase invertidomicroscopio (microscopio de diferencia de fase invertida, Olympus CK-2, Tokio, Japón) para observarla morfología.Análisis del HipotálamoEl receptor acoplado a proteína G KISS1 de ratón (GPR) 54, supresor de la señalización de citoquinas 3 (SOCS-3)y sirtuina 1(SIRT1)Se identificaron secuencias de genes del NCBI (Centro Nacional de BiotecnologíaInformation) se diseñó una base de datos de genes y un cebador específico usando Primer 5.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, CA, EE. UU.). Los cebadores utilizados en el experimento se enumeran en la Tabla1.

Extracción de ácido ribonucleico (ARN) del hipotálamo. La extracción de ARN de lahipotálamo del cerebro se llevó a cabo usando el Mini Kit de Tejido Lípido RNeasy. Lo obtenidoLos ARNm se midieron cuantitativamente mediante transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa.(PCR). El ADN complementario obtenido del análisis RT se almacenó en−20 ◦C para su uso posterior.El ADN extraído se sometió a análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando polimerasa Taq.Entonces, 5~10µSe tomaron L del producto de PCR y se analizaron por electroforesis en agar al 1,5 por ciento.coloide. La imagen fue tomada en un sistema de imágenes UVP BioDoc-It. Complementario con transcripción inversaSe tomó ácido desoxirribonucleico (ADNc) y se realizó una PCR usando el IQ SYBR Green SupermixEquipo. Posteriormente, se analizó con el Software del Sistema Óptico iQTM 5. Las proteínas se extrajeron utilizando unreactivo de extracción de proteínas (T-PER). Luego, se agregaron 20 mg de homogeneizado testicular a 400µL de T-PER y centrifugado (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Alemania) a 4◦C (125,000× g) durante 20 min. El siguiente método fue similar a la "identificación y cuantificaciónanálisis de proteínas" en análisis in vitro.2.3. Análisis estadísticoLos resultados experimentales se expresaron como la media± desviación estándar (media± SD) y elLos datos se analizaron con el software Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk,Nueva York, Nueva York, Estados Unidos. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante análisis unidireccional devarianza (ANOVA). Las comparaciones múltiples de diferentes grupos se analizaron mediante la prueba de Duncan en elvalor dep < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Resultados

3.1. Análisis in vitro

3.1.1. Comparación de las actividades antioxidantes de ECH, CTE y RES

El alto estrés oxidativo a largo plazo y la inflamación crónica son las principales causas de diabetes.complicaciones [16]. Los CTE contienen varios glucósidos feniletanoides como el equinacósido(ECH) y acteoside, con el potencial de actividad antioxidante [17]. Eliminación de radicales DPPHSe realizó un ensayo para evaluar la actividad antioxidante de ECH. Trolox y resveratrol(3,5,4'-trihidroxiestilbeno, RES) se tomaron como estándar y control positivo respectivamente. Como se muestraEn figura1, ECH mostró una mejor actividad de eliminación de radicales y la actividad fue significativamente mayorque la del control positivo (RES).

3.1.2. Viabilidad celular de ECH en LC-540 y TM3 Leydig CellsEl ensayo MTT se realizó para evaluar la viabilidad celular de diferentes concentraciones de ECH.Las células de Leydig LC-540 y las células de Leydig TM3 mostraron más del 80 por ciento de viabilidad después de ser tratadas conECH (Figura2). En comparación con las otras concentraciones, un 100-µConcentración de M (diluciones de 100µM en 2 por ciento de FBS) de ECH mostró una mejor viabilidad celular en células TM3 Leydig. El resultado indicó que elel aumento de la concentración de ECH no aporta ninguna toxicidad significativa a las células.

