Membrana de cáscara de huevo mejora la hiperuricemia al aumentar la excreción de urato en ratas inyectadas con oxonato de potasio
Mar 16, 2022
Resumen:La hiperuricemia es la causa principal de la artritis gotosa y otros trastornos metabólicos. La membrana de cáscara de huevo (EM) es un suplemento eficaz y seguro para curar el dolor y la rigidez relacionados con la osteoartritis. Sin embargo, el efecto de la EM sobre la hiperuricemia no está claro. Este estudio determina los efectos de EM sobre la hiperuricemia inyectada con oxonato de potasio. Se miden las concentraciones de ácido úrico, creatinina, nitrógeno ureico en sangre en el suero y la actividad de la xantina oxidasa en el hígado. niveles de proteína derenal transportador de urato 1 (URAT1), transportadores de aniones orgánicos 1 (OAT1), transportador de glucosa 9 (GLUT9) y transportador de casete de unión a ATP G2 (ABCG2) en elriñónse determinan conrenalhistopatología Los resultados demuestran que EM reduce los niveles de ácido úrico en suero y aumenta los niveles de ácido úrico en orina en ratas hiperuricémicas. Además, EM regula a la bajarenalLa expresión de la proteína URAT1 aumenta la expresión de OAT1 y ABCG2, pero no cambia la expresión de GLUT9. Además, EM no cambia la actividad de la xantina oxidasa en el hígado o el suero. EM también disminuye la captación de ácido úrico en los ovocitos que expresan hURAT1. Finalmente, EM reduce notablementerenalinflamación y niveles séricos de interleucina-1. Estos hallazgos sugieren que EM exhibe efectos antihiperuricémicos al promover renalexcreción de urato y regulaciónrenaltransportadores de urato Por lo tanto, EM puede ser útil en la prevención y tratamiento de la gota y la hiperuricemia.
Palabras clave:Riñón; renal; gota; transportador de urato 1; ácido úrico; oxonato de potasio
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La membrana de la cáscara de huevo (EM) es la película adherida al interior de la cáscara del huevo y es uno de los componentes de los huevos, un alimento importante para la salud humana. Permite la penetración de oxígeno y bloquea la invasión de microorganismos. EM se compone de material orgánico (70 por ciento), material no orgánico (10 por ciento) y agua (20 por ciento), con el 80 por ciento del material orgánico compuesto de proteína. Además, se compone de 2,3 por ciento de grasa y 3,4 por ciento de carbohidratos [1,2]. Entre los componentes de los huevos, la yema de huevo y la clara de huevo se utilizan como materia prima para la alimentación, y las cáscaras de huevo son una materia prima para los suplementos de calcio para formar y mantener los dientes y los huesos [3]. Sin embargo, el EM se clasifica como desecho y no se utiliza con frecuencia. Los efectos antiartríticos de la EM se informaron recientemente en un modelo animal inducido por lipopolisacáridos y en estudios clínicos en humanos [4,5]. EM también ha mejorado la inflamación en ratas con artritis reumatoide inducida por colágeno [6]. Además, EM ha demostrado actividad antiartrítica en ratas con osteoartritis inducida por yodoacetato monosódico [7]. El yodoacetato monosódico es un inductor de la artritis gotosa, y la acumulación de cristales de urato monosódico en las articulaciones puede provocar inflamación y provocar artritis gotosa. La hiperuricemia puede hacer que se formen cristales de ácido úrico (o urato), y el depósito de estos cristales en las articulaciones provoca gota, una forma de artritis que puede ser muy dolorosa. EM es una fuente de colágeno, sulfato de condroitina, glucosamina, ácido hialurónico y calcio, que han sido ampliamente investigados para el tratamiento de la osteoartritis [8]. Los resultados de estos estudios muestran la utilidad potencial de la EM para prevenir y tratar la gota y la hiperuricemia.
