Efectos de cuatro extractos de hierbas chinas en células de carcinoma de pulmón de células pequeñas sensibles a los medicamentos y resistentes a múltiples medicamentos

David Sádavajulie ahn Mei Zhan Mei Lin Pangjane dingSusan E Kane

Propósito abstracto:Examinamos la farmacología, la biología celular y la biología molecular de células de carcinoma de pulmón de células pequeñas tratadas con cuatro extractos deHierbas medicinales chinas. Muchos pacientes con cáncer toman estos medicamentos, pero se desconocen en gran medida sus efectos a nivel celular. Estábamos especialmente interesados ​​en los efectos sobre las células resistentes a los medicamentos, ya que la resistencia es un problema clínico significativo encáncer de pulmónR. Métodos: Se expusieron células epiteliales de pulmón normales (BEAS-2) sensibles a los medicamentos (H69), resistentes a múltiples medicamentos (H69VP) a extractos de dos plantas utilizadas en la medicina herbaria china paracáncer de pulmón: Glycyrrhiza glabra (GLYC) y Olenandria diffusa (OLEN), y extractos de dos combinaciones comercialmente disponibles deHierbas medicinales chinas, SPES (15 hierbas) y PC-SPES (8 hierbas). La citotoxicidad se midió en términos de inhibición del crecimiento celular (IC50). La cinética de la fragmentación del ADN después de la exposición a los extractos de hierbas se midió mediante marcaje con BudR seguido de ELISA. La apoptosis se midió mediante el ensayo TUNEL seguido de citometría de flujo. La expresión de genes relacionados con la apoptosis y el ciclo celular se midió mediante transcripción inversa de ARNm seguida de hibridación en filtración con matrices de sondas y detección por quimioluminiscencia. Resultados: En cada caso, los cuatro extractos de hierbas fueron igualmente citotóxicos para H69 y H69VP y menos citotóxicos para BEAS-2. Los cuatro extractos indujeron la fragmentación del ADN en las células de carcinoma de pulmón. La cinética mostró fragmentos de ADN liberados al medio (un indicio de necrosis) en cultivos expuestos a GLYC, pero dentro de las células (un indicio de apoptosis) en cultivos expuestos a OLEN, SPES y PC-SPES. El análisis TUNEL confirmó que la exposición a los últimos tres extractos, pero no a GLYC, condujo a la apoptosis. En comparación con las células no tratadas y las tratadas con GLYC, las células H69 y H69VP tratadas con OLEN, SPES y PC-SPES mostraron una expresión elevada de varios genes implicados en la cascada apoptótica, similar a las células tratadas con etopósido y vincristina.

Conclusión:losmedicina herbaria chinaLos extractos OLEN, SPES y PC-SPES son citotóxicos tanto para los resistentes como para los sensibles a los medicamentos.cáncer de pulmónmuestran cierta especificidad de células tumorales en comparación con su efecto sobre las células normales, y son proapoptóticos según lo medido por rupturas de ADN y expresión génica. La reacción de las células tumorales a estos extractos fue similar a su reacción a los fármacos quimioterapéuticos convencionales.

Cistanche, un preciosomedicina herbaria china, tiene el efecto de mejorar la inmunidad ycáncer de pulmón. Cistanche tiene una larga historia de uso medicinal. Se registró por primera vez en "Materia médica de Shen Nong". Shennong probó todo tipo de hierbas. La eficacia y el papel de Cistanche son significativos para vigorizar el riñón y nutrir la esencia, aliviar la fatiga, humedecer los intestinos y la defecación, nutrir el yang y nutrir el yin, etc., así se registró en el libro. Durante la dinastía posterior a Tang, Cistanche figuraba como uno de los nueve tipos de hierba de hadas chinas. La investigación moderna se ha llevado a cabo durante más de 60 años. , Antienvejecimiento, ayuda a mejorar la memoria y la inmunidad, etc.

Palabras clave:Cáncer de pulmón, Resistencia a las drogas,Hierbas medicinales chinas,cistanche

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com

Introducción

celda pequeñacáncer de pulmón(SCLC) representa alrededor del 20 por ciento de todoscánceres de pulmóny es agresivo, con una tasa de supervivencia de 5-años en el momento del diagnóstico de menos del 10 por ciento [19]. Los pacientes suelen presentar enfermedad diseminada, por lo que el tratamiento es quimioterapia, con combinaciones que suelen incluir cisplatino, etopósido, doxorrubicina, 5-fluorouracilo y taxol [12]. Desafortunadamente, este tratamiento finalmente se vuelve ineficaz porque la mayoría de los tumores SCLC desarrollan resistencia a múltiples fármacos [18]. Dado que existen muchos mecanismos de resistencia [15], superar la resistencia es un desafío clínico importante.

