Eficacia y mecanismos de un compuesto de fibra de Angelica Sinensis Cistanche para aliviar el estreñimiento

Abstracto:ConstipaciónEs una dolencia frecuente que podría afectar significativamente la calidad de vida de las personas y aumentar algunos riesgos de enfermedades asociadas. En este estudio, se estableció un modelo de ratón con estreñimiento crónico utilizando clorhidrato de loperamida. A los ratones se les administró por sonda un compuesto de fibra de Cistanche de Angelica sinensis, compuesto por Dang Gui [Angelica sinensis (Oliv.) Diels],Rou Cong Rong (Cistanche deserticolaY.C.Ma), fibra de trigo y xilano de bajo peso molecular en dosis altas (3,6 g·kg-1, 30veces la dosis humana recomendada) y dosis bajas (0,6 g·kg{{8} }, 5 veces la dosis humana recomendada) durante 14 días. El estudio evaluó la eficacia terapéutica del compuesto mediante la observación de la morfología fecal, la medición del contenido de agua y la realización de experimentos de motilidad del intestino delgado. Además, se realizaron ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) para evaluar los niveles séricos de hormonas gastrointestinales, incluidas la motilina (MTL), la gastrina (GAS), los factores inflamatorios interleucina-1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral. - (TNF- ). Se empleó un examen histopatológico con tinción H&E para evaluar el daño del tejido colónico. Además, se realizaron experimentos de inmunohistoquímica y transferencia Western para examinar los niveles de expresión de acuaporina -3 (AQP3) y c-Kit en el colon. Los resultados indicaron que el compuesto de fibra Cistanche de Angelica sinensis podría mejorar la morfología fecal, aumentar el contenido de agua fecal y mejorar las tasas de tránsito del intestino delgado en ratones. Además, hubo una elevación significativa en los niveles séricos de hormonas gastrointestinales y una reducción notable en los niveles de factores inflamatorios. La mejora en el daño histopatológico del colon estuvo acompañada de una marcada disminución en la expresión de la proteína del canal de agua del colon AQP3 y un aumento significativo en la expresión de c-Kit. Estos resultados sugirieron colectivamente la presencia de una relación dosis-respuesta. Estos hallazgos indican que el compuesto de fibra Angelicasinensis Cistanche alivia eficazmente el estreñimiento en ratones. Su acción está asociada con la regulación de la expresión de la proteína del canal de agua del colon AQP3 yc-Kit, junto con la modulación de los factores inflamatorios séricos y las hormonas gastrointestinales. Este experimento fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentos Animales de la Universidad de Jinan.

Palabras clave:constipación; lubricación intestinal y alivio del estreñimiento; comida funcional; colon; medicina tradicional china

¿CUÁNTO TIEMPO TARDA EN FUNCIONAR CISTANCHE?

Constipaciónes unenfermedad gastrointestinal común. The global prevalence of constipation in the elderly (>60 años) es del 18,9%[1], y la prevalencia suele ser mayor en las mujeres[2]. Se caracteriza por dificultad para defecar y estreñimiento frecuente. reducción y endurecimiento de las heces, etc., provocando malestar físico y disfunción gastrointestinal, e incluso induciendo o agravando enfermedades gastrointestinales, enfermedades cardiovasculares [3], etc., afectando gravemente la calidad de vida. Las recetas de la medicina tradicional china se utilizan ampliamente para mejorar el estreñimiento y tienen efectos clínicos buenos y definitivos [4,5]. El compuesto de fibra de Angelica y Cistanche deserticola utilizado en este estudio se prepara a partir de Cistanche deserticola, Angelica sinensis, fibra de trigo y xilooligosacáridos. Cistanche deserticola y Angelica sinensis son dos medicinas tradicionales chinas comúnmente utilizadas como laxantes, que tienen el efecto de regular la función intestinal y mejorar el estreñimiento. [6-9], dos medicinas tradicionales chinas tienen el mismo origen que la medicina y la comida en mi país. Su uso combinado puede lograr el efecto de reponer el qi y la sangre y armonizar el yin y el yang. La fibra de trigo es rica en fibra dietética soluble e insoluble, que puede promover la peristalsis intestinal y la defecación y, a menudo, se utiliza como fármaco auxiliar para tratar el estreñimiento; El xilooligosacárido es un oligosacárido funcional que puede regular la flora intestinal, estimulando así la peristalsis intestinal. , aumentar la humedad de las heces [10], combinar los cuatro sabores y tratar la causa fundamental de la enfermedad. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia de este compuesto de fibra de angélica y cistanche deserticola en ratones estreñidos y explorar su posible mecanismo de acción.

