Efectos del extracto de Sargassum Thunbergii en el blanqueamiento y antiarrugas de la piel a través de la inhibición de TRP-1 y MMP

Contacto: ali.ma@wecistanche.com

Da-Hye Gam 1, Jae-Hyun Park 1, Ji-Woo Hong 1, Seong-Jin Jeon 1, Jun-Hee Kim 1 y Jin-Woo Kim 1,2*

Resumen: Sargazo thunbergiise ha utilizado tradicionalmente como material comestible y medicinal en los países orientales. sin embargo, elblanqueamiento de la pielyantiarrugasAún no se han investigado los efectos de S. thunbergii. Este estudio se realizó para establecer las condiciones de extracción óptimas para la producción de compuestos bioactivos con actividad antioxidante, así como efectos blanqueadores de la piel y antiarrugas mediante extracción asistida por ultrasonido (UAE) en S. thunbergii. El tiempo de extracción (5,30~18,7 min), la temperatura de extracción (22,4~79,6 ◦C) y la concentración de etanol (0.0~99,5 por ciento), que son las principales variables de los Emiratos Árabes Unidos, se optimizaron utilizando un diseño compuesto central. Las ecuaciones de regresión cuadrática se derivaron en base a datos experimentales y mostraron un alto coeficiente de determinación (R2 > 0.85), lo que demuestra su idoneidad para la predicción. La condición óptima de EAU para maximizar todas las variables dependientes, incluida la actividad depuradora de radicales (RSA), la actividad inhibidora de la tirosinasa (TIA) y la actividad inhibidora de la colagenasa (CIA), se identificó como un tiempo de extracción de 12,0 min, una temperatura de extracción de 65,2 ◦C y etanol del 53,5 por ciento. Bajo estas condiciones, el RSA, TIA y CIA del extracto de S. thunbergii fueron 86.5 por ciento, 88.3 por ciento y 91.4 por ciento, respectivamente. También confirmamos que el extracto de S. thunbergii tenía efectos inhibitorios sobre la expresión del ARNm de la proteína relacionada con la tirosinasa-1, la metaloproteinasa de matriz-1 y la metaloproteinasa de matriz-9, que son los principales genes de la síntesis de melanina y la hidrólisis de colágeno. . Se utilizó cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem para identificar los principales compuestos fenólicos en el extracto de S. thunbergii, y el ácido cafeico se identificó como un pico principal, lo que demuestra que los ingredientes de alto valor agregado conblanqueamiento de la pielyantiarrugasSe pueden producir efectos a partir de S. thunbergii y utilizarse para desarrollar materiales cosméticos.

Palabras clave: S. thunbergii; mejoramiento;blanqueamiento de la piel; antiarrugas; PRT-1; MPM-1; MPM-9

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1. Introducción

La melanogénesis es un proceso fisiológico que conduce a la síntesis de pigmentos de melanina [1]. La melanina es un pigmento negro o marrón secretado por los melanocitos presentes en la capa basal de la epidermis y determina el color de la piel, los ojos y el cabello [2]. Sin embargo, la generación excesiva de pigmentos de melanina puede provocar enfermedades relacionadas con la hiperpigmentación, como malignidad melanomas [3]. La tirosinasa, la enzima principal en la vía de biosíntesis de la telanina, promueve la hidroxilación de L-tirosina a L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) y luego promueve la oxidación de L-DOPA a dopacromo y dopaquinona, que sintetiza melanina a través del proceso de autooxidación por proteínas relacionadas con la tirosinasa (TRP-1 y 2) a través de varias etapas [4–6]. Hasta la fecha, los métodos para inhibir la formación de melanina al impedir las proteínas relacionadas con la tirosinasa se han utilizado ampliamente en la industria cosmética para el desarrollo de agentes blanqueadores de la piel [7,8]. Sin embargo, el ácido kójico, el ácido azelaico y la hidroquinona, utilizados convencionalmenteblanqueamiento de la pielingredientes, se ha informado que inducen alergias, así como también causan toxicidad en la piel y cáncer [9]. Por lo tanto, se considera imperativo producir un agente blanqueador de la piel más seguro y eficaz basado en ingredientes naturales [10].

El colágeno es una proteína de la matriz extracelular (ECM) que protege la piel dándole fuerza y ​​tensión; también ayuda a retrasar el proceso de envejecimiento al prevenir las arrugas y la pérdida de humedad. La ECM se puede descomponer por metaloproteinasas de matriz (MMP) [11]. La MMP-1, comúnmente conocida como colagenasa, descompone parcialmente el colágeno tipo 1 que forma la piel, mientras que la MMP-9, conocida como gelatinasa, despolimeriza adicionalmente el colágeno hidrolizado por la MMP-1 [12]. Además, se ha informado que el estrés oxidativo inducido por especies reactivas de oxígeno (ROS) acelera la síntesis de estas enzimas, lo que conduce a la degradación de la MEC y, en última instancia, a la formación de arrugas [13]. Por lo tanto, es necesario encontrar ingredientes naturales que puedan inhibir la expresión de TRP y MMP y que contengan antioxidantes que puedan eliminar las especies reactivas de oxígeno para prevenir el envejecimiento de la piel al reducir la pigmentación y las arrugas de la piel [14]. Recientemente, como los ingredientes funcionales para los cosméticos se han desarrollado principalmente en plantas terrestres, han comenzado a surgir limitaciones en la exploración de nuevas especies y un suministro estable de ingredientes naturales [15]. En consecuencia, ha aumentado el interés y la demanda de ingredientes naturales derivados de plantas marinas, y se han identificado una variedad de nuevos ingredientes a partir de recursos marinos [16].