Frente a los cuidados paliativos, muchos pacientes con cáncer utilizan medicinas alternativas, incluidas las terapias a base de hierbas [6, 23]. Entre estas terapias, la medicina tradicional china es probablemente la mejor establecida y codificada, con una antigüedad de varios miles de años. La base teórica de este sistema médico se refiere a las fuerzas opuestas del yin y el yang, los ciclos generativo y destructivo, y una fuerza vital o qi [2]. Se han ideado extractos y combinaciones de hierbas específicas para tratar enfermedades específicas, incluido el cáncer [11, 27]. Aunque existe alguna evidencia empírica de que las hierbas son efectivas en el tratamiento del cáncer, se desconocen en gran medida sus mecanismos de acción a nivel celular. Esto adquiere mayor importancia si los pacientes combinan su uso con la quimioterapia convencional. Además, no se han informado los efectos de los extractos de hierbas sobre la resistencia a los medicamentos.

Investigamos los efectos de cuatroHierbas medicinales chinasen tres líneas celulares: SCLC, SCLC resistente a múltiples fármacos y epitelio pulmonar normal. Dos de los cuatro extractos procedían de plantas individuales que a menudo se prescriben para el cáncer de pulmón, Glycyrrhiza glabra (GLYC) y Olenandria diffusa (OLEN). Los otros dos eran de combinaciones de hierbas comercialmente disponibles llamadas SPES y PC-SPES. OLEN (nombre chino Bai Hua she cao) tiene actividades antitumorales, antimutagénicas e inmunoestimulantes [1, 25, 29]. GLYC (nombre chino gan car) es antiinflamatorio, antitumoral y antimutagénico [7, 11]. SPES, desarrollado por BotanicLabs (Brea, Calif.), se presenta en forma de cápsulas que contienen extractos liofilizados de 15 hierbas chinas y se ha demostrado que disminuye el dolor en pacientes con cánceres avanzados [14]. Entre las hierbas en SPES están el estimulante inmunológicoCistanchedeserticola, el agente antitumoral Rabdosia rubescens y el agente antiinflamatorio Zanthoxylum iridium [1, 11]. PC-SPES, también preparado por BotanicLabs, contiene ocho hierbas, incluido el antiandrogénico Serenoa repens que inhibe la hiperplasia prostática [21], el inhibidor de la proteína quinasa C Scutellaria baicalensis [13], el agente antitumoral Panax ginseng [30] y Glycyrrhiza glabra ( véase más arriba). Si bien faltan pruebas rigurosas de la eficacia antitumoral clínica de GLYC, OLEN y SPES, existen algunas pruebas de la eficacia de PC-SPES. Tanto en células de cáncer de próstata como en modelos animales, PC-SPES es proapoptótico y citotóxico [8, 9, 10, 28]. Los ensayos clínicos han indicado que es eficaz para reducir los niveles de antígeno prostático específico y para detener el crecimiento tumoral en el cáncer de próstata dependiente e independiente de andrógenos [4, 5, 17, 20, 26].

Aunque los pacientes con cáncer sin duda usan extractos de hierbas, hay pocos datos preclínicos o clínicos sobre los efectos de estos extractos en SCLC. Nuestro objetivo era comenzar este análisis con un examen de la farmacología (citotoxicidad), la biología celular (método de muerte celular) y la biología molecular (expresión génica) en células SCLC sensibles y resistentes a los medicamentos.

materiales y métodos

Extractos y productos químicos

GLYC y OLEN se obtuvieron como plantas secas de Jen-On Medical Group (Monterey Park, California). Para la preparación de un extracto, se molieron 0,5 g hasta obtener un polvo fino con un mortero y se suspendió en 30 ml de agua destilada. En la medicina china, los extractos de plantas se consumen como tés después de calentarlos. Por lo tanto, la suspensión se incubó con agitación a 70 grados durante 18 h. Después de la centrifugación a 1500 g durante 10 min, el sobrenadante se esterilizó filtrándolo a través de un filtro de 0,45-lm usando una jeringa. El extracto resultante se ajustó con agua destilada a 17 mg/ml en base al material vegetal original. Los extractos se almacenaron a 4 grados hasta por 1 semana hasta su uso.