Materiales y métodos

Animales experimentales: se adquirieron 40 ratones Kunming machos de grado libre de patógenos específicos (SPF), de 4 a 5 semanas de edad, de Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., número de licencia SCXK (Guangdong) 2021-0011, The La temperatura ambiente es de 22 ± 2 grados, la humedad es de 50% ± 10% y el ciclo de día y noche es de 12 h/12 ​​h. Los protocolos y procedimientos experimentales cumplieron con los principios éticos del uso y cuidado de animales y fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Jinan.

La sustancia de prueba: la preparación del compuesto de fibra de Angelica sinensis y Cistanche deserticola se elabora a partir de Angelica Sinensis y Cistanche deserticola, que se extraen con agua, se concentran, se secan y se trituran para obtener una pasta seca en polvo (el rendimiento de la pasta es del 52,95%). El polvo de pasta seca se mezcla con fibra de trigo y xilooligosacárido para su uso posterior. Angelica sinensis (número de lote 230404CP108) y Cistanche deserticola (número de lote 230303CP109) se adquirieron de Hebei Wanxiu Pharmaceutical Co., Ltd. y se probaron para cumplir con la edición de 2020 de la Farmacopea China. Los xilooligosacáridos se compraron de Shandong Bailong Chuangyuan Biotechnology Co., Ltd. El número de lote es 20210829026 y la inspección cumple con GB/T35545; la fibra de trigo proviene de J. Rettenmaier & Söhne GmbH + Co KG, y el número de lote es 07501230126. Basado en un adulto de 60 kg, la dosis recomendada de compuesto de fibra de angélica y cistanche para humanos es 7,118 g·d-1 , de los cuales la dosis de fibra de trigo es de 3,5g·d-1. La compatibilidad de este compuesto es angélica: cistanche: fibra de trigo: xilooligosacáridos=2:2:3:2 (la dosificación de los trozos de decocción se basa en el fármaco crudo). Tome 30 veces la dosis humana recomendada como grupo de dosis alta y 5 veces la dosis humana recomendada como grupo de dosis baja, respectivamente 3,6 y 0,6 g·kg-1·d-1. Preparar una suspensión con agua pura, mezclar bien y reservar.

Medicamentos y reactivos Clorhidrato de loperamida (loperamida, LOP), especificaciones: Cada tableta contiene clorhidrato de loperamida

Amina 2 mg, 12 cápsulas/caja, número de lote del producto: MIJ3102, adquirido de Xi'an Janssen Pharmaceutical Co., Ltd.; Tabletas de citrato de mosaprida (Quali), especificaciones: cada tableta contiene 5 mg de citrato de mosaprida, 24 tabletas/caja, número de lote del producto: 25220603, adquirido en Lunan Beite Pharmaceutical Co., Ltd.; polvo de carbón activado, especificación: polvo marrón de malla 200, número de lote A805337, adquirido de Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; goma arábiga, especificación: polvo, número de lote A108975, comprada a Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

