Efectos de Cistanche Deserticola Deserticola y Kaempferol en el desarrollo de células de la granulosa en folículos preagregados de pollo

Abstracto:Para explorar los efectos de Cistanche deserticola y Kaempferol en el desarrollo folicular de pollo, el experimento analizó los efectos de diferentes concentraciones de Cistanche deserticola y Kaempferol en la actividad de las células de la granulosa pregraduadas de pollo mediante el método MTT y determinó la concentración óptima. Se utilizó PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real para detectar los efectos de Cistanche deserticola y Kaempferol sobre el antígeno nuclear de células de proliferación (PCNA), el receptor de la hormona estimulante del folículo (FSHR) y el receptor de estrógeno de las células de la granulosa pregraduadas de pollo (ER ） El impacto de la expresión de ARNm; Los efectos de Cistanche deserticola y kaempferol en el desarrollo folicular ovárico se analizaron mediante cultivo in vitro de tejido ovárico. Los resultados mostraron que tanto Cistanche deserticola como Kaempferol en la concentración de 1 × At 10-4 mol/L , puede promover significativamente la proliferación de células de la granulosa, al mismo tiempo que promueve PCNA, FSHR y ER en la expresión de ARNm de células de la granulosa (P<0.01); Cistanche deserticola and Kaempferol significantly increased the number of follicles in ovarian tissue, and granulosa cells proliferated from monolayer to multilayer. Studies have shown that Cistanche deserticola and Kaempferol can promote the proliferation of aggregate granulosa cells, and promote FSHR and ER α MRNA expression promoting the development of pre-grade follicles towards grade follicles.

Palabras llave: Cistanche deserticola; canferol; Pollo; Células granulares antes del grado; tejido ovárico

Cistanche de hierbas chinas

Para las granjas de gallinas ponedoras a gran escala, el nivel de tasa de producción de huevos afecta sus beneficios económicos, y el desarrollo de los folículos ováricos afecta directamente el rendimiento de producción de las gallinas ponedoras. Los folículos se dividen en tres etapas según su estado funcional: folículos primarios, folículos secundarios y folículos maduros [1]. Todos los días, se selecciona un folículo para que se desarrolle hasta la madurez y el óvulo se expulsa a la trompa de Falopio, pasando por el embudo, el agrandamiento, el istmo, el útero y la vagina, formando una estructura similar a un huevo [2-3]. El inicio de los folículos primitivos está relacionado con el desarrollo de las células de la granulosa folicular. La hormona estimulante del folículo (FSH) se une al receptor de la hormona estimulante del folículo (FSHR) en las células de la granulosa, induciendo la formación del receptor de la hormona luteinizante (LHR) y estimulando la síntesis de hormonas esteroides [4-6]. La FSH y la hormona luteinizante (LH) actúan sinérgicamente sobre las células de la granulosa para promover el desarrollo y la maduración folicular, participando en la selección de los folículos dominantes. La investigación ha encontrado que aunque los folículos primordiales que carecen de células de la granulosa se han activado, finalmente todos desarrollan atresia [7]. Durante el desarrollo folicular, el estrógeno puede promover la proliferación de células de la granulosa ovárica, mientras coopera con la FSH y la LH para promover la proliferación y diferenciación de las células de la granulosa ovárica. Cuando el contenido de estrógeno en el plasma aumenta, se retroalimentará negativamente al hipotálamo a través del sistema de circulación periférica, inhibiendo así la secreción de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) del hipotálamo. La GnRH puede estimular la adenohipófisis para sintetizar y secretar FSH y LH para promover el desarrollo del folículo ovárico. Cuando la secreción de GnRH es baja, puede inhibir la secreción de FSH y LH, lo que en última instancia conduce a la inhibición del desarrollo folicular [8-9].

Estudios previos encontraron que Cistanche deserticola y Cuscuta chinensis tuvieron un buen efecto de reparación en oviductos atróficos y oviductos dañados después de la recuperación, y podrían mejorar la tasa de postura de las gallinas ponedoras bajas [10]. En la producción ganadera, la aplicación de flavonoides puede mejorar significativamente el rendimiento de la producción animal, mejorar la resistencia a las enfermedades de los animales y mejorar la función inmunológica de los animales.