3.1.3. Efecto de ECH en la producción de superóxido inducida por AGE mediante el ensayo NBT en LC-540 y TM3Células de Leydig

Los AGE causan daño oxidativo en el cuerpo debido a la oxidación de la glucosa y la formación deradicales libres como O2-, radicales hidroxilo y grupos carbonilo [18]. Después de ser estimulado con50 µg/ml de AGE, la CL-540 (Figura3a) y TM3 (Figura3b) las células se trataron con ECH y RES(5 µM y 10µM cada uno). Los resultados mostraron que la producción de anión superóxido se incrementóen el grupo de control (AGE estimulados), pero la producción de anión superóxido disminuyó despuéstratamiento con ECH y RES. De la figura3, se entendió que la ECH y RES reducen el nivelde la producción de superóxido y protegen las células del daño oxidativo. En el caso de celdas LC-540,10 µM ECH mostró una actividad casi similar con el grupo normal. La producción de superóxido en amboslas células se redujo con un aumento en la concentración de ECH y RES.3.1.4. Efecto de ECH en H2O2 Producción en células de Leydig LC estimuladas por AGE-540Se ejecutó el ensayo DCFH-DA para detectar la presencia de especies oxidativas. Después de entrar enlas células, el tinte fluorescente FL DCFH-DA es oxidado por H intracelular2O2 y forma diclorofluoresceína(FCD). Como se muestra en la figura4, hubo un aumento significativo en H intracelular2O2 producción en elgrupo estimulado con AGE (control) mientras que la adición de 10µM ECH y RES reducidos significativamenteEl h2O2 producción en las células. administración de 10µM ECH resultó en solo alrededor del 47.1 por ciento de H2O2 producción, significativamente menor que en el grupo de control.

3.1.5. Efecto de ECH en RAGE y NF-κNiveles de expresión de proteína B en LC estimulada por AGE-540Células de Leydig

Se realizó un análisis de transferencia Western para confirmar la presencia de RAGE en LC-540 Leydigcélulas. El efecto de ECH en RAGE (Figura5a) y NF-κB (Figura5b) niveles de expresión de proteínasen las células de Leydig estimuladas por AGE se muestran en la Figura5. Los resultados mostraron que, 50µg/mLconcentración de AGEs indujo mayor RAGE y NF-κExpresión B en LC-540 células de Leydig y10 µLa concentración de M de ECH y RES ha reducido significativamente la expresión de RAGE y NF-κB. La expresión de NF-κB fue significativamente menor en RES y ECH que en los antagonistas de RAGE. Entonces, los resultadosconfirmó que la ECH redujo el nivel de inflamación al disminuir el nivel de RAGE y NF-κB.

.1.6. Efecto de ECH en la vía de síntesis de testosterona en células de Leydig LC-540 estimuladas por AGE.

El proceso de espermatogénesis e infertilidad masculina depende de la presencia de testosterona.Como se muestra en la figura6, las expresiones de StAR (Figura6a), CYP11A1 (Figura6b), CYP17A1 (Figura6c), y HSD17 3 (Figura6d) las proteínas se redujeron significativamente en LC estimulada por AGE-540 Leydigcélulas (grupo de control). Las expresiones de StAR, CYP11A1, CYP17A1 y HSD17 3 proteínas fueronaumentó significativamente cuando se agregaron el antagonista RAGE, RES y ECH. el aumentola expresión de las proteínas StAR y CYP11A1 se observó en los grupos tratados con ECH y RES.El nivel de expresión de CYP17A1 fue casi similar en los grupos RES y ECH. las expresiones de laHSD17 3 en las células de Leydig tratadas con ECH fueron mucho más altas que las de RES y RAGEcélulas tratadas con antagonistas. Aumento de la expresión de StAR, CYP11A1, CYP17A1 y HSD17 3 proteínasindicó la producción normal de testosterona.

5células/mL y tratamiento con RES y ECH(10µM) se administró durante 24 h. -Se tomó la actina como control interno. El grupo normal (Nor)fue tratado con medio y el grupo control (Con) fue tratado con AGEs (50µg/mL).

Resultadosse mostraron como medios±DAKOTA DEL SUR (n = 3). Diferencias significativas (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">analizada por la prueba de rango múltiple de Duncan.