Mejora de la proteómica de arriba hacia abajo del tejido cerebral con FAIMS Parte 1

Abstracto

Las investigaciones proteómicas de las enfermedades de Alzheimer y Parkinson han proporcionado información valiosa sobre los trastornos neurodegenerativos. Hasta ahora, estas investigaciones se han restringido en gran medida a enfoques ascendentes, lo que dificulta el grado en que se puede caracterizar el estado "intacto" de una proteína.

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que tiene efectos irreversibles en la memoria y las capacidades cognitivas de una persona. Aunque las personas no pueden curar completamente la enfermedad, mediante un tratamiento y una prevención cuidadosos, se puede ralentizar la progresión de la enfermedad tanto como sea posible y mantener la salud física y mental del paciente.

La memoria es uno de los aspectos más evidentes afectados por los pacientes de Alzheimer. Es posible que a menudo olviden información importante, como su nombre, los nombres de sus seres queridos, fechas importantes, etc. Además, también se puede olvidar cierto vocabulario avanzado de autoaprendizaje, como conceptos abstractos y sinónimos. Sin embargo, con algo de entrenamiento cognitivo y tratamiento, los pacientes con Alzheimer aún pueden mantener su memoria en algunos aspectos.

Aunque la enfermedad de Alzheimer puede traer efectos negativos, debemos mirarla de manera positiva. En primer lugar, al aumentar la conciencia y la comprensión de la enfermedad, podemos prevenirla y tratarla mejor. En segundo lugar, los cuidadores y familiares de pacientes con Alzheimer también pueden aprender a comunicarse e interactuar con ellos de forma eficaz para ayudar a los pacientes a mantener la dignidad propia y vivir lo más felices posible.

En general, aunque la enfermedad de Alzheimer puede provocar efectos irreversibles en la memoria y las capacidades cognitivas, debemos mantener una actitud optimista e intentar frenar la progresión de la enfermedad mediante tratamiento y medidas preventivas. Al mismo tiempo, también deberíamos brindar más ayuda y apoyo a quienes cuidan de pacientes con la enfermedad de Alzheimer y crear conjuntamente una comunidad más cálida e interactiva. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria. Cistanche puede mejorar significativamente la memoria porque es un material medicinal tradicional chino con muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. El efecto de Cistanche proviene de los diversos ingredientes activos que contiene, incluidos ácido tánico, polisacáridos, glucósidos flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro de muchas maneras.

Haz clic en conocer 10 formas de mejorar la memoria

La proteómica de arriba hacia abajo (TDP) supera esta limitación; sin embargo, normalmente se limita a observar sólo las proteoformas más abundantes de un tamaño relativamente pequeño.

Por lo tanto, las técnicas de fraccionamiento se utilizan comúnmente para reducir la complejidad de la muestra. Aquí, investigamos el fraccionamiento en fase gaseosa mediante espectrometría de movilidad iónica de forma de onda asimétrica de alto campo (FAIMS) dentro de TDP.

Utilizando una muestra de alta complejidad derivada del tejido cerebral de la enfermedad de Alzheimer (EA), describimos cómo la adición de FAIMS al TDP puede mejorar considerablemente la profundidad de la cobertura del proteoma.

Por ejemplo, la implementación de FAIMS con un voltaje de compensación externo (CV) de -50, -40 y -30 CV podría más que duplicar el número medio de proteoformas, genes y cobertura de secuencia de proteoma no redundantes en comparación con sin FAIMS.

También descubrimos que FAIMS puede influir en la transmisión de proteoformas y sus envolturas de carga en función de su tamaño. Es importante destacar que FAIMS permitió la identificación de proteoformas de amiloide beta (A) intactas, incluida la variante A 1–42 propensa a la agregación que está fuertemente vinculada a la EA.

Los datos sin procesar y los archivos asociados se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de datos MassIVE con el identificador de conjunto de datos PXD023607.