Medicinas chinas como ginseng, Cistanche deserticola y astrágalo

Los flavonoides totales de Cistanche deserticola pueden promover significativamente la proliferación de células de la granulosa folicular de grado y pregrado de pollo in vitro, el nivel de transcripción de la proteína reguladora rápida esteroidogénica (StAR), el ARNm de la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol (CYP11A1) y la secreción de progesterona El componente representativo de los flavonoides totales de Cistanche deserticola es Cistanche deserticola. Su peso molecular es pequeño y tiene la ventaja de atravesar la barrera hematoencefálica. Al mismo tiempo, tiene efectos antiinflamatorios, antitumorales y similares a los estrógenos [11]. El principal componente químico de Cuscuta chinensis son los flavonoides totales de Cuscuta chinensis. En la actualidad se han aislado una variedad de flavonoides a partir de Cuscuta chinensis, principalmente Quercetina y Kaempferol, los cuales presentan una alta actividad antioxidante.

La aplicación de extracto de flavonoides de semilla de cuscuta en ratas hembra exhibe actividad estrogénica, que tiene cierto efecto en la promoción de la mejora de la función del receptor ovárico de hCG/LH; Tiene un efecto de gonadotropina en ratones juveniles y puede promover el desarrollo de su sistema reproductivo [12-14].

En este experimento, seleccionamos células de la granulosa folicular de pregrado de pollo y exploramos el efecto promotor de Cistanche deserticola y Kaempferol en la proliferación de células de la granulosa folicular de pregrado de pollo y la expresión del receptor relacionado a través del efecto de Cistanche deserticola y Kaempferol en el desarrollo folicular de pollo. proporcionar una referencia teórica para la investigación y el desarrollo de aditivos alimentarios seguros, efectivos y libres de residuos para mejorar el rendimiento de producción de ponedoras.

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1 Material y Métodos

1.1 Materiales de prueba

Cistanche deserticola (pureza mayor o igual al 98 por ciento) se adquirió de Shanghai Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd; Kaempferol (pureza mayor o igual al 98 por ciento) se compró a Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Principales reactivos e instrumentos

Reactivos principales: la colagenasa tipo II y el DMEM se adquirieron de Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd; DMSO se compró a Beijing Solebao Technology Co., Ltd; El kit M5 Super qPCR RT con el kit de transcripción inversa para eliminación de gDNA se adquirió de Beijing Jumei Biotechnology Co., Ltd. Instrumento principal: BCM-1300Un banco de trabajo de purificación adquirido de Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. Fábrica de equipos médicos; La centrífuga de congelación de alta velocidad AXTGL20M se adquirió de Hunan Hexi Instrument Equipment Co., Ltd; La incubadora de temperatura constante Heracell 150i GP se adquirió de Bingshan Songyang Biotechnology (Dalian) Co., Ltd; LightCycle ® El instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia de tipo 96 y el instrumento de marcaje de enzimas de tipo DR-200BS se compraron a Bole Life Medical Products (Shanghai) Co., Ltd.

1.3 Aislamiento y extracción de células de la granulosa de los folículos antes de clasificar los pollos

Se seleccionaron 30 150-gallinas ponedoras Hailan brown sanas (proporcionadas por Hebei Baoding Dingnong Company), se sacrificaron mediante sangría de la arteria carótida y se extrajeron los ovarios de forma aséptica (las pruebas de investigación en animales in vivo se realizaron según las pautas aprobadas por el Comité de Ética Animal de la Universidad Agrícola de Hebei). Los folículos de pregrado se pueden dividir en pequeños folículos blancos (SWF,<2 mm), large white follicles (LWF, 3-5 mm), small yellow follicles (SYF, 6-8 mm), and large yellow follicles (LYF, 9-12 mm). Collect granulosa cells from pre-graded follicles with a diameter of 6-8 mm and prior stages. The grading of follicles (see Figure 1). 

Nota: SWF representa folículos blancos pequeños, LWF representa folículos blancos grandes, SYF representa folículos amarillos pequeños, LYF representa folículos amarillos grandes y F1, F2, F3, F4 y F5 representan cinco folículos maduros.