Sargazo thunbergiies una especie de macroalga parda que pertenece a la familia gulfweed y es nativa de la costa de Corea y China [17]. Se reconoce como un contaminante marino que causa daño a las algas marinas y piscifactorías al agotar el oxígeno disuelto [18]. Algunos de ellos se usan como medicamentos antihelmínticos en la terapia tradicional o como compost [19]. Sin embargo, se identificó un ingrediente anticancerígeno a partir de su extracto en 1995; desde entonces, ha llamado la atención como una macroalga con un alto potencial para su uso en la fabricación de nuevos compuestos bioactivos [20]. La extracción de compuestos bioactivos usando procesos convencionales, incluyendo la extracción mecánica, la extracción supercrítica, la extracción por microondas y la extracción a ultra alta presión, está asociada con limitaciones tales como la necesidad de usar un exceso de solvente, un bajo rendimiento de extracción y un alto consumo de energía [21]. El desarrollo de nuevos métodos de extracción es uno de los principales desafíos en la innovación tecnológica para asegurar compuestos bioactivos a partir de macroalgas [22]. Entre los procesos de extracción convencionales, la extracción asistida por ultrasonido (UAE) es particularmente atractiva debido a su simplicidad, bajo costo de equipo, alto rendimiento de extracción de diferentes matrices, bajo consumo de energía, menor cantidad de solvente requerido y menor tiempo [23]. Se sabe que los EAU involucran ondas de sonido de alta frecuencia de 20 a 100 kHz [24]. El rendimiento de la extracción se mejora con el uso de ultrasonidos, y esto se atribuye a la ruptura de los tejidos de la planta, la reducción del tamaño de las partículas y el aumento de la transferencia de masa de los extractos al solvente causado por el colapso de las burbujas que se producen por la cavitación acústica repetida [25,26]. . Debido a estas ventajas, los EAU son reconocidos como un proceso económico, renovable y eficiente que se usa ampliamente en la industria alimentaria para extraer ingredientes funcionales de la biomasa terrestre y acuática [27].

Por lo tanto, en este estudio, aplicamos EAU para extraer compuestos bioactivos de S. thunbergii y derivamos las condiciones óptimas de EAU que permiten la máxima extracción de antioxidantes, así comoblanqueamiento de la piely antiarrugas mediante optimización estadística, y se evaluaron varios efectos inhibidores de la expresión génica de TRP-1, MMP-1 y MMP-9 mediante el extracto de S. thunbergii para verificar que la piel -blanqueamiento yantiarrugasefectos de los compuestos bioactivos derivados y confirman la posibilidad de utilizar el extracto de S. thunbergii como ingrediente cosmético funcional.

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2. Resultados y Discusión

2.1. Diseño del Experimento

Ajustar el modelo es crucial para interpretar la precisión del modelo matemático de la metodología de superficie de respuesta (RSM) para predecir la actividad de eliminación de radicales (RSA), la actividad inhibidora de tirosinasa (TIA) y la actividad inhibidora de colagenasa (CIA) deS. thunbergiiextracto. El diseño compuesto central (CCD) de RSM es un método de diseño experimental que analiza estadísticamente la superficie de respuesta producida de forma independiente o por la interacción de dos variables independientes que afectan las respuestas. El CCD tiene la ventaja de estimar efectivamente la curvatura usando el punto central y múltiples puntos axiales para predecir las condiciones óptimas [28–30]. En este estudio, se aplicó CCD para predecir las condiciones óptimas de EAU para maximizar las respuestas, incluidos RSA, TIA y CIA, de extracto de S. thunbergii. Se codificaron los 5 niveles (−, −1, 0, 1, ) y se realizaron 17 corridas experimentales como base en CCD (Tabla 1). Con base en nuestros estudios previos, se seleccionaron 3 variables independientes clave, incluido el tiempo de extracción (5,30~18,7 min), la temperatura de extracción (22,4~79,6 ◦C) y la concentración de etanol (0~99,5 por ciento), para obtener el nivel máximo de variables dependientes [31]. Al desarrollar el modelo de regresión cuadrática, las variables experimentales se codificaron de acuerdo con la siguiente ecuación.

xi {{0}} (Xi − X0)/∆X (1)

donde x es el valor codificado de la variable Xi; X0 es el valor de X en el punto central y ∆X es el valor de cambio de paso.

Los valores experimentales para 17 condiciones con diferencias en el tiempo de extracción, la temperatura de extracción y la concentración de etanol se muestran en la Tabla 2.