INTRODUCCIÓN

En las últimas dos décadas, la incidencia de enfermedades neurodegenerativas se ha más que duplicado en todo el mundo, siendo la enfermedad de Alzheimer (EA) la forma más prevalente.1 Dos especies de proteínas, los péptidos beta amiloide (A ) y la proteína tau(tau) asociada a microtúbulos fosforiladas, 2 a 5 están fuertemente asociados con la EA.

Por lo tanto, la caracterización proteómica detallada de la EA ha sido de particular importancia.6,7 La espectrometría de masas ha desempeñado un papel central en estas investigaciones,8 predominantemente mediante enfoques ascendentes.9–16

Sin embargo, la digestión con proteasa requerida para los análisis ascendentes impide la captura del estado completo de una proteína, que puede variar debido a alelos genéticos, empalme alternativo, procesamiento proteolítico y modificaciones postraduccionales (denominadas "proteoformas"). 20

Dado que los enfoques proteómicos de arriba hacia abajo (TDP) analizan proteínas en un estado intacto, la probabilidad de capturar proteoformas asociadas con ciertas patologías es mayor y permite una conexión más fuerte y directa entre genotipo y fenotipo.20–22

Por ejemplo, el TDP es particularmente adecuado para capturar fragmentos proteolíticos endógenos derivados de proteínas como tau, que se han relacionado con la patología de Alzheimer.23–26 Varias aplicaciones anteriores de TDP han demostrado ser muy prometedoras para revelar la heterogeneidad regional del proteoma cerebral y los cambios neuronales en respuesta a diversos estímulos. .27–30

Sin embargo, el TDP de muestras complejas generalmente requiere técnicas de fraccionamiento fuera de línea para reducir la complejidad de la muestra, ya que el proteoma humano abarca varios órdenes de magnitud en tamaño y abundancia, y las proteínas generalmente no se resuelven bien con la cromatografía líquida de alto rendimiento (LC) de fase inversa.31

Este fraccionamiento fuera de línea se puede lograr con electroforesis por atrapamiento de fracción líquida eluida en gel, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico o purificación por afinidad, por nombrar algunas.22,32–35

Desafortunadamente, el fraccionamiento fuera de línea generalmente reduce el rendimiento y el rendimiento al requerir un manejo prolongado de las muestras.36 La separación por movilidad iónica en fase gaseosa es una alternativa de fraccionamiento atractiva que se puede introducir entre las dimensiones LC y MS sin requerir pasos adicionales de manejo de muestras.

La espectrometría de movilidad iónica de forma de onda asimétrica de alto campo (FAIMS) es particularmente adecuada para esta tarea con la reciente introducción del dispositivo FAIMS Pro, cuyo diseño modular permite una fácil incorporación de la movilidad iónica en varios instrumentos Orbitrap actuales.37

FAIMS, también conocida como espectrometría de movilidad diferencial, separa iones en un gas portador basándose en combinaciones de factores como tamaño, carga o forma mediante la introducción de una forma de onda asimétrica con campos eléctricos altos y bajos.38 Para evitar la colisión de los iones con el electrodo, se introduce una desviación en la trayectoria del ion mediante la aplicación de un voltaje de compensación (CV) de CC,39 que permite la transmisión selectiva de ese ion.38

La aplicación de FAIMS al análisis de proteínas intactas se ha restringido en gran medida a la separación de confórmeros de proteínas individuales o pequeñas combinaciones de proteínas;40–45

sin embargo, FAIMS se ha aplicado recientemente a análisis de proteínas intactas y nativas mediante análisis de superficie de extracción líquida.46–50 En este caso, aplicamos el análisis FAIMS-TDP a una muestra de tejido completo de la corteza frontal medial (MFC) de un paciente con Alzheimer.

El escaneo en un rango de CV de −50 a −20 CV con pasos externos nos permitió determinar cómo la modulación de FAIMS CV influye en las características de los iones transmitidos a través de la unidad FAIMS cilíndrica y cómo se puede explotar esta relación para apuntar a proteoformas según el tamaño.

FAIMS-TDP duplicó con creces las identificaciones de proteoformas en un solo CV en comparación con sin FAIMS y permitió un interrogatorio más profundo de proteoformas relevantes para enfermedades neurodegenerativas, incluidas -, - y -sinucleínas, PARK7, isoformas de empalme de tau y varias proteoformas A intactas.

