Mejora de los efectos antiangiogénicos de la delfinidina cuando se encapsula dentro de pequeñas vesículas extracelulares, parte 2

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3.2. Metabolitos de delfinidina dentro de sEV

Además de la delfinidina (Figura 2A), la peonidina-3-galactósido(Tiempo de retención=11.11 min, [M]' m/z=463.12404)(Figura 2B) ydelfinidina3-O- -rutinósido (tiempo de retención=12.34 min, [M] m/z=611.16121)(Figura 2C) bajo estas condiciones experimentales en sEV . También se detectaron trazas de estos metabolitos en la solución estándar de delfinidina. El análisis se basó en la masa exacta, aunque se necesita una solución estándar auténtica para confirmar esta observación.

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3.3. Efectos de la delfinidina y la delfinidina cargada con sEV en la proliferación de HAoEC

La delfinidina sola o cargada en sEV no modificó la viabilidad de HAoEC durante 24 h en concentraciones de 1 a 10 ug/mL (Figura 3A).

VEGF (20 ng/ml), utilizado como control positivo, aumentó de manera no significativa la proliferación de células endoteliales (Figura 3B). Los SEV nativos (10 ug/mL) no tuvieron efecto. La delfinidina inhibió la proliferación de células endoteliales de una manera dependiente de la concentración, con un efecto máximo alcanzado a 10 ug/mL (Figura 3B). De la misma manera, la delfinidina cargada con sEV indujo una inhibición dependiente de la concentración deendotelialproliferación celular. Curiosamente, la inhibición máxima se obtuvo a una concentración de 5 ug/ml de delfinidina cargada con sEV, una concentración dos veces menor que la de la delfinidina sola. Estos resultados sugieren que la delfinidina cargada con sEV era dos veces más potente quedelfinidinasolo.

3.4.Efectos de la delfinidina y la delfinidina cargada con sEV en la producción de NO

Como se muestra en la Figura 4, ATP (10 μM) indujo un aumento en DAF-2fluorescenciaque ilustra la producción de NO en células endoteliales. Los sEV nativos no afectaron el nivel de NO. La delfinidina sola aumentó la producción de NO de forma dependiente de la concentración, y el efecto máximo se alcanzó a 10 ug/ml. Los sEV cargados con delfinidina también provocaron un aumento dependiente de la concentración de la producción de NO endotelial. Curiosamente, el efecto máximo de la delfinidina cargada con sEV se obtuvo a 1 ug/mL, mientras que la delfinidina libre alcanzó este efecto a 10 ug/mL. Por lo tanto, la delfinidina cargada con sEV fue 10 veces más potente que la delfinidina sola para aumentar la producción de NO.

3.5. Efectos de la delfinidina y la delfinidina cargada con sEV en la angiogénesis

Las HAoEC reestructuraron y formaron estructuras similares a capilares (Figura 5A,B). Los sEV nativos no tuvieron efecto en la formación de estructuras similares a capilares. Como se describió anteriormente [6], la delfinidina sola redujo el número de ramificaciones de estructuras similares a capilares de una manera dependiente de la concentración, y el efecto máximo se alcanzó a 10 ug/mL con una reducción del 40 por ciento. Curiosamente, los sEV cargados con delfinidina ejercieron una potente reducción del número de ramificaciones capilares. La delfinidina a 0,1 ug/mL cargada dentro de sEV ya disminuyó el número de ramificaciones en un 60 por ciento, y este efecto fue mayor que el obtenido con 10 ug/mL de delfinidina sola. Por lo tanto, la delfinidina cargada con sEV fue más de 100 veces más potente para inhibir la angiogénesis que la delfinidina sola.

Figura 5. Ensayo de angiogénesis in vitro. (A) Micrografías de contraste de fase representativas de estructuras tubulares en cultivos de HAoEC expuestos durante 24 h a delfinidina o sEV cargados con delfinidina a diferentes concentraciones. Aumento: 40x. Se analizaron cuatro áreas de cada pocillo. (B) El gráfico de barras ilustró la disminución significativa en el porcentaje de puntos de ramificación después del tratamiento en comparación con los tratados con PBS (control). Los datos se muestran como la media ± SEM de seis experimentos independientes en comparación con el control: a: p<0.0001><0.0001 vs.del=""><0.0001 vs.="" del=""><0.001 vs.=""><><0.05vs.del5;g:><0.05 vs.sev=""><0.001 vs.sevdel0.5="" and=""><0.0001 vs.sevdel="">