2.2. Efectos de las condiciones de los EAU en RSA

Según las 17 condiciones aplicadas a la extracción deS. thunbergiiusando EAU, RSA fue 2.37~89.9 por ciento, con el valor máximo en 12.0 min de tiempo de extracción, 51.0 ◦C de temperatura de extracción y 50.{{11} } porcentaje de concentración de etanol y el valor mínimo a 12.0 min de tiempo de extracción, 51.0 ◦C de temperatura de extracción y 99,5 por ciento de concentración de etanol; esto indica que la concentración de etanol tuvo el mayor efecto sobre RSA (Tabla 2). Como sugirió el software Design-Expert, se seleccionó y ajustó una ecuación de regresión cuadrática para las tres variables independientes y respuestas. En términos de valores codificados, las respuestas pronosticadas para RSA, TIA y CIA podrían expresarse utilizando ecuaciones de regresión cuadrática mediante análisis de regresión múltiple (Tabla 3). Los coeficientes del modelo CCD fueron validados usando análisis de varianza (ANOVA) para las variables de respuesta de los modelos de regresión cuadrática resumidos en la Tabla 4. Si el coeficiente de determinación (R2), que representa el acuerdo entre los valores experimentales y predichos, es cercano a 1, implica bondad de ajuste aceptable [32]. El R2 de la ecuación de regresión cuadrática para predecir la condición óptima de EAU con RSA fue de 0,8554, lo que establece que Mayor o igual al 85,5 por ciento del valor predicho resultante se puede explicar completamente, reconociendo así la idoneidad de la ecuación de regresión cuadrática (Tabla 3).

La importancia de cada variable del modelo se determinó utilizando valores de p; un valor p de<0.05 indicates="" significance="" whereas="" a="" p-value="" of="">0.05 indica insignificancia en el RSA [33]. Los resultados de ANOVA del estudio de optimización indicaron que el modelo era significativo (p=0.0283), que era menor que el nivel de significancia establecido, lo que indica que la significancia se reconoció dentro del 5 por ciento. Por lo tanto, los resultados indican que los modelos podrían predecir eficientemente el RSA, TIA y CIA del extracto de S. thunbergii cuando las variables independientes se encontraban dentro de los rangos representados aquí. Al verificar la importancia de cada variable independiente, encontramos que la concentración de etanol tuvo el mayor efecto sobre RSA (p=0.0025), mientras que los efectos del tiempo de extracción (p=0.7418) y la temperatura (p=0.1622) fueron insignificantes (Tabla 4).

Para evaluar el efecto de cada variable independiente sobre la variable dependiente, expresamos el cambio en RSA según el tiempo de extracción, la temperatura de extracción y la concentración de etanol como un diagrama de perturbación (Figura 1A).

En consecuencia, el valor más alto apareció a los 14,1 min del tiempo de extracción y luego disminuyó; el valor máximo se confirmó a 60,7 ◦C y 46,2 por ciento para la temperatura de extracción y la concentración de etanol, respectivamente. Sin embargo, al visualizar la tasa de cambio en RSA debido a las interacciones entre variables usando la curva de superficie de respuesta tridimensional, el cambio en el tiempo de extracción y la temperatura tuvieron poco efecto en RSA, mientras que la concentración de etanol tuvo un efecto significativo (Figura 2A, B)

Esto fue similar a los resultados del estudio de Kim et al. identificando el efecto de la concentración de solvente en el RSA del extracto de Gynostemma pentaphyllum [34]. RSA tendió a aumentar hasta un máximo y luego disminuyó con la concentración de etanol, mostrando el valor máximo en 48,1 por ciento de concentración de etanol. El cambio de polaridad de la solución de extracción debido a la mezcla de agua destilada y etanol conduce a un aumento del efecto antioxidante de G. extractos de pentaphyllum y S. thunbergii. Además, esto es consistente con los resultados que informan que los compuestos bioactivos solubles en agua producidos por la extracción con agua caliente de las algas muestran una menor actividad antioxidante y que los extractos que usan 50 por ciento de etanol mostraron una mayor actividad antioxidante, lo que sugiere que el uso de un solvente binario (agua y etanol) en la producción de compuestos bioactivos es beneficioso para aumentar el rendimiento de extracción [35,36].

2.3. Efectos de las condiciones de los EAU en TIA

El AIT deS. thunbergiiLos extractos de acuerdo con 17 condiciones de EAU aplicadas al experimento se muestran en la Tabla 2. El valor máximo de TIA del 92,6 % se identificó a los 12,0 min, 79,6 grados y 50.{{13} } por ciento y el valor mínimo de 55,3 por ciento se predijo en 12.0 min, 51.0 grado y 0.{{20}} por ciento de extracción tiempo, temperatura de extracción y concentración de etanol, respectivamente. En consecuencia, se confirmó que la temperatura de extracción y la concentración de etanol tienen un efecto significativo en el TIA. Sobre la base de los resultados experimentales, derivamos una ecuación de regresión cuadrática usando CCD y la usamos para predecir las condiciones óptimas de los EAU (Tabla 3). El R2 fue 0,8591, lo que indica una coincidencia del 85,91 % entre los valores del modelo predicho y los datos experimentales, lo que implica que la ecuación de regresión cuadrática era adecuada para la predicción de TIA. Para las respuestas de RSA, TIA y CIA, los modelos fueron altamente significativos cuando los valores F calculados fueron mayores que el valor F tabulado y los valores de probabilidad fueron bajos (p < 0,001);="" esto="" indica="" que="" los="" términos="" individuales="" en="" cada="" modelo="" de="" respuesta="" fueron="" significativos="" en="" términos="" del="" efecto="" de="" interacción="" [37].="" se="" aplicó="" anova="" para="" evaluar="" estadísticamente="" el="" efecto="" significativo="" de="" la="" ecuación="" de="" regresión="" cuadrática.="" el="" modelo="" experimental="" fue="" significativo="" (p="0.0262)," lo="" que="" indica="" un="" nivel="" de="" significación="" dentro="" del="" 5="" por="" ciento="" (tabla="">

