Efectos del ácido perfluorooctanoico sobre la microbiota intestinal y los metabolitos microbianos en ratones C57BL / 6J Ⅱ

2. Materiales y métodos

2.1. animales

Se adquirieron ratones macho C57BL/6J libres de patógenos específicos de cuatro semanas de edad en Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Los ratones consumieron agua potable ad libitum. Las instalaciones para animales de la Universidad de Georgia se mantuvieron a 22 ◦C y 40-70% de humedad, bajo un ciclo de luz: oscuridad de 12:12 h. Antes del experimento de exposición al PFOA, se alojaron cinco ratones en una jaula y los ratones cambiaron de jaula al azar una vez por semana durante cuatro semanas. La exposición al PFOA comenzó cuando los ratones tenían ocho semanas de edad y el período de exposición duró cuatro semanas. Al comienzo del experimento, los ratones fueron asignados aleatoriamente al grupo de exposición al PFOA o al grupo de control (n=10 ratones en cada grupo), con un ratón en una jaula. Se administró PFOA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) a ratones a través del agua potable. La concentración final de PFOA en el agua potable fue de 1 parte por millón (ppm). La dosis se eligió en base a nuestro estudio anterior [24]. Los ratones control consumieron agua potable sin la adición de PFOA. El protocolo para animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgia (código de protocolo: A2014 10-014-Y2-A1).

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2.2. Extracción de metabolitos

La extracción de metabolitos se realizó como se describió anteriormente [25]. Brevemente, se extrajeron 20 µl de cada muestra de suero con 225 µl de metanol. Las muestras se agitaron durante 10 segundos. Luego, se añadieron 750 µl de metil terc-butil éter (MTBE) y 188 µl de agua a las muestras anteriores para inducir la separación de fases. Las muestras se agitaron a 4 ◦C durante 6 min, seguido de una centrifugación a 14,000×g durante 2 min. El disolvente de extracción se desgasificó y se preenfrió a -20 ◦C. La fase no polar superior (350 µL) se recogió y se evaporó hasta sequedad completa usando un concentrador de trampa en frío Labconco Centrivap (Labconco, Kansas, MO, EE. UU.). Para muestras de hígado y heces, se agregaron 225 µL de metanol y 750 µLTBE a 10 mg de cada muestra. Las muestras se homogeneizaron utilizando un GenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, Nueva Jersey, EE. UU.) a una velocidad de 1500 rpm para 30 arenas, luego se agitaron y se agitaron a 4 ◦C durante 6 min. Luego, se agregaron 188 µl de agua a las muestras, seguido de una centrifugación a 14,000× g durante 2 min. La fase no polar superior (350 µl) se recogió y se evaporó hasta sequedad completa. Luego, las muestras secas se resuspendieron en 60 µl de acetonitrilo 4:1 y agua (v/v) con estándares internos. Las muestras se agitaron en un vórtex, seguido de sonicación durante 5 minutos y centrifugación a 14,{35}} x g durante 2 minutos. El sobrenadante se recogió para análisis LC-MS.

2.3. Perfiles de metabolómica no específicos

El perfil metabolómico no dirigido se realizó como se describió anteriormente [25]. El sistema Vanquish UHPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) se utilizó para la separación de metabolitos con una columna Acquity UPLC BEH Amide (150 mm × 2,1 mm × 1,7 µm), que se acopló a una columna Acquity VanGuard BEH Amide pre- columna (5 mm × 2,1 mm × 1,7 µm, Waters, Milford, MA, EE. UU.). Agua de grado LC-MS (100%) con formiato de amonio 10 mM y 0.125% de ácido fórmico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , EE. UU.) se usó como fase móvil A. Mientras tanto, se usó acetonitrilo: agua 95:5 (v/v) que contenía formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,125% como fase móvil B. El gradiente comenzó con 100% B a 0– 2 min, 70% Bat 7,7 min, 40% B a los 9,5 min y 30% B a los 10,25 min, seguido de 100% B a los 12,75-16,75 min. El caudal se mantuvo a 0,4 ml/min. Los espectros se recolectaron en modo positivo de ionización por electropulverización (ESI) utilizando Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). El rango de masas se configuró entre m/z 60 y 900 con un modo dependiente de los datos para la adquisición de espectros MS/MS. Los datos sin procesar de metabolómica no dirigida se convirtieron primero en archivos ABF utilizando el convertidor ABF (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (consultado el 6 de julio de 2022)). Se utilizó MSDIAL versión 5.1.0.1 para la identificación y cuantificación de metabolitos [26]. Se utilizó el Optimizador de lista de características espectrales de masas (MS-FLO) para mejorar la calidad de las listas de características marcando características para una mayor curación de datos [27]. Tiempo de retención bibliotecas m/zy las bases de datos de espectros Fiehn HILIC MS/MS en MassBank de Norteamérica se utilizaron para la identificación de metabolitos.