Los folículos recolectados se lavaron tres veces con alcohol al 75 por ciento y finalmente se lavaron una vez con PBS. La aguja estéril se usó para liberar el fluido de la yema en el PBS que contenía penicilina al 3 por ciento y estreptomicina, retirar la capa de células de la membrana y separar la capa de células granulares. Se tomaron 15 mL de tubo EP para agregar la capa de células de la granulosa cortada de los folículos y se agregaron 4 mL de 0.1 por ciento de colagenasa tipo II. Se agitó en un agitador a 37 grados durante 3 minutos. Después de completar la oscilación, agregue una cantidad igual de solución de cultivo que contenga 0.5 por ciento de FBS para terminar la digestión. Filtrar con un tamiz de malla 200 y un tamiz de malla 400, respectivamente. Centrifugar el filtrado a temperatura ambiente a 1200 r/min durante 5 minutos y repetir la centrifugación dos veces. Deseche el sobrenadante, agregue el medio de cultivo, sople y aspire uniformemente, y diluya la suspensión celular a 5 × 106 piezas/mL, y agregue uniformemente a una placa de Petri con un diámetro de 100 mm, y cultive a 37 grados y 5 por ciento de CO2. .

1.4 Efectos de Cistanche deserticola y Kaempferol sobre la actividad de las células de la granulosa

Las células granulares se cultivaron rutinariamente en un medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10 por ciento. Se tomaron células en fase de crecimiento logarítmico y se digirieron con 2,5 g/l de tripsina. Las células se distribuyeron uniformemente en placas de 96 pocillos. Cada placa se dividió en 10 grupos con 6 orificios repetidos en cada grupo. Agregue 200 a los agujeros alrededor de la placa de cultivo μ L PBS sirve como un poro humectante. La concentración de Cistanche deserticola se establece en 1 × 10-4 mol/L, 1 × 10-5 mol/L, 1 × 10-6 mol/L, 1 × 10-7 mol/ L, 5 × 10-8 mol/L, 1 × 10-8 mol/L, 5 × 10-9 mol/L, 1 × 10-9 mol/L, 1 × {{ 24}} mol/L. Establezca un grupo de control en blanco. Después del cocultivo de células con Cistanche deserticola durante 24 horas, agregue 10 por ciento a cada pocillo de 5 mg/mL de MTT de L. Después de seguir cultivando durante 4 horas, agregue 150 μL de DMSO a cada pocillo y oscile durante 3 minutos en un agitador de temperatura constante a 37 grados. Mida la absorbancia a 450 nm. El experimento se repitió tres veces, y el proceso de selección de la dosis segura óptima de Kaempferol para las células de la granulosa fue el mismo que el anterior.

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1.5 Efectos de Cistanche deserticola y Kaempferol sobre el antígeno nuclear de células en proliferación, el receptor de la hormona estimulante del folículo y el receptor de estrógeno en las células de la granulosa

El efecto de la expresión del ARNm se observó en células de la granulosa en fase de crecimiento logarítmico, inoculadas en tres placas de cultivo con una densidad celular de 5 × 106 piezas/mL. Las placas de Petri se dividieron en un grupo de control en blanco; grupo Cistanche deserticola, es decir, después de 24 horas de cultivo celular, agregar 1 × 10-4 mol/L Cistanche deserticola; En el grupo Kaempferol, agregue 1 después de 24 h de cultivo celular × 10-4 mol/L Kaempferol; Grupo de estrógenos, agregar 5 después de 24 horas de cultivo celular × Tratar con 10 a 8 mol/L de estrógeno. Después de 24 horas de cultivo, deseche todo el medio de cultivo, enjuague con PBS, agregue 1 mL de enzima pancreática para la digestión y después de unos minutos, agregue una cantidad igual de medio de cultivo para terminar la digestión. Centrifugar la suspensión celular a 1000 r/min durante 5 minutos, desechar el sobrenadante y añadir el reactivo Trizol en una hielera. Posteriormente, se añadió cloroformo y se agitó vigorosamente, se colocó en una caja de hielo durante aproximadamente 3 minutos y se centrifugó a 4 grados a 12000 r/min durante 10 minutos. Transfiera el ARN a un tubo EP nuevo, agregue un volumen igual de isopropanol, mezcle bien suavemente y deje reposar en una caja de hielo durante 10 minutos. Después de centrifugar a 4 grados durante 10 minutos a 12 000 r/min, deseche el sobrenadante y lave el precipitado con etanol al 80 por ciento. Centrifugar a 10 000 r/min y 4 grados durante 5 minutos, desechar el etanol, secar al aire durante 5-10 minutos y agregar agua DEPC para soplar y succionar para disolver el precipitado. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro UV.