Cuando visualizamos la tasa de cambio de TIA con el cambio de una sola variable al fijar los valores de otras variables, la variación de TIA debido a la concentración de etanol fue la más grande, con un TIA máximo encontrado en una concentración de etanol de 76,8 por ciento (Figura 1B). Las interacciones de las variables independientes se visualizan usando la curva de superficie de respuesta tridimensional cambiando simultáneamente dos variables (Figura 3).

A medida que aumentan la temperatura y el tiempo de extracción, el TIA aumenta inicialmente; sin embargo, el rango de variación no es grande, por lo que reconfirmamos que el efecto interactivo de la temperatura y el tiempo de extracción no es significativo, según lo determinado mediante ANOVA (Figura 3A). Por el contrario, el TIA aumentó y volvió a disminuir con la concentración de etanol, y se predijo que el TIA máximo sería de una concentración de etanol del 75,6 % (Figura 3B). Este resultado es consistente con los del estudio de Park, et al., que mostró que una concentración de etanol del 70 al 80 por ciento conduce a un TIA más alto que el agua en la extracción de compuestos bioactivos del extracto de arroz silvestre [38]. Ese estudio informó que la concentración de etanol era una variable principal en TIA y tiende a variar en proporción con la concentración de etanol.

2.4. Efectos de las condiciones de los EAU en la CIA

Cuando medimos la CIA en cada una de las 17 condiciones, encontramos que el valor máximo de la CIA fue del 92,3 % a los 16,0 min, 63,0 grados y 80.{{ 12}} por ciento y la CIA mínima fue de 48,1 por ciento a 12.0 min, 51.0 grados y 0.0 por ciento del tiempo de extracción, temperatura de extracción, y concentración de etanol, respectivamente (Cuadro 2). La ecuación de regresión cuadrática generada según el tiempo de extracción, la temperatura y la concentración de etanol tuvo un R2 de 0,9237, lo que implica que la variación de la muestra de 92,37 por ciento se atribuyó a las variables independientes, y solo el 7,63 por ciento de las variaciones totales no pudieron explicarse por la modelo (Cuadro 3). Esto indica un buen grado de correlación entre los valores predichos y experimentales de la CIA y reconoce su idoneidad para predecir el modelo experimental [39]. ANOVA demostró significancia estadística (p=0.0037) por debajo de un nivel de significancia del 1 por ciento y confirmó que la temperatura de extracción (p=0.0030) y la concentración de etanol (p=0.0006) entre los términos lineales se encontraron variables independientes que afectaron significativamente la CIA (Cuadro 4).

Para evaluar los efectos de cada variable independiente en la CIA, comparamos la CIA con el cambio en una variable usando un diagrama de perturbación (Figura 1C). A medida que aumentaba la variable independiente, la CIA inicialmente aumentó hasta el valor máximo y se encontró que la concentración de etanol era la más influyente. La curva de superficie de respuesta tridimensional representó el cambio de CIA debido a los efectos interactivos de las variables independientes, que tendieron a aumentar y disminuir con el tiempo de extracción y la concentración de etanol. La CIA aumentó con el aumento del tiempo de extracción y la concentración de etanol, mostrando la CIA máxima a los 12,1 min de tiempo de extracción y una concentración de etanol del 73,6 por ciento. Los cambios en la CIA con la temperatura de extracción y la concentración de etanol a un tiempo de extracción constante también tendieron a ser los mismos; sin embargo, se confirmó que las variaciones en CIA con la concentración de etanol eran más significativas (Figura 4B).

El valor máximo de CIA predicho por CCD fue 93,8 por ciento con un tiempo de extracción de 14,5 min, temperatura de extracción de 65,1 ◦C y una concentración de etanol de 69,3 por ciento. Esto fue más del doble que el 39,4 por ciento y el 40,3 por ciento de la CIA para los extractos de agua caliente de té verde y té blanco encontrados en un estudio anterior [40]. En conclusión, elS. thunbergiiEl extracto se consideró capaz de utilizarse como un ingrediente cosmético funcional para reducir las arrugas, ya que restringe la actividad de la colagenasa.

2.5. Optimización del Proceso EAU

Identificar la condición óptima de los EAU para la extracción deblanqueamiento de la piely compuestos bioactivos antiarrugas del extracto de S. thunbergii, obtuvimos un punto óptimo para maximizar las variables dependientes al superponer las superficies de respuesta individuales de RSA, TIA y CIA (Figura 5).

