Abstracto

Objetivo: Investigar los efectos de una fórmula que contiene Cistanche (que reemplaza las hierbas originales que nutren la sangre y tonifican los riñones) sobre la expresión del factor de crecimiento transformante- 2 (TGF- 2), la remodelación escleral y el transporte de agua en ratas con miopía por privación de forma (FDM) mediante la regulación de la vía caveolina-1 (CAV1)/acuaporina 1 (AQP1).

Métodos: Se seleccionaron cuarenta ratas SD macho de grado SPF, de las cuales 30 se utilizaron para establecer el modelo FDM. Después de un modelado exitoso, las ratas se dividieron en el grupo FDM, el grupo pirenzepina (PIR) y el grupo de fórmula Cistanche, con 10 ratas en cada grupo. Las 10 ratas restantes no modeladas sirvieron como grupo normal. El grupo normal y el grupo FDM no recibieron intervención. El grupo PIR fue tratado con gotas para los ojos PIR dos veces al día (mañana y noche), mientras que el grupo de fórmula Cistanche recibió administración intragástrica de la fórmula que contenía Cistanche. El error refractivo y la longitud axial de las ratas se detectaron utilizando un retinoscopio y un instrumento de diagnóstico. Se utilizó tinción HE para observar los cambios morfológicos del tejido escleral. Se empleó tinción inmunohistoquímica para detectar la expresión de TGF- 2 en tejido escleral. Se utilizó Western blot para determinar los niveles de expresión relativos de las proteínas AQP1 y CAV1 en tejido escleral. Se realizó RT-PCR para medir los niveles de expresión relativos del ARNm del transportador de glutamato-aspartato (GLAST) y del transportador de glutamato 1 (GLT-1) en el tejido escleral. Resultados: En comparación con el grupo normal, el error de refracción, el nivel de expresión de TGF- 2 y los niveles de expresión relativos de las proteínas AQP1 y CAV1 en el grupo FDM, el grupo de fórmula Cistanche y el grupo PIR disminuyeron significativamente, mientras que la longitud axial y los niveles de expresión relativos de ARNm GLAST y ARNm GLT-1 aumentaron significativamente (todos P <0,05). En comparación con el grupo FDM, el error de refracción, el nivel de expresión de TGF- 2 y los niveles de expresión relativos de las proteínas AQP1 y CAV1 en el grupo de fórmula Cistanche y el grupo PIR aumentaron significativamente, mientras que la longitud axial y los niveles de expresión relativos de GLAST mRNA y GLT-1 mRNA disminuyeron significativamente (todos P <0,05). En comparación con el grupo de fórmula Cistanche, el error de refracción, el nivel de expresión de TGF- 2 y los niveles de expresión relativos de las proteínas AQP1 y CAV1 en el grupo PIR disminuyeron significativamente, mientras que la longitud axial y los niveles de expresión relativos de GLAST mRNA y GLT-1 mRNA aumentaron significativamente (todos P <0,05). Los resultados de la tinción HE mostraron que no hubo cambios anormales en la estructura de cada capa de la retina en el grupo normal; la retina del grupo FDM se adelgazó y aparecieron cambios vacuolares severos en la capa de células ganglionares; se aumentó el grosor de la retina del grupo de fórmula de Cistanche y del grupo PIR, la disposición celular fue básicamente regular, se aumentó el número de células ganglionares y las células en cada capa estaban dispuestas densamente, con el desempeño más significativo en el grupo de fórmula de Cistanche. Conclusión: La fórmula que contiene Cistanche tiene cierto efecto positivo en el tratamiento de la FDM, y su mecanismo puede estar relacionado con la regulación de la expresión de CAV1, AQP1 y TGF- 2, así como con el equilibrio y la mejora de las funciones de remodelación escleral y transporte de agua.