Utilice el kit M5 Super plus qPCR RT con el kit de eliminación de gDNA para la transcripción inversa para obtener cDNA. Detección de antígeno nuclear de células en proliferación, receptor de hormona estimulante del folículo y receptor de estrógeno en células de la granulosa mediante PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real, nivel de transcripción relativa de ARNm. La información de los cebadores se muestra en la Tabla 1, y los cebadores fueron diseñados y sintetizados por Shenggong Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. Grupo de referencia interno - Actina, el nivel relativo de transcripción de ARNm para cada gen está determinado por 2- ΔΔ Calculado por Ct.

Tabla 1 Información de imprimación

1.6 Cultivo in vitro y observación morfológica del tejido ovárico

Tome el tejido ovárico de 30 40-gallinas ponedoras Hailan brown de un día y enjuáguelo tres veces con alcohol al 75 por ciento. Cortar el tejido ovárico en pequeños trozos de 1-2 mm3 en una mesa ultralimpia, a razón de 500 μL por pocillo añadidos a medio DMEM e ITS (10 μG/mL de insulina, 5 μG/mL de transferrina , y 30 nmol/L de selenito de sodio). Después de 72 horas de cultivo en incubadora, tratar según la situación de agrupación. El tejido ovárico se dividió en un grupo de control en blanco, un grupo de Cistanche deserticola, un grupo de Kaempferol y un grupo de estrógeno. Después de 72 horas de cultivo, el tejido ovárico se fijó con formaldehído al 4 por ciento y las secciones de tejido se prepararon de forma rutinaria para su observación bajo un microscopio óptico.

1.7 Estadísticas y Análisis

Los datos de qPCR se analizaron con el software Biorad CFX Manager 2.0 y el software Microsoft Excel, y se utilizó el software SPSS 21.0 para ANOVA unidireccional. Se utilizó el método de Duncan para comparaciones múltiples. Los resultados se representan como "media ± desviación estándar" y se trazan utilizando el software GraphPad Prism 5.0. PAG<0.05 indicates significant differences, while P<0.01 indicates extremely significant differences.

2 Resultados y Análisis

2.1 Efectos de Cistanche deserticola y Kaempferol sobre la proliferación de células de la granulosa

Puede verse en las Figuras 2 y 3 que tanto Cistanche deserticola como Kaempferol pueden promover la proliferación de células de la granulosa. A 1 × 10-4~1 × Dentro de un gradiente de concentración de 10-10 mol/L, en comparación con el grupo de control en blanco, la concentración es de 1 × 10-4 mol/L, 1 × {{ 9}} mol/L, 1 × 10-6 mol/L, 1 × A 10-7 mol/L, la diferencia fue extremadamente significativa (P<0.01), with a concentration of 5 × The difference was significant at 10-8 mol/L (P<0.05).

Nota: "* *" indica una diferencia significativa en comparación con el grupo de control en blanco (P<0.01), and "*" indicates a significant difference compared to the blank control group (P<0.05), the same below.

