Parte 1 Efectos del feniletonósido de Cistanche deserticola en la expresión de la proteína β-amiloide en el hipocampo de ratones transgénicos APP / PS1

Parte 1 Los ingredientes efectivos de Cistanche: el efecto terapéutico de los glucósidos y verbascósidos totales de alcohol fenetílico en la enfermedad de Alzheimer

Para más información: Ali.ma@wecistanche.com

JU Bo-wei1 , YANG Jian-hua2 , HU Jun-ping3 *

1 El Quinto Hospital afiliado de la Universidad Médica de Xinjiang, Urumqi 830000, China;

2 El primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Xinjiang, Urumqi 830054, China;

3 Escuela de Farmacia, Universidad Médica de Xinjiang, Urumqi 830011, China

Abstracto:

Para estudiar el efecto del feniletanoide Cistanche deserticola sobre la expresión de la proteína β-amiloide en el hipocampo de ratones con enfermedad de Alzheimer60, los ratones con EA doble APP/ PS1 de 6 meses de edad se dividieron aleatoriamente en grupos modelo, grupo de donepezilo (0. 65 mg/kg), las dosis altas, medias, bajas deglucósidos totalesde Cistanche deserticola ( 250,125 62. 5 mg/kg) y acteoside( 125 mg/kg) recibieron medicamentos y agua destilada durante 3 meses. A la edad de 9 meses, se utilizaron el laberinto de agua de Morris y las pruebas de evitación pasiva para determinar las alteraciones del aprendizaje y la memoria, las lesiones del hipocampo de los ratones se observaron por tinción de HE y las expresiones de las proteínas Aβ1-42 y Aβ1-40 en el hipocampo de ratones se analizaron mediante método inmunohistoquímico y Método Western-blot.Cistanche deserticola feniletanoidepuede mejorar significativamente la capacidad de aprendizaje y memoria y el daño de las neuronas del hipocampo en ratones transgénicos dobles APP/ PS1. En comparación con el grupo modelo, el número de células Aβ1-42, Aβ1-40 positivas en el hipocampo CA1 delCistanche deserticolagrupo y el grupo control disminuyeron significativamente, y los resultados de Western-blot mostraron que la expresión de Aβ1-42, proteína Aβ1-40 en el hipocampo de Cistanche deserticola en cada grupo de dosis y el grupo de intervención fue significativamente menor que en el grupo modelo. El glucósido de Cistanche deserticola puede proteger las neuronas y antagonizar la EA al regular a la baja la expresión de la proteína Aβ1-42, Aβ1-40 en el cerebro del hipocampo de ratones. En este estudio, el feniletanoide se identificó como el principal sub-postura efectiva paraCistanche deserticolapara ejercer su actividad anti-EA que proporciona apoyo teórico para su desarrollo posterior como un nuevo fármaco contra la EA.

Palabras clave:Cistanche deserticola; feniletanoide;Enfermedad de Alzheimer; APP / PS1 ratones transgénicos dobles; β-amiloide

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Alzheimeres una enfermedad degenerativa del sistema nervioso central caracterizada por pérdida progresiva de memoria y disfunción cognitiva. En la actualidad, la bien reconocida hipótesis de la cascada de la proteína β-amiloide (Aβ) cree que los metabolitos normales Aβ1-42 y Aβ1-40 monómeros en condiciones fisiológicas no son neurotóxicos, pero cuando se encuentran con mediadores exógenos APP, causan anomalías. Después de la deposición, el Aβ1-42 acumulado forma oligómeros Aβ solubles (ADDL), que evitan que los monómeros produzcan actividad protectora y causen degeneración neuronal, pérdida de sinapsis y daño axónico, y finalmente causan apoptosis neuronal en el cerebro para causar demencia, por lo que investigar la expresión de sus objetivos clave Aβ1-42 y la proteína Aβ1-40 en el cerebro es de gran importancia para la investigación sobre la prevención y el tratamiento de la proteína Aβ1-40Glucósidos feniletanoides de cistancheen AD. Al mismo tiempo, el estudio del examen histopatológico del hipocampo de las lesiones características en el cerebro de los modelos animales con EA puede reflejar realmente la mejora de los medicamentos en las lesiones en el cerebro desde la vista macroscópica.