SPES y PC-SPES se obtuvieron de BotanicLabs (Brea, California) en forma de cápsulas. El método de extracción utilizado ha sido empleado en estudios previos de estos preparados [8, 9, 10]. El contenido de una cápsula (320 mg) se disolvió en 1 ml de etanol al 95 por ciento y la suspensión se incubó con agitación a 37 grados durante 1 h. Después de la centrifugación a 3000 g durante 10 min, el sobrenadante se esterilizó por filtración como se indicó anteriormente. La concentración final fue de 300 mg/ml basada en el material vegetal original. Los extractos se almacenaron a -20 grados hasta por 1 semana hasta su uso.

Cultivos celulares y medición de citotoxicidad

Se cultivaron células SCLC NCI-H69 a 37 grados en una atmósfera que contenía 5 por ciento de CO2 como una suspensión en medio sin suero AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY). Una línea celular multirresistente (H69VP) seleccionada en etopósido [16] también se cultivó en AIM-V y mostró resistencia cruzada a etopósido (9- veces), doxorrubicina (20- veces) y vincristina (10-veces) (datos no mostrados). Estas células tienen múltiples mecanismos de resistencia a fármacos, incluyendo alteraciones en la topoisomerasa II y la expresión de las bombas de membrana, MDR1 y MRP. Se cultivaron células epiteliales de pulmón normales BEAS-2 [22] en DMEM-F12 complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento.

Para las pruebas de citotoxicidad, se añadieron extractos como se indica a células en crecimiento logarítmico en cultivos de 1-ml que contenían 6000 células/ml. Después de 4 días de exposición continua, se contaron las células en un contador Coulter Z-1. Los recuentos se validaron microscópicamente mediante hemocitómetro después de la tinción con azul de tripano. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces. Los valores de IC50, definidos como la concentración de extracto que había reducido los recuentos de células en el día 4 en un 50 por ciento, se calcularon en comparación con los controles de disolvente. Los valores medios se calcularon y compararon mediante ANOVA para las tres líneas celulares de ese extracto.

Ensayos de muerte celular

El mecanismo de citotoxicidad se investigó mediante la cinética de fragmentación del ADN celular (kit de Boehringer-Mannheim, Indianápolis, Indiana). Brevemente, se incubaron 5 x 105 células/ml durante 16 horas a 37 grados en una atmósfera que contenía 5 por ciento de CO2 en medio AIM-V que contenía 10 µM de BudR. Las células se lavaron y resuspendieron a 105/ml en medio libre de BudR, y 200 ll de este cultivo se incubaron con extracto de hierbas a 2·IC50 durante el tiempo indicado, luego de lo cual se retiraron 100 ll del medio de cultivo para la cuantificación de ADN. fragmentos por ELISA. Esta es una medida de la necrosis celular. Los fragmentos de ADN dentro de las células, generados por apoptosis, se midieron después de la lisis celular en albúmina de suero bovino (BSA)/Tween 20 a 21 grados durante 30 min. Después de la centrifugación, el lisado se usó para ELISA.

El ELISA se realizó en una placa de microvaloración de fondo redondo recubierta con anticuerpo anti-ADN (monoclonal de ADN anti-humano de ratón, clon MCA-33) durante la noche a 4 grados. Después del bloqueo con BSA, se añadieron 100 µl de solución de fragmentos de ADN marcados a los pocillos revestidos seguido de incubación durante 90 min a 21°C. El ADN se fijó y desnaturalizó mediante radiación de microondas a 500 W durante 5 min. Se añadió anti-BudR de ratón (BMG 6HB monoclonal de ratón) conjugado con peroxidasa y, tras la incubación en la oscuridad durante 120 min a 21 grados, se detuvo la reacción mediante la adición de 500 µl de H2SO4 concentrado. El color resultante se cuantificó por absorbancia a 450 nm. Las muestras tratadas con extracto se compararon con los controles no tratados como antecedentes.