Cuando el rango de variables independientes se limitó a un tiempo de extracción de 5,30~18,7 min, una temperatura de extracción de 22,4~79,6 ◦C y una concentración de etanol de 0~99,5 por ciento, se predijo la condición óptima de los EAU tiempo de extracción de 12,0 min, temperatura de extracción de 65,2 ◦C y concentración de etanol del 53,5 por ciento. La condición óptima de EAU se derivó en base al criterio de minimizar el tiempo de extracción porque un tiempo de proceso corto es beneficioso para reducir los costos del proceso. Bajo la condición EAU óptima derivada, se predijeron 86.5 por ciento, 88.3 por ciento y 91.4 por ciento de RSA, TIA y CIA, respectivamente. En estudios previos, Yuan et al. reportaron que las condiciones óptimas para la extracción de compuestos bioactivos de S. thunbergii fueron las siguientes: una relación de líquido a sólido de 120 mL/g, un tiempo de extracción de 210 min y una temperatura de extracción de 97 ◦C [41]. Mientras Yuan et al. optimizó las condiciones de extracción con agua caliente para la extracción de compuestos bioactivos, en el presente estudio se optimizaron las condiciones de los EAU para la extracción de compuestos bioactivos. Por lo tanto, se demostró que las condiciones de los EAU con un tiempo de extracción corto y una temperatura baja son un proceso de extracción efectivo para compuestos bioactivos en comparación con los procesos anteriores de extracción con agua caliente.

Para verificar los resultados, se realizó un experimento de confirmación con tres repeticiones en las condiciones óptimas previstas por el modelo CCD. Cuando los valores experimentales de RSA, TIA y CIA se evaluaron en condiciones óptimas, fueron 88,9 por ciento ± 3,11 por ciento, 85,1 por ciento ± 2,76 por ciento y 89,7 por ciento ± 4,0 9 por ciento, respectivamente, y mostraron un fuerte concordancia con los valores del modelo predictivo (p > 0.05). Por lo tanto, los valores experimentales estaban en buen acuerdo con los valores predichos, lo que prueba la confiabilidad de los resultados de optimización de UAE.

2.6. Expresión de ARNm de TRP-1, MMP-1 y MMP-9

TRP-1 funciona como 5,6-dihidroxiindol-2-ácido carboxílico oxidasa, que se sabe que es la causa principal de la pigmentación de la piel que actúa mediante la estimulación de la tirosinasa y la síntesis de eumelanina en las células epiteliales [42]. Por el contrario, MMP-1 y MMP-9 descomponen el colágeno tipo 1, que constituye el 90 % de la capa dérmica, lo que provoca la degradación del colágeno, la pérdida de elasticidad y el envejecimiento de la piel [43].

En este estudio,S. thunbergiiEl extracto se produjo utilizando las condiciones óptimas de los EAU establecidas a través de una optimización basada en estadísticas, y el extracto se probó en líneas celulares B{{0}}F0 para evaluarblanqueamiento de la pielyantiarrugaspropiedades comparando los niveles de expresión de ARN de TRP{{0}}, MMP-1 y MMP-9. Se encontró que el nivel de expresión de TRP-1, un gen importante relacionado con la síntesis de melanina, depende de la concentración en S. thunbergii y disminuyó significativamente después del tratamiento con 1 y 2 mg/mL de extracto en comparación con el grupo control (p < 0.05)="" (figura="">

También encontramos que las expresiones de MMP{{{{10}}}} y MMP-9 disminuyeron proporcionalmente con la concentración de extracto de S. thunbergii (Figura 6B, C). En particular, los niveles de expresión de MMP-1 y MMP-9 se inhibieron en un 58,6 % y un 78,8 %, respectivamente, en el grupo tratado con 2 mg/mL de extracto de S. thunbergii en comparación con los grupos de control (p < 0,05).="" a="" partir="" de="" los="" resultados="" anteriores,="" se="" confirmó="" que="" el="" extracto="" de="" s.="" thunbergii="" producido="" en="" condiciones="" óptimas="" de="" eau="" puede="" inhibir="" eficazmente="" las="" expresiones="" de="" arnm="" de="" trp-1,="" mmp-1="" y="" mmp-9="" en="" b16-="" líneas="" celulares="" f0,="" lo="" que="" inhibe="" la="" producción="" de="" melanina="" y="" la="" descomposición="" del="">

2.7. Identificación de ácido cafeico en extracto de S. thunbergii

En un experimento anterior, las condiciones de los EAU para maximizar el antioxidante, el blanqueamiento de la piel yantiarrugasse optimizaron los efectos del extracto de S. thunbergii; sin embargo, se necesitaban más estudios para explorar los ingredientes bioactivos en el extracto. Por lo tanto, los compuestos fenólicos deS. thunbergiiextracto se identificaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), ya que esta tecnología permite la identificación precisa de compuestos fenólicos con caracterización estructural y la detección de pequeñas moléculas en fuentes naturales. La identificación de los picos se basó en el tiempo de retención (RT), los iones precursores y los iones de fragmentos relacionados de los estándares. En el sistema LC-MS/MS, el ácido cafeico mostró un pico a los 1,95 min de TA (Figura 7).