La medicina tradicional china en mi país cree queCistanche, una medicina tradicional china que nutre el riñón y nutre la esencia, tiene los efectos de antienvejecimiento, antienvejecimiento y mejora de la memoria. Un gran número de estudios preliminares han confirmado que el totalglucósidos feniletanoides de Cistanche y Acteoside, el monómero representativo de los glucósidos de alcohol fenetílico, exhibe efectos antagonistas obvios sobre la EA en los modelos in vivo o in vitro de EA construidos por métodos tradicionales, y tiene cierta prevención y tratamiento de la neurodegeneración. El potencial de las enfermedades sexuales. Sin embargo, la aplicación del modelo transgénico doble APP/PS1 de Cistanche Acteoside no se ha utilizado para realizar investigaciones sobre la prevención y el tratamiento de la EA desde la perspectiva de la β-amiloide.

En resumen, este estudio se basa en la hipótesis clásica de la patogénesis de la EA: la hipótesis de la reacción en cascada de Aβ, con la ayuda de un modelo animal de AD ideal y confiable APP / PS1 doble de ratones transgénicos como plataforma de investigación in vivo, utilizando el laberinto de agua de Morris y el método de tinción HE, Western-blot, inmunohistoquímica y otros métodos técnicos avanzados, desde las perspectivas del comportamiento animal, histopatología y biología molecular Con el fin de encontrar nuevas dianas para la prevención y el tratamiento de la EA, proporcionará una referencia para el estudio del mecanismo específico de acción de los glucósidos feniletanoides cistanche en la prevención y el tratamiento de la EA.

1. Reactivos e instrumentos

1.1 Reactivo

Glucósidos feniletanosoides de Cistanche tubulosa(hecho por el grupo de investigación, el contenido de glucósidos feniletanoides es del 87,6%);Acteoside; dióxido de titanio; Kit de tinción HE; goma neutra; Kit de preparación de gel SDS-PAGE; Kit de cuantificación de proteínas BCA; Aβ1-40; Aβ1-42; β-actina; Conejo alcalino marcado con fosfpasa anti-cabra IgG (H + L); Tampón de carga de proteínas de 4 × Contiene β-mercaptoetanol; 10 × TBST; Membrana de PVDF; SDS; Tris; glicina; leche desnatada en polvo; Kit BCIP / NBT; anticuerpo secundario; Preadolescente 20.

1.2 Animales

60 ratones modelo de EA doble transgénico APP/PS1 de 6 meses de edad

Y 10 ratones negativos para la camada, machos y hembras, peso corporal de 20 ± 10 g, los animales comen y beben libremente durante el experimento.

1.3 Aparatos

MT-100 Laberinto de agua Morris; generador de imágenes de gel; Enfermedad RM2016

Microtomo; Máquina de hielo SIM-F124; electroforesis en gel y equipos de membrana de transferencia; lector de microplacas de longitud de onda completa; Incubadora de temperatura constante de CO2; Refrigerador de 4 °C y -20 °C; 67120 instrumento de agua ultrapura

; Balanza electrónica TP-114; centrífuga refrigerada de alta velocidad a baja temperatura; DVKW-D-2 pantalla digital calefacción eléctrica temperatura constante baño de agua; disruptor celular ultrasónico; WD-9405A agitador decolorante; voltaje constante ajustable y fuente de alimentación de corriente constante; DM4000 microscopio fluorescente invertido.