La hiperuricemia es un factor de riesgo importante para el progreso de la resistencia a la insulina, la diabetes, la obesidad, la hipertensión, la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares, así como para la artritis gotosa [9-11]. El adecuado control de la hiperuricemia contribuye a la prevención y tratamiento de estas enfermedades. La hiperuricemia se produce con un aumento de la producción de ácido úrico o una excreción deficiente de ácido úrico [12]. Al reducir la producción y aumentar la excreción de ácido úrico, el tratamiento reductor de urato puede desempeñar un papel crucial en el control de la hiperuricemia y los trastornos asociados a la hiperuricemia [13]. Los medicamentos reductores de urato de uso común, como el alopurinol y el febuxostat, un inhibidor de la síntesis de ácido úrico, se usan ampliamente para el tratamiento de la gota; sin embargo, estos inhibidores de la xantina oxidasa (XO) pueden tener reacciones adversas graves, como el síndrome de hipersensibilidad al alopurinol [14–16]. La benzbromarona es un medicamento uricosúrico que se ha utilizado para controlar la gota durante los últimos 30 años, pero debido a los graves efectos secundarios de la hepatotoxicidad, se retiró del mercado europeo [17]. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar fármacos derivados de productos naturales sin toxicidad que sean más eficaces para la prevención y el tratamiento a largo plazo de los trastornos asociados a la hiperuricemia. Por lo tanto, este estudio investiga si EM protege contra la hiperuricemia. Este estudio evalúa la actividad antihiperuricémica de EM en ratas con hiperuricemia inducida por oxonato de potasio (PO). PO es un inhibidor de la uricasa selectivamente competitivo, que se usa ampliamente para inhibir el efecto de la uricasa hepática, que conduce a la hiperuricemia [18,19]. Por lo tanto, las ratas tratadas con PO son un modelo animal práctico no solo para investigar la patología de la hiperuricemia sino también para evaluar posibles medicamentos [20]. Para examinar la actividad y los mecanismos subyacentes de EM en la hiperuricemia, se examinan los mecanismos duales de EM a través de la inhibición de la producción de ácido úrico y la mejora de la excreción de ácido úrico en animales hiperuricémicos.
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2. Materiales y métodos
2.1. animalesSe compraron ratas macho Sprague Dawley de siete semanas de edad de Orient Bio (Seongnam, Corea). Se adaptaron en una sala de animales climatizada a 22 ± 1 ◦C con 50 por ciento ± 10 por ciento de humedad. A las ratas se les dio acceso a una dieta estándar y agua ad libitum. Los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Medicina Oriental de Corea, y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del comité (código de aprobación. 19-024).
2.2. Inducción de hiperuricemia y administración de EMEl EM utilizado en este estudio lo proporcionó JU-HWAN BIO CELL Co., Ltd. (Cheonan, Corea) en forma de polvo seco. Para inducir la hiperuricemia, se inyectaron intraperitonealmente a los animales 150 mg/kg PO (un inhibidor de la uricasa). Se utilizaron los siguientes fármacos de control positivo: alopurinol (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) y benzbromarona (TCI, Tokio, Japón). Antes de la inyección, la PO se disolvió en 0,5 por ciento de carboximetilcelulosa (CMC, Sigma, EE. UU.) y 0,1 M acetato de sodio (Sigma, EE. UU.). Para examinar las actividades antihiperuricémicas de EM (Experimento 1, estudio agudo preliminar), las ratas se dividieron en cinco grupos (5 animales por grupo): un grupo normal; un grupo de hiperuricemia inyectada por PO (PO); un grupo al que se administró VO más 10 mg/kg de alopurinol; un grupo administrado por vía oral más 100 mg/kg por vía EM; y un grupo administrado por vía oral más 200 mg/kg por vía EM. En el Experimento 1, las muestras se disolvieron en CMC y se administraron por vía oral (una vez) a las ratas 1 h después de la inyección PO durante 1 día. Para investigar las actividades dependientes de la dosis y los mecanismos moleculares de EM (Experimento 2), las ratas se dividieron en 7 grupos (n=5 cada uno): un grupo normal (N); un grupo de hiperuricemia inyectada por PO; un grupo al que se administró VO más 10 mg/kg de alopurinol; un grupo al que se le administró 50 mg/kg de benzbromarona por vía oral; un grupo administrado por vía oral más 50 mg/kg por vía EM; un grupo administrado por vía oral más 100 mg/kg por vía EM; y un grupo administrado por vía oral más 200 mg/kg por vía EM. Las muestras se disolvieron en solución de CMC al 0,5 por ciento y se administraron por vía oral (todos los días) a las ratas 1 hora después de la inyección oral durante 5 días.