2.4. Secuenciación del gen ARNr 16S

El ADN total se extrajo de muestras fecales utilizando el kit de aislamiento de ADN PowerSoil® (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los cebadores 515F y 806R para la amplificación de la región V4 del gen rRNA 16S, seguido mediante normalización y códigos de barras. El ADN se secuenció en el kit IlluminaMiSeq v2 con 500 ciclos. Los datos de secuenciación del gen 16S rRNA se analizaron utilizando Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) II [28]. Brevemente, los datos de secuenciación sin procesar se eliminaron a través de DADA2, seguido de la selección de unidades taxonómicas operativas (OTU). SILVA (versión 138), entrenado por el clasificador basado en scikit-learn Naïve-Bayes, se utilizó como base de datos.

2.5. Análisis estadístico

Se utilizó el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) para determinar los géneros bacterianos que tenían más probabilidades de explicar las diferencias entre los grupos de PFOA y de control [29]. Para la comparación de metabolitos, se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para calcular los valores de p entre los grupos de PFOA y control. La tasa de descubrimiento falso se utilizó para corregir las comparaciones múltiples. Los metabolitos con un valor p < 0.05 se consideraron significativos. El análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) y el análisis de enriquecimiento de vías se realizaron utilizando MetaboAnalyst 5.0 [30]. MixOmics se utilizó para el análisis integrador de la microbiota intestinal y los metabolitos fecales; este es un marco integrador para el análisis multivariado de datos ómicos [31].

Medicina herbaria natural para aliviar el estreñimiento-Cistanche

Cistanche es un género de plantas parásitas que pertenece a la familia Orobanchaceae. Estas plantas son conocidas por sus propiedades medicinales y se han utilizado en la Medicina Tradicional China (MTC) durante siglos. Las especies de Cistanche se encuentran predominantemente en regiones áridas y desérticas de China, Mongolia y otras partes de Asia Central. Las plantas de cistanche se caracterizan por sus tallos carnosos y amarillentos y son muy valoradas por sus potenciales beneficios para la salud. En la medicina tradicional china, se cree que Cistanche tiene propiedades tónicas y se usa comúnmente para nutrir los riñones, mejorar la vitalidad y apoyar la función sexual. También se utiliza para abordar problemas relacionados con el envejecimiento, la fatiga y el bienestar general. Si bien Cistanche tiene una larga historia de uso en la medicina tradicional, la investigación científica sobre su eficacia y seguridad está en curso y es limitada. Sin embargo, se sabe que contiene varios compuestos bioactivos como glucósidos feniletanoides, iridoides, lignanos y polisacáridos, que pueden contribuir a sus efectos medicinales.

Wecistanche'scistanche en polvo, tabletas de cistanche, cápsulas de cistanchey otros productos se desarrollan utilizandodesiertocistancheComo materias primas, todos los cuales tienen un buen efecto para aliviar el estreñimiento. El mecanismo específico es el siguiente: Se cree que Cistanche tiene beneficios potenciales para aliviar el estreñimiento según su uso tradicional y ciertos compuestos que contiene. Si bien la investigación científica específicamente sobre el efecto de Cistanche sobre el estreñimiento es limitada, se cree que tiene múltiples mecanismos que pueden contribuir a su potencial para aliviar el estreñimiento. Efecto laxante:cistancheSe ha utilizado durante mucho tiempo en la Medicina Tradicional China como remedio para el estreñimiento. Se cree que tiene un efecto laxante suave, que puede ayudar a promover las deposiciones e inducir el estreñimiento. Este efecto puede atribuirse a varios compuestos de Cistanche, como los glucósidos y polisacáridos de feniletanoide. Humedecer los intestinos: según el uso tradicional, se considera que Cistanche tiene propiedades humectantes, dirigidas específicamente a los intestinos. Promover la hidratación y lubricación de los intestinos puede ayudar a ablandar las herramientas y facilitar el paso, aliviando así el estreñimiento. Efecto antiinflamatorio: el estreñimiento a veces puede estar asociado con inflamación en el tracto digestivo. Cistanche contiene ciertos compuestos, incluidos glucósidos feniletanoides y lignanos, que se cree que tienen propiedades antiinflamatorias. Al reducir la inflamación en los intestinos, puede ayudar a mejorar la regularidad de las deposiciones y aliviar el estreñimiento.