2. Método

2.1 Agrupación y administración de animales

Según SPSS18. 0 Los números aleatorios generados por el software estadístico, 1156 Natural Products Research, and Development Vol. 31AD los ratones modelo se dividieron aleatoriamente en grupo modelo y grupo de donepezilo (infusión diaria)

La dosis gástrica es 0. 65 mg/kg), glucósidos totales (PhGs) de alcohol fenetílico de Cistanche en grupos de dosis altas, medias y bajas (las dosis diarias de sonda de 250, 125, 62,5 mg/kg, respectivamente), grupo de intervención de verbasósido de Cistanche (125 mg/kg) kg), 10 por grupo. A la edad de 6 meses, los ratones recibieron tratamiento intragástrico de sonda según los grupos, y los ratones se administraron por vía intragástrica una vez al día durante 3 meses consecutivos. El grupo normal consistía en ratones no transgénicos en la misma camada. El grupo modelo y el grupo normal recibieron un volumen igual de agua destilada por sonda.

2.2 Experimento del laberinto de agua de Morris

El clásico laberinto de agua de Morris se utilizó para probar el aprendizaje espacial y las habilidades de memoria de los ratones. En el primer y segundo día, entrene a los ratones para que se familiaricen con la posición de la plataforma y practiquen la búsqueda de la plataforma. Del 3º al 5º día, se realizará la prueba formal para observar la situación de los ratones de cada grupo que buscan la plataforma después del entrenamiento. El día 6 se retirará la plataforma y se observarán los ratones.

Pista de natación. Durante el experimento, la cámara registrará simultáneamente el tiempo que pasa el ratón buscando la plataforma (es decir, la latencia de escape) y la distancia de la pista de natación. Si el mouse no encuentra una plataforma dentro del rango de tiempo establecido (generalmente establecido en 60 s o 120 s, este experimento usa 60 s), entonces la latencia de escape del mouse se registra como el valor establecido, y el personal permanecerá en la plataforma durante unos segundos (10 s se usa en este experimento) para ayudarlo a profundizar la memoria de la plataforma. Después del experimento, registre el tiempo de natación de los ratones desde que entraron en el agua hasta que encontraron la plataforma. El último día del experimento, se eliminó la plataforma, y el contenido a registrar durante el tiempo establecido incluía principalmente el número de veces que el ratón cruzó la plataforma, el tiempo de permanencia del cuadrante objetivo, etc., y se analizó la estrategia de búsqueda de cada animal experimental.

2.3 Extracción de tejido cerebral e incrustación de parafina

Después de la administración, los ratones fueron pesados, y los ratones fueron anestesiados con 10% de hidrato de cloral. Coloque el ratón anestesiado sobre la mesa de operaciones para fijar las extremidades. Después de una perfusión y fijación de paraformaldehído al 4%, se sacrificaron los animales, se extirpó el cerebelo y otro tejido cerebral adicional, y se extirpó todo el cerebelo y el cerebro a lo largo del extremo del hemisferio cerebral.

La mitad delantera de la corona central. Fijar en paraformaldehído al 4% durante 24 horas, lavar con agua ultrapura durante 10 minutos, y luego poner en etanol al 30% (1 h) → etanol al 40% (1 h) → etanol al 50% (1 h) → etanol al 75% (1 h) ) → etanol al 90% (1 h) → etanol al 95% (1 h) → etanol anhidro I (1 h) → etanol anhidro II (1 h) → xileno I (15 min) → xileno II (15 min). Después de estar sumergidos en parafina durante 2 horas, los tejidos se incrustaron en secciones coronales continuas en el área CA1 del hipocampo del cerebro del ratón. Después de secar en un horno a 60 °C durante 48 h, conservar a temperatura ambiente.

2.4 Tinción HE

Hornea las rodajas seleccionadas en cada grupo en un horno de 60 °C durante 40 minutos, y luego colócalas en xileno I (5 min) → xileno II (10 min) → etanol absoluto (5 s) → etanol I (5 s) al 95% → al etanol II (5 s) al 95% → al etanol al 80% (5 s) → agua destilada

En segundo lugar, use el kit de tinción HE para manchar y montar las diapositivas con goma neutra.