 

 

SUPLEMENTO DE HIERBA CISTANCHE PARA MEJORAR LA FUNCIÓN RENAL

 

 

Palabras clave

Miopía por privación de forma; Fórmula que contiene cistanche; Factor de crecimiento transformador- 2; acuaporina 1; Caveolina-1; Remodelación escleral; Transporte acuático

 

En los últimos años, con los cambios en el estilo de vida de las personas y el continuo desarrollo de los dispositivos electrónicos, la incidencia de la miopía ha ido en aumento. Como enfermedad común, se ha convertido en un problema de salud global. La miopía por privación de forma (FDM) es un tipo especial de miopía, que generalmente es causada por la privación o reducción de la estimulación visual de los ojos. La FDM no sólo interfiere con el proceso de remodelación escleral sino que también provoca cambios anormales en la forma del globo ocular y trastornos de la función de transporte de agua, lo que puede agravar aún más el daño y la deformación del tejido escleral. La acuaporina 1 (AQP1) es una proteína ampliamente existente cuya función principal es promover el transporte rápido de moléculas de agua a través de las membranas celulares. En el ojo, la distribución y función de AQP1 están relacionadas con el equilibrio dinámico del líquido intraocular. La caveolina-1 (CAV1) es una proteína implicada en la formación de microestructuras de la membrana celular y la transducción de señales. En el ojo, CAV1 está presente principalmente en las células epiteliales pigmentarias de la retina y en las células fotorreceptoras, y está relacionado con la transmisión de señales visuales y la estabilidad del entorno intraocular. El factor de crecimiento transformante- 2 (TGF- 2) es una citoquina pleiotrópica con múltiples efectos biológicos, como promover la proliferación, diferenciación y migración celular. En el entorno intraocular, el TGF- 2 juega un papel importante en el desarrollo y mantenimiento de la córnea y la esclerótica. En la actualidad, el principal tratamiento para la FDM es la farmacoterapia.

En la medicina tradicional china (MTC), se cree que la formación de miopía está relacionada con factores como la insuficiencia de qi y sangre y la deficiencia de esencia renal. El riñón se considera la "base congénita" y está estrechamente relacionado con la función de los ojos. La medicina tradicional china sostiene que "el riñón gobierna la esencia y la esencia nutre los ojos; el hígado se abre hacia los ojos y una cantidad suficiente de sangre hepática garantiza una visión clara". Por lo tanto, tonificar el riñón y nutrir la sangre siempre ha sido un principio terapéutico importante para las enfermedades oculares causadas por síndromes de deficiencia en la MTC.

Cistanche, conocido como el "ginseng del desierto" y una de las "nueve medicinas inmortales" en la medicina tradicional china, tiene una historia de más de 2.000 años como ingrediente medicinal. Registrado como un material medicinal nutritivo de primer nivel en los antiguos clásicos de la medicina tradicional china, Cistanche es muy valorado por sus efectos de tonificar los riñones, reponer la esencia, nutrir la sangre y humedecer la sequedad. A diferencia de muchas otras hierbas de la medicina tradicional china, Cistanche crece exclusivamente en los desiertos, principalmente como parásito de las raíces de Tamarix ramosissima en regiones como Xinjiang, Mongolia Interior y Gansu en China. El entorno desértico único lo dota de ricos ingredientes activos, incluidos echinacósido, verbascósido y flavonoides, que se ha demostrado científicamente que tienen fuertes propiedades antioxidantes, reducen la apoptosis celular y promueven la proliferación celular.

Las investigaciones modernas han demostrado que Cistanche tiene importantes efectos nutritivos para los riñones. Puede reducir la apoptosis de las células renales, promover la proliferación de las células renales, reparar las células renales dañadas y dilatar los vasos sanguíneos renales, mejorando así la función renal. Además, Cistanche puede mejorar la inmunidad al promover la proliferación de linfocitos, resistir la fatiga al aumentar la producción de glucógeno hepático y ejercer efectos antienvejecimiento al eliminar los radicales libres. Estas actividades biológicas son muy consistentes con la teoría de la medicina tradicional china de "tonificar el riñón y nutrir la esencia" y también proporcionan una base científica para su aplicación en el tratamiento de enfermedades oculares. Basado en el principio terapéutico de la medicina tradicional china de tonificar los riñones y nutrir la sangre, y combinando las características farmacológicas modernas de Cistanche, este estudio reemplazó las hierbas originales que nutren la sangre y tonifican los riñones con Cistanche para formar una nueva fórmula que contiene Cistanche y exploró su eficacia y mecanismo en el tratamiento de la FDM, con el objetivo de proporcionar una nueva idea para el desarrollo de terapias naturales a base de hierbas para la miopía.