En el modo de iones negativos, el ion m/z 179,10, que mostró uno de los dos picos de iones en el espectro de masas, corresponde a la fórmula molecular del ácido cafeico y se separó un fragmento de ion de m/z 135,56. Generalmente, después de la disociación inducida por colisión, los compuestos fenólicos producen un fragmento de ión caracterizado por la pérdida de CO2 (44 Da) del grupo ácido carboxílico. Debido a esta pérdida, la escisión subsiguiente del 44-Da CO2 del ion am/z 179,10 dio el ion am/z 135,56. El ácido cafeico es un compuesto fenólico C6-C3 producido a partir de fenilalanina o tirosina por las plantas a través de la vía del metabolismo secundario del shikimato y es un representante de la clase del ácido cinámico (o fenilpropanoide). Entra en la dieta humana a través de varias verduras y frutas [44]. En los últimos años, numerosos estudios han demostrado que el consumo de ácido cafeico tiene numerosos beneficios para la salud debido a las propiedades antioxidantes que ayudan a prevenir diversas enfermedades asociadas al estrés oxidativo [45]. Por lo tanto, este estudio sobre los compuestos fenólicos es muy útil y puede desempeñar un papel importante en el proceso de control de calidad y la exploración futura de S. thunbergii, un ingrediente conblanqueamiento de la pielyantiarrugaspropiedades.

3. Materiales y Métodos

3.1. Materiales y Reactivos

S. thunbergiirecolectado en la costa sur de la isla de Jeju, Corea, en octubre de 2019 fue comprado en Para Jeju (Jeju, Corea). Antes del experimento, S. thunbergii se pulverizó por debajo de 00,42 mm con un molinillo (HMF-3000S, Hanil Co., Wonju, Corea) y se almacenó en un refrigerador a -5 °C. El etanol para la extracción con disolvente se adquirió de SamchunChemical Co. (95,0 por ciento v/v, Pyungtaek, Corea). El ácido ascórbico (vitamina C), la arbutina y el ácido kójico utilizados como estándares para las pruebas de control se adquirieron de Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO, EE. UU.). Todos los demás productos químicos utilizados en este experimento fueron de grado analítico.

3.2. Proceso de los EAU

El polvo seco de la muestra (1 g) se colocó en un recipiente a presión (XF100, AntonPaar Co., Ltd., Graz, Austria) con 10 mL del solvente y se mezcló usando un mezclador de vórtice (VM-10, Daihan sci. Co., Wonju, Korea) durante 1 min. Estas muestras se extrajeron en 17 condiciones EAU individuales derivadas de CCD con un tiempo de extracción de 5,30~18,7 min, una temperatura de extracción de 22,4~79,6 ◦C y una concentración de etanol de 0,0~99,5 por ciento. UAE se realizó utilizando un dispositivo de ultrasonido (SD-D250H, Sungdong Co., Seúl, Corea) con una potencia eléctrica de 200 W y una frecuencia de 40 kHz equipado con un temporizador digital y un controlador de temperatura. Después de la extracción, el sobrenadante se separó a 10, 000 rpm durante 10 min usando una centrífuga (1236R, Labogene Co., Daejeon, Korea). Luego, la solución se filtró a través de un filtro de disco de acetato de celulosa con una porosidad de 0,45 µm y se usó para los análisis RSA, TIA y CIA (Figura 8).

3.3. Diseño de experimentos

Se usó el software Design-Expert (Ver. 8.0, Stat-Ease, Minneapolis, MN, EE. UU.) para maximizar la extracción de compuestos bioactivos deS. thunbergiia través de la optimización de las condiciones de los EAU utilizando CCD. Como variables independientes, se seleccionaron variables clave como el tiempo de extracción (X1), la temperatura de extracción (X2) y la concentración de etanol (X3), y se codificaron en 5 (−1,68, −1, 0, 1, 1,68) niveles , como se muestra en la Tabla 1. RSA, TIA y CIA se establecieron como variables dependientes afectadas por las principales variables independientes. Los valores experimentales se obtuvieron en 17 condiciones generadas por el CCD, y la correlación de cada variable independiente y dependiente se cuantificó mediante una ecuación de regresión cuadrática. [46]. Se utilizó la siguiente ecuación de regresión cuadrática para calcular los valores de las variables dependientes de acuerdo con los cambios en las variables independientes:

Y = β0 + k ∑ i = 1 βiXi + k ∑ i = 1 βiiX 2 i + k ∑ i>1 ijXiXj(2)

donde Y representa las variables dependientes (RSA, TIA, CIA), 0 es un coeficiente constante y k es una variable de prueba. i, ii e ij son los coeficientes de regresión para los términos lineal, cuadrático y de interacción, respectivamente.

Para evaluar el modelo predicho en la variable independiente, se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de confianza del 95 por ciento para evaluar el efecto de cada variable, incluida la temperatura de extracción, el tiempo y la concentración de etanol. Además, se utilizó el coeficiente de regresión (R2), el valor p del modelo de regresión, para determinar la aptitud del modelo de regresión [47].