La apoptosis se confirmó mediante análisis TUNEL. Las células en crecimiento logarítmico se expusieron a extracto de hierbas a 1·IC50 durante 3 h. Luego se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1 por ciento de BSA y se resuspendieron en PBS/BSA a 5·105 células/ml. A 500 µl de células, se añadieron 100 µl de paraformaldehído al 4 por ciento y las células se fijaron a 21 grados durante 1 h. Después del lavado en PBS, las células se resuspendieron en 100 ll de tampón de permeabilización frío (0,1 por ciento de Triton X-100, 0,1 por ciento de citrato de sodio) durante 2 minutos a 4 grados. Las células se lavaron dos veces en PBS y luego se resuspendieron en una mezcla TUNEL de 50 µl que contenía desoxirribonucleótido-idil transferasa terminal (TdT) y fluoresceína-dUTP (kit Boehringer-Mannheim). Después de la incubación en la oscuridad a 37 grados durante 1 hora, las células se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron por citometría de flujo.

Análisis de expresión génica

Se incubaron cultivos (6 ml) de células en crecimiento logarítmico (5·105 células/ml) en un medio que contenía extracto de hierbas a 1·IC50 a 37 grados en una atmósfera que contenía 5 por ciento de CO2 durante 3 h. Después de lavar dos veces en PBS, los sedimentos celulares se congelaron a -70 grados durante la noche. El ARN se aisló mediante el protocolo RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA). En general, este método produjo 0,5 LG de ARN. Esta cantidad de ARN se transcribió inversamente a ADNc y se marcó con biotina-dUTP, y se hibridó con sondas desnaturalizadas para genes relacionados con la apoptosis y el ciclo celular en filtros. La hibridación se detectó mediante la unión de fosfatasa alcalina-estreptavidina al ADNc usando un sustrato quimioluminiscente, CDP-Star (SuperArray, Bethesda, Md.), seguido de exposición a una película de rayos X, generalmente durante 1 a 2 minutos.

Los objetivos del gen de control en cada filtro incluían b-actina y GAP-DH como controles positivos y pUC18 como control negativo. Los siguientes genes relacionados con el ciclo celular y la apoptosis fueron objetivos de hibridación: bad, bcl-2, BCL-w, BCL-x, caspases 1–10, c-myc, E2F, fas, fas ligand, gadd45, iNOS , mdm2, NFkB, p21Waf1, p53, pig7, pig8, Rb, DR5, trail, Casper, CRADD, DAXX, IAP-1, IAP-2, NIK, TNFR2, TRAF2, TRAF3, TRAF5 y DR5. La intensidadde hibridación se puntuó visualmente en puntos duplicados en tándem en el filtro en relación con los controles positivos.

Resultados

Nuestros experimentos iniciales probaron la citotoxicidad de los extractos de hierbas chinas en células SCLC sensibles y resistentes a los medicamentos, así como en células epiteliales de pulmón normales. Como se muestra en la Tabla 1, los cuatro extractos de hierbas fueron citotóxicos a bajas concentraciones. Estos hallazgos son similares a los encontrados para SPES y PC-SPES en otras líneas de células tumorales [8]. En cada caso, los valores de IC50 para las células resistentes a múltiples fármacos (H69VP) no fueron diferentes de los de las células sensibles a los fármacos (H69). Además, los valores de IC50 para las células epiteliales de pulmón normales fueron significativamente más altos que los de las líneas de células tumorales.

Luego investigamos el mecanismo de citotoxicidad utilizando la cinética de fragmentación del ADN como indicación de apoptosis (fragmentos formados lentamente dentro de las células) o necrosis (fragmentos formados rápidamente y liberados de las células dañadas). Las células se incubaron en extracto de hierbas entre 30 min y 8 h, y luego se estimaron los fragmentos de ADN mediante ELISA tanto en el medio de cultivo como en los lisados ​​celulares. La Figura 1 muestra datos representativos de células H69 expuestas a los cuatro extractos durante 90 min. Con tres de los extractos (SPES, PC-SPES, OLEN), la mayoría de los fragmentos de ADN provenían del interior de las células (lisados), lo que indica apoptosis. Sin embargo, con GLYC, los fragmentos se liberaron al medio desde las células dañadas, lo que indica necrosis. Se obtuvieron resultados similares con células H69VP (datos no mostrados).

Estos experimentos de citotoxicidad fueron seguidos por ensayos TUNEL de roturas de ADN in situ. En comparación con los controles no tratados (1 a 3 por ciento de células apoptóticas en cuatro experimentos), las células SCLC tratadas con SPES (58 a 85 por ciento), PC-SPES (63 a 77 por ciento) y OLEN (49 a 81 por ciento) mostraron positividad de TUNEL, mientras que las células tratadas con GLYC no (1-2 por ciento) (Fig. 2). Se obtuvieron resultados similares con células H69VP (datos no mostrados).