2.3. Recolección de muestras de sangre, orina y tejidosLa sangre se recogió 2 h después de la administración del fármaco y la orina también se recogió después de 2 h, usando una jaula metabólica después del tratamiento de la muestra. Después de la recolección de la sangre y la orina, el tejido(riñóne hígado) las muestras se dividieron cuidadosamente y se conservaron a 80 ◦C para ensayos posteriores. El suero se separó por centrifugación (2000×g, 15 min, 4 ◦C). Las muestras de suero y orina se usaron luego para análisis bioquímicos.
2.4. Análisis de Concentraciones de Ácido Úrico en Suero y OrinaLas concentraciones de ácido úrico del suero y la orina se determinaron utilizando un kit comercial de análisis de ácido úrico (Biovision, Milpitas, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
2.5. Medición de los niveles de citoquinas proinflamatorias en sueroLas concentraciones séricas de interleucina (IL)-1 se midieron utilizando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de IL-1 de rata (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.).
2.6. Actividad de xantina oxidasa in vitro de hígado y sueroLa actividad XO en el tejido hepático y el suero se determinó usando el kit de ensayo de actividad XO de acuerdo con los protocolos del fabricante (Sigma, EE. UU.). La actividad XO se midió con un lector de microplacas Spectra Max M3 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.) utilizando protocolos publicados previamente [21]. La reacción enzimática se inició mediante la adición de 0xantina 0,5 mM como sustrato, y se midió la concentración de ácido úrico cada minuto durante 5 min. El inhibidor de XO alopurinol se utilizó como referencia. La actividad XO hepática se normalizó por el nivel de proteína total.
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2.7. Examen Histopatológico del RiñónSe extrajeron los tejidos renales, se fijaron inmediatamente durante 1 día en formalina y luego se incluyeron en parafina. Cada muestra se cortó con un grosor de 6 µm y las secciones se tiñeron con reactivo de hematoxilina y eosina. A continuación, las secciones teñidas se visualizaron al microscopio.
2.8. Análisis de Western BlotRiñónlos tejidos se homogeneizaron en una solución de extracción pro-prep (Intron, Seúl, Corea) y luego se centrifugaron (13,000× g, 4 ◦C) durante 15 min. El sobrenadante se usó para el análisis de transferencia Western de las proteínas objetivo. Los niveles de proteína total se determinaron mediante un ensayo de proteína DC con albúmina de suero bovino (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Los anticuerpos primarios incluyeron actina (Santa Cruz, Dallas, TX, EE. UU.), transportador de glucosa 9 (GLUT9, MyBioSource, San Diego, CA, EE. UU.), transportador de urato 1 (URAT1; MyBioSource, San Diego, CA, EE. UU.) y transportador de aniones orgánicos 1 (OAT1; MyBioSource, San Diego, CA, EE. UU.). Las bandas de la membrana se visualizaron mediante el reactivo de detección ECL utilizando un ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Seúl, Corea). La densidad de las imágenes obtenidas se determinó utilizando el software Image J1.49 de NIH (Bethesda, MD, EE. UU.). Los niveles de proteína diana visualizados se normalizaron a -actina. Las expresiones del transportador de casete de unión a ATP G2 (ABCG2) se obtuvieron utilizando un kit ELISA ABCG2 de rata (MyBioSource) y se normalizaron según los niveles de proteína total.