3.4. Ensayo de actividad de captación de radicales (RSA)

El efecto antioxidante deS. thunbergiiEl extracto se evaluó en función de su actividad de eliminación de radicales libres de 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH, Sigma-Aldrich) utilizando un ensayo de DPPH modificado [48]. La solución madre se preparó disolviendo 0.1 M DPPH con metanol y luego se almacenó a temperatura ambiente. La solución de DPPH diluida con metanol se preparó para obtener una absorbancia de 1.0 ± 0.02 a 517 nm usando un espectrofotómetro UV-vis (Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea) . Se mezcló una alícuota de 1,25 ml de solución de DPPH con 0,25 ml de extracto diluido de S. thunbergii (50–500 mg/ml) y se dejó reposar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min. El cambio de absorbancia se controló a 517 nm y el RSA se calculó utilizando la siguiente fórmula:

RSA (porcentaje)={1 −Abs (muestra) / Abs (control)} × 100 (3)

donde Abs (control) es la absorbancia del control y Abs (muestra) es la absorbancia del extracto. Se utilizó la misma concentración de ácido ascórbico (50–500 mg/mL) como control positivo.

3.5. Ensayo de actividad inhibidora de tirosinasa (TIA)

El TIA se midió de acuerdo con el método informado por Yagi [49]. La mezcla de reacción contenía 0,4 ml de tampón de fosfato de sodio (67 mM, pH 6,8), 0,2 ml de 10 mM3,{{10}} dihidroxifenilalanina (L-DOPA, Sigma-Aldrich), 0,2 mL de tirosinasa de hongo (125 unidades/mL, Sigma-Aldrich) y 0,2 mL de solución de extracto. La reacción se llevó a cabo a 25 ◦C durante 30 min. Después de la reacción, se midió la absorbancia a 475 nm y los resultados se compararon con el control. El TIA se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:

TIA (porcentaje)={1 −Abs (muestra) / Abs (control)}× 100 (4)

donde Abs (control) es la absorbancia del control y Abs (muestra) es la absorbancia del extracto.

la cistanche reduce la actividad de la tirosinasa

3.6. Ensayo de actividad inhibidora de colamasa (CIA)

El ensayo CIA se realizó de acuerdo con el método informado por Wünsch y Heindrich [50]. La colagenasa (0,2 mg/mL, Sigma-Aldrich) se disolvió en 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). El sustrato, 4-fenilazobenciloxicarbonil-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (0,4 mg/ml, Sigma-Aldrich), se disolvió en 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) que contiene CaCl2 4 mM. La mezcla de reacción para evaluar la hidrólisis del colágeno contenía colagenasa (75 µl), muestra (50 µl) y soluciones de sustrato (125 µl). Para el grupo de control, se agregaron 50 µL de agua destilada a la mezcla de reacción en lugar del extracto. La mezcla se dejó incubar a 37 ◦C por 30 min y se le agregaron 0.25 mL de ácido cítrico 25 mM para la terminación de las reacciones enzimáticas. Después de mezclar con acetato de etilo, se separó el sobrenadante y se midió la absorbancia a 320 nm. El porcentaje de inhibición se calculó según la siguiente fórmula:

CIA (porcentaje) ={1 −Abs (muestra)/Abs (control)}× 100 (5)

donde Abs (control) es la absorbancia del control y Abs (muestra) es la absorbancia del extracto.

3.7. Validación del Modelo

Las condiciones optimizadas para EAU (tiempo de extracción, temperatura de extracción y concentración de etanol) fueron validadas con la evaluación in vitro de la actividad antioxidante,blanqueamiento de la piel, y efectos antiarrugas (RSA, TIA y CIA) según los valores obtenidos de CCD. Todas las respuestas se determinaron nuevamente bajo la condición optimizada de los EAU. Los valores experimentales se compararon con los predichos por el modelo para evaluar su validez. El análisis LC-MS/MS se realizó en los extractos generados en condiciones óptimas para encontrar los componentes principales en elS. thunbergiiextracto.

3.8. Cultivo de células

Se compraron células de melanoma B{{0}}F0 de Korean Cell Line Bank Co. (KCLB, Seúl, Corea) y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRL Co., Ltd., Gaithersburg , MD, EE. UU.) con 10 % de suero fetal bovino y 1 % de penicilina (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, EE. UU.). Las células se incubaron a 37 ◦C con 5 por ciento de CO2 (MCO-5AC, Sanyo Co., Ltd., Tokio, Japón) y se cultivaron como una monocapa en matraces de cultivo de 25 cm2. Cuando una línea celular alcanzó aproximadamente el 80 por ciento de confluencia, se realizó el subcultivo mediante el tratamiento con tripsina-EDTA para obtener células individuales para asegurar el crecimiento y la salud adecuados de las células.