Etanol absoluto (Fábrica de reactivos químicos Tianjin Damao, 64-17-5); persulfato de amonio (Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., A6295-500g); Tris-Base (FD2010), tampón de carga 5× (FD002), anticuerpo de actina (FD0060), anticuerpo secundario de cabra anti-conejo (FDR007), anticuerpo secundario de cabra anti-ratón (FDM007) y kit de desarrollo de color ECL (FD8020) todos fueron adquiridos de Hangzhou Fude Biotechnology Co., Ltd.; tampón de lisis RIPA (Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd., P0013B); 4% de paraformaldehído (Biosharp Company, BL539A); kit de inmunohistoquímica (Jiangsu KGI Biotechnology Co., Ltd., KGOS60); kit de cuantificación de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, SLZ60212); motilina (MTL), gastrina (GAS) y factores inflamatorios interleucina-1 (IL-1), factor de necrosis tumoral (factor de necrosis tumoral, TNF-), kit ELISA (Shanghai Enzyme Biotechnology Co., Ltd ., YJ201829, YJ037432, YJ002095, YJ301814); anticuerpo acuaporina 3 (acuaporina 3, AQP3) (Affinity Company, AF5222); c-Kit de anticuerpo (Cell Signaling Technology, 3074S).

Instrumento: Medidor de agua súper pura (Millipore Company, EE. UU., Milli Q); Balanza electrónica (Sartorius, Alemania)

La empresa, BS224S); Balanza analítica electrónica (Shanghai Benpu Instrument Technology Co., Ltd., FA2204N); Centrífuga refrigerada de alta velocidad (Sigma Company, Alemania, 3K15); Lector de microplacas (Thermo Company, EE. UU., Multiskan Mk 3); Microtomo de parafina (Leica, Alemania) Company, RM2255); Baño metálico a temperatura constante (Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd., TU-100C); Molinillo rápido de muestras completamente automático (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd., JXFSTPRP-24); Instrumento de electroforesis (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., DYY-6C); microscopio de barrido (Precipoint Company, Precipoint M8); sistema de imágenes de quimioluminiscencia (Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd., Tanon 5200).

Agrupación y establecimiento del modelo: se criaron adaptativamente 40 ratones durante 5 días y luego se dividieron aleatoriamente en grupos de control negativo.

(control), grupo modelo (LOP), grupos de dosis altas y bajas compuestas (LOP+PF-H, OP+PF-L), grupo de control positivo (citrato de mosaprida, LOP+MOS). De 9 a 10 am todos los días, todos los grupos, excepto el grupo de control negativo, recibieron 10 mg·kg-1 de clorhidrato de loperamida mediante sonda para establecer un modelo de estreñimiento en ratones, y el grupo de control negativo recibió un cantidad igual de agua pura por sonda. De 14 a 15 horas, los grupos de dosis alta y baja del compuesto recibieron el compuesto 3,6 y 0,6 g·kg-1 respectivamente, y el grupo de control positivo recibió citrato de mosaprida (MOS) 5 mg·kg{{ 19}}.

, el grupo de control negativo y el grupo de control modelo recibieron cantidades iguales de agua pura mediante alimentación forzada durante 14 días consecutivos.

Se observaron y registraron el estado y las características de las heces de los ratones durante el período de intervención farmacológica. Se registraron el estado básico y las heces de los ratones de cada grupo.

Personajes, pesar 3 veces por semana y ajustar dosis. Los días 3, 7, 10 y 14 después de la administración, se recogieron de 3 a 4 gránulos de heces frescas de cada ratón, se pesaron inmediatamente y se registraron como peso húmedo, se secaron en un horno y se registraron como peso seco y la humedad fecal. Se calculó el contenido. Calcule el contenido de humedad fecal (%)=(peso húmedo - peso seco)/peso húmedo × 100%.

La determinación de la función de propulsión del intestino delgado se llevó a cabo de acuerdo con los métodos experimentales requeridos por la literatura de referencia [11] y "Métodos para probar y evaluar funciones funcionales de alimentos saludables (2023 edición)". Después de la última dosis, los ratones de cada grupo permanecieron en ayunas y sin agua durante 16 horas. Grupo modelo, fórmula del compuesto A los grupos de dosis alta y baja y al grupo de control positivo se les administró una suspensión de clorhidrato de loperamida (10 mg·kg-1) mediante alimentación forzada, y al grupo de control negativo se le administró una cantidad igual de agua pura por sonda. 0.5 h más tarde, los grupos de dosis alta y baja del compuesto y el grupo de control positivo recibieron tinta (que contenía 5%) que contenía las correspondientes dosis de muestra de prueba (3,6 g·kg-1, 0,6 g·kg-1, 5 mg·kg-1) respectivamente. (polvo de carbón activado, 10% de goma arábiga) y se administraron cantidades iguales de tinta a los grupos negativo y modelo. Los animales se sacrificaron inmediatamente después de 0,5 h mediante dislocación cervical y se midieron la "longitud total del intestino delgado" y la "longitud de avance de la tinta". Calcule la tasa de avance de la tinta=longitud de avance de la tinta (cm)/longitud total del intestino delgado (cm) × 100%.