En conjunto, este trabajo describe cómo se pueden lograr mayores identificaciones de proteoformas y cobertura de proteomas de manera reproducible mediante el fraccionamiento en fase gaseosa con FAIMS en TDP.

MÉTODOS

Preparación de muestras

La muestra de MFC se recibió del Centro de Enfermedad de Alzheimer de la Universidad Rush. Los participantes eran personas mayores que acudieron a la clínica y que se inscribieron con problemas de memoria y/ordemencia entre 1992 y 2005.

Fueron evaluados en la Rush Memory Clinic por posible demencia y aceptaron la donación de cerebro como parte del núcleo clínico del Rush Alzheimer'sDisease Core Center. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico de la Universidad Rush.

Tras el fallecimiento, los familiares dieron su consentimiento para la realización de la autopsia. La categoría diagnóstica cognitiva general del paciente fue demencia de Alzheimer sin otras causas de deterioro cognitivo51, mientras que el intervalo post-mortem fue de 230 min.

Todos los pasos de manipulación de muestras se realizaron con precauciones BSL{{0}}. Se transfirieron 33 mg de tejido MFC almacenado a -80 grados a tubos LoBind Eppendorf de 1,5 ml (Eppendorf, n.º de catálogo 022431081) con la adición de 0,5 ml de tampón de homogeneización que constaba de urea 8 M, bicarbonato de amonio (ABC) 10 mM y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a pH 7,5.

La homogeneización se logró mediante alteración física aplicando una mano de mortero de pellets accionada por un motor durante 30 s (BioVortexer con SpiralPestle; Biospec 1083 y 1017), antes de agregar 0,5 ml de tampón de homogeneización a temperatura ambiente.

Luego, la muestra se incubó a 37 grados durante 60 minutos a 1200 rpm usando un ThermoMixer para permitir la extracción y desnaturalización de las proteínas celulares. La granulación del material insoluble en urea se logró con centrifugación a 18,{5}}g durante 20 minutos a 22 grados, y luego el sobrenadante resultante se añadió a 3 ml de tampón de lavado (WB; urea 8 M, ABC 10 mM, pH 7). .5) dentro de un filtro de corte de peso molecular (MWCO) de 4 ml y 100 kDa para eliminar especies de MW grandes.

Después de 1 h de centrifugación a 22 grados y 5000 g, el volumen del retenido fue de 200 µL y el volumen del filtrado fue de 3,8 ml. Se transfirieron 3,8 ml del filtrado a un filtro MWCO de 3 kDa para eliminar contaminantes de moléculas pequeñas y péptidos de bajo PM.

El filtro MWCO de 3 kDa se centrifugó a 22 grados y 7300 g durante 1 h, dando un volumen retenido de 200 μl. Se lavaron una vez más 200 μl de retenido del filtro MWCO de 100 kDa diluyéndolo a 4 ml con WB y filtrándolo nuevamente a través del mismo filtro.

Este flujo se añadió al mismo filtro MWCO de 3 kDa como se mencionó anteriormente y se concentró una vez más.

Los 200 μL finales de retenido del lavado del filtro MWCO de 3 kDa se transfirieron a un tubo LoBindEppendorf de 1,5 ml. Para acidificar la muestra, se agregaron 10 µL de ácido fórmico (AG) al 10 %, lo que dio como resultado una concentración de AG del 0,5 % en la muestra final.

La muestra se centrifugó a 18,000g durante 15 minutos para eliminar el material precipitado antes de medir la concentración de proteína utilizando el ensayo del ácido bicinconínico (BCA).

Los estándares de albúmina sérica bovina se prepararon en urea 8 M, ABC 10 mM y 0.5 % de FA para tener en cuenta cualquier contribución potencial del tampón al ensayo BCA. Se determinó que la concentración de proteína mediante el ensayo BCA era 1,1 mg/mL, lo que corresponde al rendimiento final de 0.22 mg de proteína total recuperada en la muestra de ~200 μL. La muestra se se diluyó a 0,5 mg / ml con WB que contenía 0,5% de FA y se almacenó a -80 grados hasta el análisis LC-MS.