2.9. Medición de la captación de urato mediante UART1-Expresión de ovocitosLos ovocitos que expresan hURAT{{0}}de Xenopus se construyeron como se describió anteriormente [20]. El inhibidor de URAT1 benzbromarona (TCI, Tokio, Japón) se trató como referencia. Los ovocitos se incubaron en un tampón de reacción con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y una solución ND (pH 7,4; 5 mM 4-(2- Hidroxietil)) piperazina-1-etano-ácido sulfónico, KCl 2 mM, cloruro de magnesio 1 mM, cloruro de calcio 1,8 mM y cloruro de sodio 96 mM), con ácido carboxílico de pirazina 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, EE. UU.) a 37 ◦C. Los ovocitos se incubaron adicionalmente en una solución que contenía varias concentraciones de EM (1, 10 y 100 µg/mL) con ácido úrico [14C] 50 µM (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EE. UU.) a 37 ◦C. Después de 60 minutos, la absorción de ácido úrico se detuvo mediante un suplemento de DPBS frío. Después de parar, los ovocitos se disolvieron en una solución de hidróxido de sodio 0,1 N y dodecilsulfato de sodio al 10 por ciento, y se contó la radiactividad por centelleo líquido.
2.10. EstadísticasTodos los datos se expresaron como la media ± error estándar de la media. Las diferencias significativas se evaluaron estadísticamente mediante un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para el análisis post hoc utilizando el software GraphPad Prism 7.05. La diferencia se consideró estadísticamente significativa cuando el valor de p fue inferior a 0,05.
3. Resultados
3.1. Efectos de la membrana de la cáscara de huevo sobre la secreción de ácido úrico sérico,Una sola inyección PO durante 1 día aumentó significativamente los niveles de ácido úrico en suero en ratas hiperuricémicas inyectadas por PO en comparación con las de ratas normales (Figura 1). Mientras tanto, EM a 100 y 200 mg/kg y alopurinol (control positivo) redujeron eficazmente el ácido úrico sérico en ratas hiperuricémicas inyectadas por PO. Por lo tanto, los siguientes estudios se realizaron para identificar las actividades y los mecanismos de EM dependientes de la dosis.
3.2. Efectos de la membrana de la cáscara de huevo en los niveles de ácido úrico en suero y orina,La inyección de APO durante 5 días elevó significativamente los niveles de ácido úrico en suero en el grupo PO en comparación con los del grupo normal (Figura 2a). El tratamiento de EM a 100 y 200 mg/kg, así como alopurinol y benzbromarona, redujo significativamente los niveles séricos de ácido úrico en el grupo PO. Además, para evaluarfunción renal, se midieron las concentraciones de creatinina y nitrógeno ureico en sangre (BUN). Las concentraciones de creatinina sérica no fueron diferentes entre los grupos (Figura 2b). Las concentraciones séricas de BUN aumentaron en el grupo de PO, pero estos niveles disminuyeron en el grupo de 200 mg/kg de EM y en los grupos de control positivo (alopurinol y benzbromarona) (Figura 2c).
Para evaluar el efecto de EM sobre la excreción de ácido úrico, se examinaron los niveles de ácido úrico en orina. El grupo PO había disminuido significativamente los niveles de ácido úrico en la orina, que aumentaron con la administración de EM (100 y 200 mg/kg) y benzbromarona (Figura 2d). Estos datos demostraron que EM podría aumentar la extracción de urato renal para disminuir los niveles de ácido úrico en suero en ratas hiperuricémicas.