Fig. 2 Valores de absorbancia de células de la granulosa expuestas a Cistanche deserticola a diferentes concentraciones durante 24 horas

Fig. 3 Valores de absorbancia de las células de la granulosa expuestas a kaempferol a diferentes concentraciones durante 24 horas

2.2 Efectos de Cistanche deserticola y Kaempferol sobre el antígeno nuclear de células en proliferación, el receptor de la hormona estimulante del folículo y el receptor de estrógeno de las células pregranulosas de pollo El impacto del ARNm en los niveles relativos de transcripción

En la Tabla 2 se puede ver que los grupos Cistanche deserticola y Kaempferol tienen efectos sobre el antígeno nuclear de células en proliferación, el receptor de la hormona estimulante del folículo y el receptor de estrógeno de las células de la granulosa pregraduadas de pollo. El nivel transcripcional relativo del ARNm fue significativamente mayor que el del blanco. grupo de control y grupo de estrógenos (P<0.05 or P<0.01), and the follicle-stimulating hormone receptor and estrogen receptor of chicken pre aggregate cells in the Kaempferol group α The transcription level of mRNA is the highest (P<0.01).

Tabla 2 Efectos de Cistanche deserticola y Kaempferol sobre el antígeno nuclear de células en proliferación, el receptor de la hormona estimulante del folículo y el receptor de estrógeno de las células pregranulosas de pollo El impacto del ARNm en los niveles relativos de transcripción

2.3 Observación histológica de ovarios

Puede verse en la Figura 4 que, en comparación con el grupo de control, el número de folículos en el tejido ovárico tratado con Cistanche deserticola y Kaempferol aumentó significativamente, y las células de la granulosa proliferaron de monocapa a multicapa. En comparación con el grupo de estrógenos, el grupo Cistanche deserticola y el grupo Kaempferol tienen una capacidad más evidente para promover la maduración y el desarrollo del tejido ovárico, y el grupo Cistanche deserticola y el grupo Kaempferol tienen un efecto más evidente que el grupo Kaempferol.

3 Discusión

3.1 Efecto de Cistanche deserticola y Kaempferol

Todo el proceso de desarrollo folicular va acompañado de la proliferación de células de la granulosa, que son de gran importancia para el desarrollo folicular. Inician el crecimiento de folículos primitivos mediante la construcción de microambientes moleculares favorables. Durante el desarrollo folicular, la apoptosis de las células de la granulosa juega un papel importante en la regulación del crecimiento folicular, la maduración de los óvulos y la secreción de estrógenos [15-16]. Cistanche deserticola, una medicina herbaria china, tiene un efecto similar al de las hormonas sexuales, que puede promover el desarrollo de folículos animales y la producción de esperma, promover la llegada normal del estro, mejorar la función y actividad ovárica y mejorar la función reproductiva. Cuscuta chinensis, como medicina tradicional china para tonificar los riñones, tiene efectos antioxidantes, reproductivos y antienvejecimiento como sus componentes flavonoides efectivos. Los estudios han demostrado que una cierta dosis de flavonoides de Cuscuta chinensis tiene un efecto proliferativo en las células intersticiales testiculares de ratón [17-18]. En este experimento, Cistanche deserticola y Kaempferol, como componentes principales de las medicinas tradicionales chinas Cistanche deserticola y dodder, fueron seleccionados para estudiar sus efectos sobre la capacidad de expresión de las células de la granulosa folicular de pollo y sus receptores relacionados, y el tejido ovárico, para confirmar los efectos. de Cistanche deserticola y Kaempferol en el desarrollo del sistema reproductivo avícola.

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3.2 Antígeno nuclear de células en proliferación, receptor de la hormona estimulante del folículo y receptor de estrógeno El papel de