2.5 Tinción inmunohistoquímica

Las secciones preparadas se sometieron a tinción inmunohistoquímica de acuerdo con los pasos estándar de desparafinado, recuperación de antígenos, bloqueo de catalasa endógena, bloqueo de suero, incubación primaria de anticuerpos, incubación secundaria de anticuerpos, desarrollo de color DAB, deshidratación y montaje. Elija 6 rebanadas adecuadas para cada grupo, observe la finura de la neurona bajo el microscopio electrónico

Morfología celular, coloración y conteo del número de células positivas del hipocampo utilizando el software Image J.

2.6 Análisis de Western blot de la expresión de proteínas

Aspirar el sobrenadante tisular para determinar el contenido de proteína extraído del hipocampo del tejido cerebral de acuerdo con el método de cuantificación de proteínas BCA. Mézclelo con un tampón de carga de proteínas de 4× en una proporción de 4:1, caliéntelo a 95 °C durante 10 min, enfríelo naturalmente y guárdelo en un refrigerador a -20 °C. Prepare el gel SDS-PAGE, agregue la solución de electroforesis y luego agregue el grupo normal, el grupo de intervención del medicamento y otras histonas en secuencia, y agregue el marcador de proteína a los orificios del gel en ambos lados. Detenga la electroforesis en el baño de hielo hasta el fondo del gel de separación. Después de equilibrar el líquido de la membrana de transferencia, corte la membrana de PVDF y el papel de filtro de acuerdo con el tamaño del pegamento. En la abrazadera de transferencia, siga los pasos de la estera de fibra negra → 3 capas de papel de filtro → gel → membrana de PVDF → 3 capas de papel de filtro → estera de fibra negra para ensamblar. Después de eliminar las burbujas, transfiera la membrana a una presión constante de 80 V. Después de completar la transferencia de la película, la leche descremada se sella durante 2 h. El anticuerpo diluido se agrega a la membrana correspondiente y se incuba la noche. Después de incubar el anticuerpo secundario durante 2 h, agregue la solución de desarrollo de color BCIP / NBT hasta que se desarrolle el color. BIO-RAD gel imager toma fotografías. Utilice el software Image J para analizar cuantitativamente la banda de proteína objetivo y use IOD para indicar la fuerza relativa de la banda de proteínas. El resultado se expresa como la relación entre el valor de densidad óptica integrada de la proteína diana y la proteína de control β-actina. El resultado se expresa como (ID de proteína objetivo/ID de referencia interna) × 100%.

2.7 Análisis estadístico de los datos

Utilice SPSS18. 0 Realizar análisis estadísticos de los datos. Los datos están representados por (x± s ). La comparación de datos entre grupos utiliza la prueba y el análisis ANOVA unidireccional, y las comparaciones múltiples entre los datos utilizan la prueba LSD-t (diferencia menos significativa, LSD). ), con P<0. 05="" or="" p=""><0. 01="" means="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

3 Resultados experimentales

3.1 Resultados de la detección del laberinto de agua de Morris

A medida que el tiempo de entrenamiento continúa aumentando, el tiempo para que cada grupo de ratones llegue a la plataforma (latencia de escape) se acorta significativamente. El primer y segundo día son el tiempo de entrenamiento. En el tercer día, la latencia de escape del grupo modelo fue significativamente mayor que la del grupo de control normal (P<0.01); the="" fourth="" and="" fifth="" days="" were="" compared="" with="" the="" normal="" control.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" escape="" latency="" of="" the="" mice="" in="" the="" donepezil="" group="" was="" significantly="" shorter="" than="" that="" of="" the="" model="" group="" (p=""><0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" glycosides="" of="">cistanchealcohol fenetílico En cada grupo de dosis yActeosidesa medida que aumentaba la dosis, la latencia de escape de los ratones se acortó significativamente, con diferencias significativas (P<0.05) (see="" table="">

En el sexto día del experimento del laberinto de agua, la plataforma fue removida para un experimento de exploración espacial, y se registró el número de veces que cada grupo de ratones cruzó la posición de la plataforma dentro de los 60 s. Se puede ver en los resultados que el número de veces que se cruzó la plataforma en el grupo modelo dentro del tiempo establecido se redujo significativamente en comparación con el grupo normal (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" total="" glucoside="" groups="" and="" mullein="" the="" number="" of="" times="" of="" crossing="" the="" platform="" in="" the="" glycoside="" group="" was="" significantly="" increased="" (p=""><0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 2).="" the="" above="" research="" results="" all="" suggest="" that="">Glucósidos feniletanoides de cistanchepuede mejorar significativamente la capacidad de aprendizaje y memoria de los ratones con EA doble transgénico APP / PS1, y tiene una cierta dependencia de la dosis.