3.3. Efectos de la membrana de cáscara de huevo sobre la inflamación renalSe observó dilatación tubular leve, degeneración vacuolar de la célula epitelial tubular, hinchazón e infiltración de células inflamatorias en elriñónde ratas hiperuricémicas inyectadas con PO (Figura 3a). Sin embargo, EM mejoró efectivamente estosrenalCambios histopatológicos en ratas hiperuricémicas. Además, las ratas hiperuricémicas demostraron niveles séricos elevados de citocina proinflamatoria IL-1 (Figura 3b). El EM en todas las concentraciones reguló notablemente a la baja los niveles séricos en ratas hiperuricémicas. La administración de benzbromarona aumentó los niveles séricos de IL-1 más que en ratas hiperuricémicas inyectadas por vía oral, aunque no significativamente, y probablemente sea el efecto secundario de este fármaco. Estos resultados sugieren que EM efectivamente mejoróriñóninflamación y función en ratas hiperuricémicas.
3.34. Efectos de la membrana de cáscara de huevo en la actividad XO
La XO en el hígado induce la producción de ácido úrico. Por lo tanto, para definir el mecanismo del efecto inhibidor de EM sobre la hiperuricemia, se evaluó la actividad XO en el suero y el hígado, la actividad XO hepática aumentó significativamente en el grupo PO (Figura 4a,b). El inhibidor de la XO, alopurinol, disminuyó significativamente la actividad de la XO en el suero y el hígado. Sin embargo, EM en todas las dosis no cambió la actividad de XO. Estos datos indican que EM no inhibe la actividad de XO y reduce la producción de ácido úrico.
3.5. Efectos de la membrana de la cáscara de huevo sobre la excreción de uratoPara evaluar el efecto de EM en la excreción de urato, la expresión de variostransportadores renalesfue examinado. El EM a 100 y 200 ug/mL, y la benzbromarona, redujeron significativamente los niveles de proteína URAT1 en elriñón(Figura 5a,b). Sin embargo, el EM no cambió los niveles de proteína GLUT9 (Figura 5c). El EM a 200 ug/ml aumentó los niveles de proteína OAT1 y la administración de EM en todas las concentraciones aumentó los niveles de ABCG2 (Figura 5d,e).
3.6. Efecto de EM en la captación in vitro de URAT1 en ovocitosAdemás, se confirmó el efecto de EM sobre el sistema de captación de urato in vitro. El tratamiento con EM a 1, 10 y 100 ug/mL exhibió una potente inhibición de la captación de ácido úrico in vitro que sobreexpresa hURAT1-ovocitos (Figura 6). Estos datos indican que EM regula la expresión de transportadores de urato para aumentar la excreción de urato.
Discusión
En los humanos, los riñones juegan un papel importante en la homeostasis del ácido úrico, ya que más del 70 por ciento de la excreción de urato esrenal,mientras que el 30 por ciento restante se excreta en las heces del intestino [22,23]. Sin embargo, la excreción de urato puede verse afectada porrenaltrastornos que conducen a la hiperuricemia. La excreción de ácido úrico depende de proteínas transportadoras en los túbulos proximales delriñónpara controlar la secreción de ácido úrico en la sangre y el filtrado [24].Renaltransportadores de urato URAT1, ubicado en la membrana luminal, y GLUT9/ en la membrana apical de lariñóntúbulos proximales, comprenden la vía principal de reabsorción de urato en elriñón[25,26]. OAT1, ubicado en la membrana basolateral del túbulo proximal, y ABCG2, ubicado en la membrana apical, son los principales responsables de la secreción de urato de la sangre a las células epiteliales [27]. La regulación de estos transportadores de urato se considera un objetivo terapéutico importante para la hiperuricemia. En este estudio, el EM disminuyó efectivamenterenalLos niveles de URAT1 en ratas hiperurémicas inyectadas por PO, aunque las expresiones de la proteína GLUT9 no cambiaron. Además, las expresiones de las proteínas OAT1 y ABCG2 aumentaron