PCNA es un antígeno nuclear de proliferación celular, que juega un papel importante en el inicio de la proliferación celular y es un buen indicador de la proliferación celular. Por lo tanto, el aumento de PCNA en los resultados de la prueba confirmó que Cistanche deserticola y Kaempferol promueven la proliferación celular cuando actúan sobre las células de la granulosa. La FSH es la principal hormona que promueve el desarrollo folicular [19], y el sitio de expresión del receptor de la hormona estimulante del folículo (FSHR) se concentra principalmente en el ovario y los folículos. La principal forma en que la FSH participa en las actividades reproductivas de las gallinas es regulando el desarrollo de los folículos. Cuando aumenta la secreción de FSH, puede promover el aumento de FSHR en las células de la granulosa, y la combinación de los dos puede inducir la síntesis de LHR al activar la aromatasa. El pollo puede inducir la ovulación bajo el efecto sinérgico de FSH y LH [20-22]. Antes de la selección de folículos, las células de la granulosa solo expresan niveles basales de FSHR, que se utilizan para recibir señales de FSH y producir niveles bajos de fosfato de adenosina cíclico para mantener la actividad celular. Cuando la expresión de FSHR aumenta significativamente en las células de la granulosa de un folículo de pregrado, sugiere que el folículo se seleccionará para convertirse en un folículo de grado [23-24]. En este estudio, en comparación con el grupo de control, la expresión del ARNm de FSHR en los grupos Cistanche deserticola y Kaempferol aumentó significativamente, lo que indica que Cistanche deserticola y Kaempferol pueden promover la transcripción del ARNm de FSHR, aumentar la secreción de FSH y promover la selección. de folículos como folículos de grado. E2 es un tipo de hormona esteroide secretada por las células de la teca. Su función es promover la Madurez Sexual de las hembras y mostrar la segunda característica sexual. Bajo la acción de la FSH, la aromatasa producida por las células de la granulosa ovárica convierte el andrógeno en E2, que está regulado por dos receptores de estrógeno (ER y ER). Tiene efectos en varios órganos de las hembras y juega un papel importante en la reproducción animal, especialmente en el fisiológico. actividades como el desarrollo folicular. Durante el crecimiento folicular, el estrógeno es una molécula reguladora intracelular clave que acelera la proliferación de las células de la granulosa y mejora los efectos de la FSH y la LH en la proliferación y diferenciación de las células ováricas. ER El principal ajuste es la retroalimentación negativa, ER El desarrollo de los folículos se regula a través de vías tanto internas como externas del ovario [26].RE Se expresa principalmente en tejidos y órganos como la glándula mamaria, el útero y la vagina de los animales, mientras que el RE se expresa principalmente en los testículos. , ovarios, próstata e hipotálamo [27].

En este estudio, los niveles de expresión de ER de Cistanche deserticola y Kaempferol aumentaron significativamente en los grupos de Cistanche deserticola y Kaempferol, lo que sugiere que la cistanche y el kaempferol tienen efectos positivos en el desarrollo, la maduración y la ovulación de los ovarios de pollo. Los resultados de este estudio encontraron que se midió ER El nivel de expresión es relativamente bajo. Esto es consistente con los hallazgos de la investigación de Guo Miao [28] de que en el desarrollo embrionario de los pollos, los ovarios de los pollos tempranos tienen sitios de unión específicos para el ER. En los folículos blancos, los folículos amarillos y las células de la granulosa de los pollos, la expresión de ER es significativamente mayor que la de ER. Los flavonoides de soya, como un estrógeno de origen vegetal, pueden aumentar la tasa de producción de huevos de las gallinas ponedoras cuando se agregan a la dieta [29], lo que indica una relación directa entre los niveles de hormonas de estrógeno y la tasa de producción de huevos.

Figura 4 Tejido ovárico después de la tinción con HE (10 ×）

3.3 Efectos de Cistanche deserticola y Kaempferol en el tejido ovárico

En este experimento, al cocultivar Cistanche deserticola y Kaempferol con tejido ovárico respectivamente, se encontró que el número de folículos en el tejido ovárico afectado por Cistanche deserticola y Kaempferol aumentó significativamente, y las células de la granulosa proliferaron de monocapa a multicapa. Esto prueba aún más que Cistanche deserticola y Kaempferol pueden promover el desarrollo ovárico desde una perspectiva histológica. El antígeno de proliferación celular, el receptor de la hormona estimulante del folículo y el receptor de estrógeno medidos en los resultados de este experimento. Los cambios en los indicadores confirmaron que Cistanche deserticola y Kaempferol tienen efectos similares al estrógeno, lo que proporciona una base experimental para explorar el objetivo de los componentes principales. de Cistanche deserticola y dodder.

4. Conclusión

Este estudio confirmó que Cistanche deserticola y Kaempferol pueden promover la proliferación de células de la granulosa pregraduadas de pollo y aumentar PCNA, FSHR y ER. El nivel de transcripción del ARNm puede promover significativamente el desarrollo de folículos.

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