1 Materiales y métodos

1.1 Animales de experimentación

Se compraron cuarenta ratas SD macho de grado SPF, con un peso de 180 a 200 gy una edad de 6 a 8 semanas, del Centro de cría de animales Keyu de Beijing [N.º de licencia: SCXK (Jing) 2022-0004] y se criaron de forma rutinaria en el laboratorio de animales del Hospital Oftalmológico de la Academia de Ciencias Médicas Chinas de China. Este experimento cumplió con las disposiciones pertinentes del "Reglamento sobre la administración de animales de experimentación" y fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Oftalmológico de la Academia de Ciencias Médicas Chinas de China (N.º de lote: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Principales reactivos e instrumentos

Cistanche tubulosa (comprado a Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., con ingredientes activos que incluyen echinacósido mayor o igual al 30,0%, verbascósido mayor o igual al 12,0% y glucósidos totales de alcohol fenetílico mayor o igual al 75,0%) se utilizó como material medicinal principal. pirenzepina (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Gotas para ojos de tropicamida compuesta (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., especificación 5 ml); 4 g·L⁻¹ Gotas para los ojos de clorhidrato de oxibuprocaína (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); anticuerpo AQP1 (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); anticuerpo CAV1 (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -anticuerpo actina (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); IgG de cabra anti-conejo (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); Kit de tinción HE (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Método de modelado y agrupación

Se utilizaron treinta ratas para establecer el modelo FDM. Las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg·kg⁻¹). Después de limpiar y desinfectar el ojo derecho con povidona yodada, se pegó una máscara opaca al ojo derecho. La máscara para los ojos se revisó diariamente para detectar desprendimientos o fugas de luz, y se volvió a pegar si estaba floja. El ojo izquierdo no fue tratado. Después de 4 semanas de privación de la forma monocular, se realizó en las ratas retinoscopía binocular y medición de la longitud axial. Los criterios de éxito para el modelado: después de la cicloplejía, el error refractivo se midió con un retinoscopio o refractómetro automático, y el ojo privado mostró un cambio miope significativo en el estado refractivo [es decir, la diferencia en el error refractivo binocular mayor o igual a 2 D se consideró un modelado exitoso, y el cambio miope promedio del ojo privado en comparación con el ojo de control fue de aproximadamente (-4,5 ± 1,2) D]. Las 30 ratas fueron modeladas con éxito y divididas en el grupo FDM, el grupo PIR y el grupo de fórmula Cistanche, con 10 ratas en cada grupo. Las 10 ratas restantes no modeladas sirvieron como grupo normal.

1.4 Métodos de intervención

El grupo normal y el grupo FDM no recibieron intervención. El grupo PIR recibió 5 gotas de colirio PIR en el ojo derecho dos veces al día (mañana y noche) con un intervalo de 2 minutos durante 15 días. El grupo de fórmula Cistanche fue intervenido con la fórmula que contiene Cistanche. Se decoció Cistanche tubulosa (50 g, el ingrediente principal) con agua y se concentró hasta obtener una solución medicinal con una concentración de 1000 g·L⁻¹. A las ratas se les administró una dosis intragástrica de 12,70 g·kg⁻¹ una vez al día durante 15 días. La dosis de Cistanche se determinó en función de su experiencia en aplicaciones clínicas y de investigaciones farmacológicas modernas, lo que garantiza concentraciones efectivas de ingredientes activos como el echinacósido y el verbascósido.

1.5 Métodos de detección

1.5.1 Evaluación del error de refracción y cambios de longitud axial

Detección de errores morfológicos y refractivos: Veinticuatro horas después del final de la privación de forma, se seleccionaron aleatoriamente 3 ratas de cada grupo para la detección. Antes del experimento, las ratas se colocaron en un ambiente adaptado a la oscuridad durante 30 minutos, luego se anestesiaron mediante inhalación de isoflurano y se fijaron en un soporte especial para animales. Se utilizó un sistema de imágenes OCT de alta resolución para el escaneo panorámico del globo ocular. Durante la exploración, la sonda se ajustó para que quedara perpendicular a la córnea para obtener imágenes transversales claras de la retina y el cristalino. Cada ojo se escaneó 3 veces consecutivas, y el software incorporado del sistema midió automáticamente la distancia axial desde la superficie corneal anterior hasta la capa del epitelio pigmentario de la retina (es decir, la longitud axial) para calcular el error refractivo equivalente esférico. Para garantizar la precisión de los datos, dos investigadores capacitados profesionalmente analizaron las imágenes de forma independiente y ciega. Si la diferencia entre los dos resultados de medición era mayor que 0,50 D, los datos se descartaban y se volvían a medir. Detección confirmatoria de la longitud axial: para verificar los resultados de la medición OCT, también se utilizó el instrumento de diagnóstico por ultrasonido A-scan. Primero, se instilaron gotas para los ojos de clorhidrato de oxibuprocaína en ambos ojos de las ratas para anestesia tópica, y luego se colocó suavemente la sonda A-scan en contacto con la córnea. El instrumento se ajustó al modo manual y la velocidad de propagación ultrasónica precisa se configuró de acuerdo con los medios intraoculares: 1540 m·s⁻¹ para la cámara anterior y el vítreo. Durante la operación, cada interfaz se localizó mediante marcado manual y cada ojo se midió 3 veces repetidamente para tomar el valor promedio. Este experimento se realizó de forma ciega y todos los operadores recibieron capacitación unificada para garantizar técnicas de medición consistentes. El instrumento se calibró antes de la medición y algunas muestras se seleccionaron al azar para realizar pruebas de repetibilidad para evaluar los coeficientes de correlación intraclase e interclase (ICC). Durante el experimento se siguieron estrictos procedimientos operativos estandarizados para garantizar la cientificidad y confiabilidad de los datos.