4. Discusión

El estudio actual muestra que la delfinidina cargada dentro de los sEV era obviamente más potente que la delfinidina libre en cuanto a su capacidad para liberar NO endotelial, inhibir la proliferación endotelial y reducir las estructuras de tipo capilar. Además de la delfinidina que se encuentra en los sEV, el análisis de los metabolitos de la delfinidina dentro de los sEV mostró la presencia de dos metabolitos (es decir,delfinidina3-O--rutinósido y peonidina-3-galactósido)presentes en muestras de delfinidina. Por lo tanto, la delfinidina se degradaba en los mismos metabolitos en su forma libre o cuando se cargaba en sEV; sin embargo, estos fueron más potentes al actuar sobre las células endoteliales. De importancia, cuando se encapsuló dentro de sEV, la delfinidina (utilizada como un término genérico y que abarca los metabolitos naturales delfinidina 3-O-ß-rutinósido y peonidina-3-galactósido) fue 2-veces, {{8 }} veces, y 100- veces más potente que la delfinidina libre con respecto a la proliferación endotelial, la producción de NO endotelial y la formación de tipo capilar. Por lo tanto, la delfinidina cargada con sEV ejerce efectos en diferentes pasos que conducen a la angiogénesis. Estos resultados indican que los sEV pueden considerarse como una entrega prometedora de delfinidina como un enfoque innovador para atacar enfermedades asociadas con una mayor angiogénesis, incluido el cáncer, la aterosclerosis y las retinopatías diabéticas.

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La encapsulación de polifenoles para protegerlos de la degradación es un fenómeno natural. De hecho, se ha demostrado que las plantas ricas en polifenoles producen vehículos eléctricos que llevan estas moléculas. Por ejemplo, el glucósido flavonoide naringina y su metabolito, la naringenina, se encuentran en vehículos eléctricos derivados del pomelo [12]. Además, las nanopartículas derivadas de plantas pueden utilizarse como vectores para otras moléculas de interés. De hecho, se ha informado que las nanopartículas derivadas de toronja cargadas con un inhibidor de STAT3 inactivan STAT3 en las células tumorales GL26 y mejoran las tasas de supervivencia de los ratones [19]. Otra estrategia para la encapsulación de polifenoles es utilizar vesículas derivadas de células de mamíferos. Un informe reciente evaluó la formulación exosomal de antocianidinas contra diferentes tipos de cáncer [19]. Los SEV extraídos de leche bovina cruda cargada con una mezcla de cianidina, delfinidina, petunidina, peonidina y malvidina aumentan la actividad antiproliferativa de las antocianidinas contra seis tipos diferentes de células cancerosas a través de la inhibición de la activación de NF-kB inducida por TNFO [20] . De hecho, los efectos de los sEV cargados con antocianidinas son más efectivos que los obtenidos por las antocianidinas libres. Este método tiene ventajas; sin embargo, sigue siendo arriesgado. De hecho, el uso de vehículos eléctricos de células de mamíferos puede causar reacciones inmunitarias. Los vehículos eléctricos eléctricos derivados de células dendríticas humanas inmaduras no indujeron ninguna toxicidad, y la naturaleza inmadura de las células dendríticas indujo una baja inmunogenicidad [21,22]. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se describe una eficiencia de carga para delfinidina dentro de JAWS ⅡI sEV. La carga de delfinidina en los sEV (9 por ciento) protege y probablemente limita su degradación en metabolitos en las condiciones experimentales utilizadas. Los mecanismos involucrados requieren más estudio. Los metabolitos que se encuentran en los sEV, como la delfinidina 3-O- -rutinósido o la peonidina-3-galactósido, también se encuentran en experimentos in vivo con delfinidina 14,15]. Trabajos previos han informado que los productos de degradación de la delfinidina tienen potentes actividades biológicas, incluidas actividades anticancerígenas y antiinflamatorias [20]. Entre los ácidos fenólicos, el ácido gálico se forma principalmente por la degradación de delfinidina en medios de cultivo [23]. En el presente estudio, encontramos que los metabolitos detectados en la delfinidina cargada con sEV eran idénticos a los detectados en la delfinidina libre [18]. Aunque no se determinó la proporción exacta de metabolitos encapsulados en estos sEV, fueron más efectivos en las células diana que los metabolitos solos. Por lo tanto, la delfinidina y sus metabolitos probablemente eran más estables y estaban protegidos de la degradación.