Para detectar los niveles de MTL, GAS, TNF- e IL-1 en el suero, se tomó sangre de los globos oculares del ratón, se centrifugó a 4 grados, 3 500 r·min-1 durante 10 minutos, se tomó el suero superior y se determinaron el MTL y GAS en el suero de ratón según el kit ELISA. y niveles de TNF-, IL-1.

H&E detecta cambios patológicos en el tejido del colon. El colon de los ratones se lava con solución salina normal y se incuba en paraformaldehído al 4%.

Se fijaron en aldehído, se incluyeron de forma rutinaria después de 24 horas, se seccionaron, se hornearon y se tiñeron con H&E, y los cambios patológicos del tejido del colon se observaron bajo un microscopio óptico.

Se utilizó el método inmunohistoquímico para detectar la expresión de AQP3 y c-Kit en tejido de colon. Se recogieron tejidos de colon de ratones de cada grupo.

Secciones de parafina, desparafinado, hidratación, recuperación de antígenos, bloqueo de catalasa endógena, bloqueo con suero de cabra al 2%, adición de anticuerpos AQP3 y c-Kit respectivamente e incubación durante la noche a 4 grados (solución salina tamponada con fosfato, PBS) durante 5 minutos Contratinción con hematoxilina, gradiente deshidratación de etanol, transparencia de xileno, sellado de goma neutra, escaneo bajo un microscopio de barrido y uso del software Image J para analizar los resultados.

Se utilizó el método de transferencia Western para detectar la expresión de AQP3 y c-Kit en tejido de colon. Tome 10 mg de tejido de colon de ratón congelado y colóquelo en un tubo de centrífuga con 150 l de tampón de lisis RIPA que contenga 1% de inhibidor de proteasa. Utilice un molinillo rápido para homogeneizar el tejido. , centrifugar el homogeneizado con una centrífuga de baja temperatura a 10 000 r·min-1 durante 10 minutos, tomar el sobrenadante, determinar la concentración de proteína mediante el método de cuantificación de proteína BCA, mezclarlo con el tampón de carga, desnaturalizar la proteína, y analizar los resultados según cada muestra. Se cargaron 30 ug de proteína, se sometieron a electroforesis SDS-PAGE, se transfirieron en húmedo a una membrana y luego se bloquearon con leche desnatada en polvo al 5% a temperatura ambiente durante 1,5 h, se lavaron tres veces con TBST, se colocó el anticuerpo primario en un agitador y se incubó durante la noche. 4 grados, luego se retira y se lava con tampón TBST. Lave 3 veces con solución, incube con anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente y luego lave 3 veces con TBST. La solución de trabajo de quimioluminiscencia ECL se utiliza para el desarrollo del color y para el revelado se utiliza un sistema de imágenes de quimioluminiscencia completamente automático. El software Image J se utiliza para analizar los resultados.

Métodos estadísticos Todos los datos involucrados en este experimento se expresan en forma de media ± desviación estándar. Se utilizó GraphPad Prism para trazar datos experimentales y la comparación entre grupos se realizó mediante ANOVA unidireccional o ANOVA bidireccional; cuando las diferencias entre grupos fueron estadísticamente significativas, se utilizó el método de diferencia mínima significativa (LSD). ) Haga comparaciones por pares entre grupos, y P < 0.05 se considera una diferencia estadísticamente significativa.