3.2 Resultados de la observación de la tinción patológica de tejidos

Los resultados muestran que las neuronas en el área CA1 del hipocampo en el grupo normal están dispuestas de manera ordenada y apretada, distribuidas de manera más uniforme, con capas claras, y el núcleo de la célula del cuerpo vertebral es más grande y la forma es aproximadamente redonda. Sin embargo, el área CA1 del hipocampo de los ratones del grupo modelo se dañó, lo que resultó en cambios obvios en las células neuronales y la morfología, la disposición era suelta y caótica, no había una jerarquía obvia, las conexiones entre las células estaban sueltas y algunos núcleos aparecieron picnosis y apoptosis, haciendo que la tinción fuera más profunda. Las células CA1 del hipocampo de las diferentes dosis deCistanche fenetanósidoel grupo de intervención, el grupo de donepezilo y el grupo de intervención de verbascósidos mejoraron en diversos grados. Las células neuronales picnóticas y profundamente teñidas se redujeron significativamente en comparación con el grupo modelo, pero aún se pueden ver otras más grandes en el espacio intercelular (ver Figura 1).

3.3 Resultados del experimento de inmunohistoquímica

Después del tratamiento con glucósidos de alcohol fenetílico de Cistanche, se tomó una sección de tejido cerebral de ratón doble transgénico APP/PS1 de nueve meses de edad, y el área CA1 del hipocampo se sometió a tinción inmunohistoquímica Aβ1-40. Los resultados mostraron que las células positivas eran en su mayoría circulares en el campo visual La mayoría de las membranas celulares son de color amarillo parduzco. En comparación con el grupo normal, el número de células Aβ1-40 positivas en el área CA1 del hipocampo del grupo modelo aumentó significativamente (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" phenethyl="" alcohol="" glycosides="" of="">Cistanche tubulosaera alto. El número de células positivas en el grupo de dosis media y en el grupo de glucósidos acteósidos se redujo significativamente (P<0.01), the="" donepezil="" group,="" and="" the="">Glucósidos feniletanoides de cistanchedosis baja.

El número de células Aβ1-40 positivas en el grupo de dosis se redujo significativamente (P<0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 3,="" figure="">

Después de la intervención de glucósidos feniletanoides cistanque, se tomaron los tejidos cerebrales de ratones transgénicos dobles APP/PS1 de 9 meses de edad, y el área CA1 del hipocampo se tiñó con tinción inmunohistoquímica Aβ1-42. Los resultados mostraron: Comparado con el grupo modelo,Glucósidos feniletanoides de cistancheEl número de células positivas en cada grupo de dosis de glucósidos y grupo de glucósidos acteósidos se redujo significativamente, con una diferencia significativa (P<>

3.4 Resultados de la prueba de Western-blot

El método Western-blot se utilizó para detectar la expresión de la proteína Aβ1-40 y Aβ1-42 en el hipocampo de ratones. Los resultados mostraron que la expresión proteica de Aβ1-40 y Aβ1-42 en el hipocampo del grupo modelo estaba significativamente regulada al alza en comparación con el grupo normal, y hubo una diferencia significativa (P< 0.="" 05).="" the="" protein="" expressions="" of="" hippocampus="" aβ1-40="" and="" aβ1-42="" in="" mice="" in="" the="" intervention="" group="" of="">Glucósido feniletanoide cistancheyverbascósidoel grupo de intervención se reguló significativamente a la baja en comparación con los ratones del grupo modelo (P<0.01), and="" there="" was="" a="" significant="" difference="" (p=""><0.01). 01),="" see="" figure="">