Debemos tener en cuenta que los experimentos iniciales (datos no publicados) que utilizaron un cóctel tradicional de inhibidor de proteasa/fosfatasa dentro de nuestro tampón de homogeneización condujeron a resultados engañosos del ensayo BCA y LC-MS debido a la retención de varios componentes del cóctel por el filtro 3KMWCO.

Además, muchos de los inhibidores de fosfatasa y proteasa comúnmente utilizados son químicamente incompatibles con agentes reductores como el TCEP. Teniendo en cuenta estas incompatibilidades, y que se esperaría que las condiciones fuertemente desnaturalizantes de la urea 8 M con TCEP 10 mM inactivaran la mayoría de las proteasas, creímos que la degradación proteolítica aún se minimizaría en estas condiciones.

Análisis LC-MS/MS y configuración FAIMS

Las muestras se analizaron utilizando un sistema Waters NanoACQUITY UPLC con fases móviles que consisten en {{0}}. 2 % de FA en H2O (fase móvil A) y 0,2 % de FA en ACN (fase móvil B).

Tanto la precolumna de captura (100 μm de diámetro interior, 5 cm de longitud) como la columna analítica (75 μm de diámetro interior, 50 cm de longitud) eran lechadas empaquetadas con el material de relleno C2 (5 y 3 μm para trampa/analítico, respectivamente, 300 Å, tecnología de métodos de separación). . Las muestras se cargaron en un bucle de 5 μL, correspondiente a 2,5 ug de la cantidad de material cargado, y se inyectaron en la columna de captura con un flujo isocrático del 5% b a 3 μL/min durante 20 min.

La separación se realizó con un gradiente de b del 5 al 50% durante 180 min a 300 nl/min. Para el análisis MS/MS de proteínas, el sistema NanoACQUITY se conectó a un espectrómetro de masas Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid equipado con la interfaz FAIMS Pro.

Los parámetros de la fuente incluyeron un voltaje de electropulverización de 2,2 kV, una temperatura del capilar de transferencia de 275 grados y una amplitud de radiofrecuencia del embudo de iones del 60 %. FAIMS se ajustó a una resolución estándar sin flujo de gas portador controlado por el usuario y un voltaje de dispersión de −5 kV (equivalente a un campo de dispersión de −33,3 kV/cm),50 mientras que el CV variaba dependiendo del experimento (denominado "paso externo ").

Fusion Lumos se configuró en el modo de aplicación "proteína intacta", que reduce la presión de disociación de la trampa C (HCD) de la célula N2 de mayor energía a 2 mTorr, y los datos se recopilaron como un perfil completo. Los datos de MS1 y MS2 se adquirieron con una resolución de 120k y 60k, microescaneos de 3 y 2, en un rango de 500–2,000 m/z y 400–2,000 m/z, y con Objetivos AGC de 5 × 106 y 5 × 105, respectivamente.

MS1 y MS2 también se adquirieron con un tiempo de inyección máximo de 400 ms. Las configuraciones dependientes de los datos incluyeron una selección de los 6 iones más intensos, la exclusión de iones por debajo del estado de carga5+, la inclusión de estados de carga indeterminados y la exclusión dinámica después de una observación durante 30 s.

Los iones seleccionados para MS2 se aislaron en una ventana de ±1,5 m/z y se fragmentaron mediante disociación inducida por colisión (CID) con una energía de colisión del 35%. Utilizamos CID en lugar de HCD debido a la menor dependencia de la energía de colisión normalizada para lograr espectros de fragmentación de proteínas interpretables, priorizando así la amplitud de nuestras observaciones de proteoformas sobre la cobertura de secuencias.

Los conjuntos de datos para cada CV FAIMS se recopilaron por triplicado. Todos los archivos sin procesar se han depositado en el repositorio de datos MassIVE y se puede acceder a ellos mediante el acceso MSV000086696 o con PXD023607 en ProteomeXchange.

For more information:1950477648nn@gmail.com