3.9. Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR)

Para realizar la RT-PCR, se sembraron 1.0 × 106 células por pocillo de una 24-placa de pocillos. El ARN total se extrajo de las células con un kit de extracción de ARN universal AccuPrep (BioneerCo., Daejeon, Corea). La transcripción inversa se realizó con 0,5 µg de ARN total para la síntesis de ADNc utilizando la mezcla maestra de platino de síntesis de ADNc de amfiRivert (GenDEPOTCo., TX, EE. UU.). El ADNc se amplificó con cada cebador, como TRP-1, MMP-1, MMP-9 y actina (Tabla 5). La PCR se realizó en un volumen de 20 µL que contenía 1 µL de ADNc, 10 µL de premezcla (Genet bio, Daejeon, Corea) y 9 µL de dietilpirocarbonato (DEPC). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94 ◦C durante 5 min, seguido de 25 ciclos a 95 ◦C durante 5 s, 60 ◦C durante 31 s (para TRP-1) o 55 ◦C durante 30 s (para MMP{ {26}}) o 59 ◦C por 30 s (para MMP-9), y 72 ◦C por 30 s de extensión. Cada producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 por ciento y se visualizó utilizando el sistema Gel Doc TM XR plus y el software de cantidad uno (Bio-Rad Co., Hercules, CA, EE. UU.). La -actina como gen doméstico se utilizó para normalizar los niveles de expresión de TRP-1, MMP-1 y MMP-9.

3.10. Análisis LC-MS/MS

La separación cromatográfica del extracto de S. thunbergii se realizó utilizando un sistema de HPLC Finni gan Surveyor Plus (Thermo Electron Corporation, San José). La separación se logró usando una columna ROC C18 con una longitud de columna de 150 mm, un diámetro interno de 3 mm y un tamaño de partícula de 3 µm (RESTEK Co., Bellefonte, PA, EE. UU.) mientras se usaba una solución de gradiente de 0.1 por ciento de ácido fórmico en agua (fase móvil A) y 0.1 por ciento de ácido fórmico en acetonitrilo (fase móvil B) a una velocidad de flujo de 0.2 mL/min, como sigue: 5 por ciento a 100 % de fase móvil B durante 11 min, 100 % a 5 % de fase móvil B durante 4 min, 37 % de fase móvil B durante 2 min, 37 % a 10 % de fase móvil B durante 0,1 min y 10 % de fase móvil B durante 2,4 min . El volumen de inyección fue de 10 µL y la columna se mantuvo a 30 ◦C. Los experimentos de espectrometría de masas se realizaron utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra EMR (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, EE. UU.). El extracto de S. thunbergii se analizó mediante ionización por electropulverización de iones negativos utilizando ionización por electropulverización (ESI), utilizando específicamente el modo de pulverización de iones turbo. Los ajustes de la fuente ESI para la ionización de la extracción de S. thunbergii en el modo negativo fueron los siguientes: temperatura del gas, 270 ◦C; flujo de gas, 19 L/min; temperatura del gas envolvente, 400 ◦C; flujo de gas envolvente, 10 l/min; voltaje capilar, 3000 V; voltaje de la boquilla, 1000 V. Los espectros de masas se registraron en el modo de iones negativos entre 100 y 500 m/z usando nitrógeno como gas de colisión. El análisis de los componentes principales enS. thunbergiiEl extracto se realizó comparando los iones moleculares obtenidos y los patrones de fragmentación de los resultados de LC-MS/MS con datos de la literatura y con una biblioteca de masas para los compuestos estándar.

4. Conclusiones

Este estudio propuso condiciones óptimas para el proceso de los EAU que pueden maximizar la producción de antioxidantes,blanqueamiento de la piel, yantiarrugasefectos para la producción de compuestos bioactivos de valor agregado de S. thunbergii, que están muy extendidos en la costa subtropical del sudeste asiático, causando contaminación marina y perturbaciones ecológicas. La variable más influyente al realizar la optimización de los EAU fue la concentración de etanol, lo que confirmó que el uso y la determinación de la concentración de solventes binarios que consistían en agua y etanol era una consideración importante en los EAU. Al superponer cada superficie de respuesta para la optimización simultánea de RSA, TIA y CIA, se predijo un tiempo de extracción de 12,0 min, una temperatura de extracción de 65,2 ◦C y una concentración de etanol del 53,5 %, en cuyas condiciones RSA Se identificaron valores de 86,5 por ciento, valores de TIA de 88,3 por ciento y valores de CIA de 91,4 por ciento.

Cuando se evaluaron los efectos de TRP-1, MMP-1 y MMP-9 en la expresión a nivel de ARNm usando extracto de S. thunbergii producido en condiciones óptimas de los EAU, se confirmó que el extracto de S. thunbergii puede disminuir los niveles de ARNm de TRP-1, MMP-1 y MMP-9 y, por lo tanto, prevenir la producción de melanina y la descomposición del colágeno de la piel.

De este modo,S. thunbergiiSe espera que el extracto se utilice ampliamente como una nueva fuente de biomasa marina en la producción de ingredientes funcionales para cosméticos, alimentos y medicamentos. Además, se cree que el proceso de extracción de compuestos bioactivos utilizando EAU proporciona datos fundamentales sobre el desarrollo del proceso y contribuye al determinación de las condiciones óptimas de extracción en la producción de nuevos ingredientes funcionales a partir de S.thunbergii y otras macroalgas.