Anteriormente informamos que, en las células endoteliales de la aorta bovina, la delfinidina estimula la liberación de NO aumentando las concentraciones intracelulares de Ca2 plus a través del aumento de la formación de anión superóxido. Esto se asoció con un aumento de la fosforilación de tirosina de varias proteínas intracelulares, lo que resultó en una vasodilatación dependiente del endotelio [24,25]. La delfinidina interactúa directamente con el sitio activador de ER, lo que conduce a la activación de la NO-sintasa endotelial, la producción de NO y la vasorrelajación dependiente del endotelio. 4] En el presente estudio, la delfinidina cargada con sEV fue 10 veces más potente que la delfinidina libre; por lo tanto, probablemente sería más efectivo para corregir la disfunción endotelial del NO asociada con enfermedades cardiovasculares, como hipertensión, accidente cerebrovascular o enfermedades metabólicas [3].

Anteriormente informamos que la regulación positiva de la vía del NO no es responsable del efecto antiproliferativo de la delfinidina. De hecho, la delfinidina inhibe la proliferación de células endoteliales mediante la activación de la vía ERK{{0}}/-2, lo que lleva a la detención del ciclo celular y la acumulación de células en la fase G0/G1 a través de la regulación negativa de expresión de ciclina A y D1 y una regulación al alza de p27kip1 [6,7]. También encontramos que la delfinidina reduce el crecimiento tumoral de las células de melanoma in vivo al actuar específicamente sobre la proliferación de células endoteliales a través de la inhibición de la señalización de VEGFR2, MAPK, PI3K y a nivel de transcripción en los factores CREB/ATF1, y la inhibición de la fosfodiesterasa 2 [9]. En el presente estudio, los sEV cargados con delfinidina fueron dos veces más potentes que la delfinidina libre para inhibir la proliferación endotelial. Por lo tanto, estos resultados indican que los sEV cargados con delfinidina son un enfoque prometedor para prevenir patologías asociadas con el exceso de proliferación endotelial y, por lo tanto, la generación de la red vascular, como el desarrollo y la estabilidad de la placa en la aterosclerosis y el desarrollo de tumores en el cáncer.

De acuerdo con estos hallazgos, mostramos que la delfinidina disminuye la formación de tipo capilar en un modelo experimental de angiogénesis. Curiosamente, cuando se encapsuló dentro de sEV (incluso con una carga tan baja como el 9 por ciento), la delfinidina fue 100-veces más potente que la delfinidina libre en la disminución de la formación similar a un capilar.

Limitación del estudio: El potencial antiangiogénico que presentan muchos compuestos naturales contenidos en muchos componentes de la dieta mediterránea, incluida la delfinidina, hace que este patrón dietético sea especialmente interesante como fuente de agentes quimiopreventivos, definidos dentro de la estrategia de angioprevención. Esto ha sido revisado recientemente por Martinez-Podeva et al. [26]. La delfinidina parece ser tan potente como otros flavonoides en la inducción de propiedades antiangiogénicas. Aunque abundantes en la dieta, las antocianinas en general, y la delfinidina en particular, se absorben mal. Una consecuencia de la escasa biodisponibilidad de las antocianinas es que muchos efectos observados in vitro (p. ej., la inhibición de la COX-2) es poco probable que ocurran in vivo, lo que no es el caso de la delfinidina, según nuestros estudios anteriores [{{ 5}}]. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales que utilicen delfinidina encapsulada en sEV para confirmar el aumento de las propiedades antiangiogénicas de este enfoque in vivo.

En resumen, la delfinidina cargada con sEV aumentó la eficacia de la delfinidina 100-veces para la proliferación, 10-veces para el NO y 2-veces para la formación de tipo capilar. Por lo tanto, los sEV protegían a la delfinidina y sus metabolitos de la degradación, o algunos metabolitos de delfinidina no identificados contenidos en los sEV eran más potentes. La potencia diferencial obtenida para la proliferación, la producción de NO y la angiogénesis respalda la hipótesis de que los EV cargados con delfinidina ejercen efectos en diferentes pasos que conducen a la angiogénesis. Sin embargo, proporcionamos evidencia de que optimizamos la eficacia de la delfinidina, probablemente al reducir su degradación y aumentar su entrega cuando se encapsula en vehículos eléctricos. Por lo tanto, los sEV cargados con delfinidina representan un poderoso sistema de administración para disminuir la angiogénesis en las células endoteliales, sin efectos secundarios no deseados, conociendo la baja biodisponibilidad de este compuesto. Destacamos una estrategia terapéutica innovadora basada en vehículos eléctricos de bioingeniería como vectores de delfinidina para ayudar a aumentar su beneficio potencial para la salud para atacar enfermedades relacionadas con la angiogénesis, incluido el cáncer, que eventualmente podría extenderse a otras enfermedades con exceso de vascularización.

Este artículo está extraído de Nutrients 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378 https://www.mdpi.com/journal/nutrients