Analizamos la transcripción de genes en respuesta a extractos de hierbas utilizando GeneArrays. Estas matrices tienen genes dispuestos en tándem relacionados con el ciclo celular y la apoptosis. Realizamos estos experimentos dos veces con resultados similares. La Figura 3 muestra diagramas de matriz autora representativos de células H69 expuestas a etopósido o SPES. Nuestros resultados para las células H69 se resumen en la Tabla 2. Mientras que los controles no tratados tenían una expresión detectable de solo algunos de los genes estudiados, las células tratadas con fármacos quimioterapéuticos convencionales (etopósido y vincristina) mostraron fuertes señales para una serie de genes implicados en el ciclo celular. regulación y apoptosis. Las células tratadas con OLEN, SPES y PC-SPES mostraron un patrón similar al obtenido con los dos fármacos. En general, las células tratadas con GLYC no parecían mostrar este patrón de transcripción y, en cambio, mostraban una fuerte expresión del gen antiapoptosis, BCL-2.

Discusión

Realizamos estos estudios por dos razones. En primer lugar, existe una antigua tradición de medicina herbaria china que se basa en sus propias teorías y filosofía [2], y queríamos empezar a comprender en términos médicos occidentales los efectos de los remedios herbales. Estas hierbas se utilizan como mezclas y, si bien ha habido cierto progreso en su descomposición en constituyentes químicos individuales[11], nuestros estudios se centraron en cómo se utilizan en la práctica tradicional. Nuestra segunda motivación fue que muchos pacientes con cáncer usan estas hierbas junto con tratamientos convencionales [6, 23], y comprender los efectos celulares de las hierbas podría proporcionar información importante para la toma de decisiones clínicas.

Los datos de citotoxicidad (Tabla 1) mostraron que los cuatro extractos de hierbas eran de hecho citotóxicos para las células tumorales, más en función de la dosis que para las células epiteliales pulmonares normales, lo que indica cierta especificidad tumoral y posiblemente un índice terapéutico favorable. Las similitudes en IC50 entre células sensibles a fármacos y resistentes a múltiples fármacos indican que estos extractos no se ven afectados por los mecanismos de resistencia a fármacos que se muestran en las células H69VP, incluida la sobreexpresión de dos transportadores de fármacos, MDR1 y MRP.

La cinética de fragmentación del ADN mostró que los extractos SPES, PC-SPES y OLEN fueron proapoptóticos, mientras que GLYC fue pronerótico (Fig. 1). Esto fue confirmado por tinción TUNEL in situ (Fig. 2). La mayoría de los fármacos quimioterapéuticos convencionales son proapoptóticos [3], y un grupo de genes reguladores del ciclo celular y apoptóticos se regula positivamente en las células en respuesta a los fármacos [24]. Encontramos que el patrón de expresión de algunos de los genes expresados ​​en respuesta a los tres pro app a extractos de hierbas fue similar al observado en estas células después de la exposición a fármacos quimioterapéuticos convencionales (Fig. 3, Tabla 2). La respuesta a GLYC solo parecía ser diferente, al menos en el punto de tiempo analizado en estos experimentos. Curiosamente, GLYC es parte de PC SPES, que era proapoptótico, mientras que GLYC solo no lo era. Quizás otros componentes de PC-SPES sean responsables de su actividad proapoptótica. Si bien estos resultados no muestran cómo los extractos herbales dañaron las células, sugieren que las células H69 responden al daño a nivel molecular (transcripción) y celular (apoptosis) de manera similar a su respuesta a la quimioterapia.

Nuestros estudios indican la utilidad potencial de estos extractos de hierbas chinas en el tratamiento del SCLC, particularmente en la enfermedad resistente a los medicamentos.

Expresiones de gratitudDamos las gracias a L. Brown por su inestimable asistencia con compañeros de citometría y R. Lingeman por su asistencia con los protocolos de biología molecular. Las células BEAS-2 fueron proporcionadas generosamente por el Dr. I. Laird-Offringa, Universidad del Sur de California, Norris Cancer Center. SPES y PC-SPES fueron un regalo del Dr. S. Chen, New York Medical College. Esta investigación fue apoyada por la Fundación de la Familia Pritzker y la Fundación WM Keck.

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