en elriñóndespués del tratamiento EM, exhibiendo así un efecto uricosúrico. Este estudio confirmó la actividad inhibidora del EM sobre la captación de urato por parte de URAT1 en ovocitos que sobreexpresan URAT1- y que este efecto fue efectivo para revertir la captación de urato promovida por URAT1. En total, el 90 por ciento de la reabsorción de urato se obtiene a través derenalURAT1 [28]. El control de estosriñóntransportadores de urato por el tratamiento EM puede contribuir a la promoción derenalexcreción de ácido úrico en ratas con hiperuricemia. La creatinina y el nitrógeno ureico son biomarcadores de alteracionesriñónfunción, indicando la capacidad delriñónpara excretar metabolitos proteicos [24]. Los resultados demostraron que la PO aumenta las concentraciones séricas de ácido úrico y BUN conrenaldisfunción. Sin embargo, el EM de 200 mg/kg revirtió este aumento con una mejorafunción renal. La enzima XO cataliza la oxidación de hipoxantina o xantina a ácido úrico [28]. Los inhibidores de la XO, como el alopurinol, reducen las concentraciones séricas de ácido úrico y la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno asociadas principalmente con la hiperactividad de la XO, que a menudo genera daño celular inflamatorio en el endotelio vascular, lo que contribuye al desarrollo del síndrome metabólico y trastornos cardiovasculares [29]. ]. Por tanto, la inhibición de la sobreactivación de XO puede ser una diana terapéutica para controlar los efectos nocivos del exceso de ácido úrico. Sin embargo, nuestro estudio mostró que EM no revirtió la actividad XO sérica y hepática en ratas con hiperuricemia inducida por PO.
La hiperuricemia puede ser un elemento de riesgo parariñóndisfunción [23]. En el presente estudio,riñónLa disfunción se caracterizó por un aumento de los niveles séricos de BUN y de citoquinas inflamatorias IL-1p yrenalinflamación en ratas hiperuricémicas. Estasrenaldisfunciones fueron atenuadas por el tratamiento EM, sugiriendo una mejoría en la inflamación renal. Sin embargo, el fármaco benzbromarona elevó los niveles séricos de IL-1p en ratas hiperuricémicas, y se notificó daño renal como efecto adverso principal de los fármacos uricosúricos, incluidos la benzbromarona y el probenecid [30]. EM contiene glucosamina natural, sulfato de condroitina, ácido hialurónico, colágeno, péptidos y otros aminoácidos que contienen azufre [8]. Estudios previos informaron que la glucosamina y la condroitina han demostrado efectos antiinflamatorios y antiartrosis [31,32]. El ácido hialurónico mostró efectos antiinflamatorios y antihiperuricémicos en modelos animales inducidos por cristales de urato monosódico para la artritis gotosa aguda y la hiperuricemia [33]. Los resultados de estos estudios muestran la potencial utilidad de estos componentes para prevenir y tratar la hiperuricemia. Sin embargo, nuestro estudio no mostró qué componentes del EM aumentaron la excreción de ácido úrico. Los efectos de los componentes bioactivos derivados de EM deben investigarse más a fondo. En este estudio, demostramos que la hiperuricemia inducida por PO yinflamación renalfue inhibida por el tratamiento EM. Por lo tanto, EM podría ser un agente antihiperuricémico prometedor. Suponga que una dosis efectiva de EM en ratas es de 100 mg/kg (dosis máxima: 200 mg/kg). Según el área de superficie corporal, la dosis equivalente humana de EM es de 16,2 mg/kg (972 mg/día en adultos). A partir de estos estudios in vivo, la dosis diaria recomendada de EM en condiciones leves es de 486 mg o 972 mg al día, y la dosis máxima es de 1944 mg al día para condiciones graves. Sin embargo, la dosis puede variar según la duración del tratamiento y la edad. Sobre la base de estos resultados, se llevará a cabo un estudio clínico humano de EM en un futuro próximo.