1.5.2 Tinción HE

Después de detectar el error refractivo y la longitud axial, las ratas fueron sacrificadas mediante anestesia excesiva. Se desinfectaron los párpados y los tejidos circundantes de ambos ojos y se marcaron el limbo nasal y temporal perpendicular al punto medio de la córnea. Se hizo una incisión en la conjuntiva según las marcas y se enucleó el globo ocular. Se realizó una incisión en el limbo para eliminar el tejido del segmento anterior y el vítreo, y se retuvo el tejido escleral. El tejido escleral se fijó con 40 g·L⁻¹ de paraformaldehído durante 24 horas, se deshidrató con etanol en gradiente, se embebió de forma rutinaria en parafina, se aclaró con xileno, se montó con bálsamo neutro, se seccionó a 5 μm, se tiñó con HE y se observaron los cambios morfológicos del tejido escleral bajo un microscopio óptico.

1.5.3 Tinción inmunohistoquímica para la expresión de TGF- 2 en tejido escleral

Se seleccionaron dos ratas de cada grupo. Las secciones de tejido escleral se sometieron a recuperación y bloqueo de antígenos, se incubaron con anti-TGF- 2 de ratón (1:3000) durante 24 horas, se lavaron, se incubaron con anticuerpo secundario (1:2000) durante 1 hora, se revelaron y contratinción de forma rutinaria, se montaron con bálsamo neutro y se tomaron 2-3 imágenes bajo un microscopio óptico para observar los cambios en el tejido. El valor de gris de la parte positiva fue detectado por un sistema de análisis de imágenes.

1.5.4 Detección por transferencia Western de los niveles de expresión de las proteínas AQP1 y CAV1 en tejido escleral

Se seleccionaron dos ratas de cada grupo. Se extirpó el tejido escleral, se homogeneizó y se extrajo la proteína total añadiendo tampón de lisis RIPA. Se realizaron desnaturalización, cuantificación, electroforesis, transferencia de membrana y bloqueo de proteínas. Se agregaron los anticuerpos primarios AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000) y anticuerpo actina (1:2000) y se incubaron durante la noche a 4 grados. Se añadió anticuerpo secundario (1:2000) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió reactivo ECL y el valor de gris de la proteína se analizó con el software Image Lab. La relación entre el valor de gris de la banda objetivo y el de actina era su nivel de expresión relativo.

1.5.5 Detección por RT-PCR de GLAST y expresión de ARNm GLT-1 en tejido escleral

Se tomó el tejido escleral restante de ratas y se extrajo el ARN total según el método Trizol. El ARN total se midió con un espectrofotómetro y el ADNc se transcribió de forma inversa según las instrucciones del kit. El sistema de reacción RT-PCR se preparó con las siguientes condiciones de reacción: 75 grados durante 30 s, 85 grados durante 60 s, 80 grados para recocido durante 30 s, 65 grados para extensión durante 30 s, un total de 40 ciclos. Con -actina como referencia interna, los niveles de expresión relativos del transportador de glutamato-aspartato (GLAST) y del transportador de glutamato 1 (GLT-1) se calcularon mediante el método 2⁻ΔΔCt. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 1. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional para la comparación entre grupos y la prueba LSD-t para la comparación por pares entre grupos. El nivel de prueba:=0.05.