El oscurecimiento de la piel se produce como consecuencia de la acumulación del pigmento cutáneo melanina. Para combatir esto, la amplitud de los agentes para aclarar la piel están disponibles comercialmente, la mayoría de los cuales inhiben la síntesis de melanina. La decoloración de la melanina es un método alternativo para aclarar la piel. En este estudio, mostramos que la lignina peroxidasa (LiP), una enzima extracelular purificada de Phanerochaete chrysosporium NK-1 aislada del suelo forestal, puede degradar y decolorar la melanina in vitro de manera eficaz. Se investigaron las condiciones de decoloración, incluidos el pH, la temperatura, el tiempo de incubación, la concentración de enzimas y la adición de mediadores, para optimizar las condiciones de reacción. Los resultados indican que pH 3, 40 grados, 15 UI/ml y 10 h de incubación fueron las condiciones óptimas para la decoloración de la melanina. El uso del mediador, el alcohol veratrílico, también resultó efectivo para mejorar la eficacia de la descolonización de la melanina, con hasta un 92 por ciento de decoloración. Los resultados del microscopio electrónico de barrido mostraron espacios vacíos en los gránulos de melanina tratados en comparación con la muestra no tratada, lo que indica la degradación de la melanina. Se observaron cambios en la región de la huella dactilar de la melanina. Entre los números de onda 1500-500 cm-1, por ejemplo, la presencia de nuevos picos en la melanina tratada en 1513, 1464 y 1139 cm-1 CH2, CH3 bend y C-O-C stretch representaron cambios estructurales. También se detectó un nuevo pico a 2144 cm−1 (tramo alquinilo C≡C) en la melanina decolorada. El estudio de citotoxicidad ha demostrado que la melanina y el LiP tratados tienen efectos citotóxicos bajos; sin embargo, el mediador del alcohol veratrílico podría provocar una alta mortalidad, lo que sugiere que su uso debe probarse meticulosamente en la formulación de productos para la salud y el cuidado de la piel. Los hallazgos del estudio sugieren que el LiP producido por Phanerochaete chrysosporium tiene potencial para usarse en las industrias médica y cosmética, particularmente para el desarrollo de agentes blanqueadores cosméticos de base biológica.

Según estudios relevantes, la cistanche es una hierba común conocida como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente es el cistanosido, que tiene diversos efectos como antioxidante, antiinflamatorio y promotor de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche y el blanqueamiento de la piel radica en el efecto antioxidante de los glucósidos de cistanche. La melanina en la piel humana se produce por la oxidación de la tirosina catalizada por la tirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, inhibiendo así la producción de melanina.

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La melanina es un grupo de pigmentos cutáneos biopoliméricos policíclicos complejos, recalcitrantes y penetrantes producidos por células cutáneas especializadas llamadas melanocitos 1,2. Su función principal es proteger la piel contra las dañinas radiaciones UV de la luz solar al formar capas supranucleares alrededor del ADN de las células de la piel 3. Además, es responsable de los diferentes colores de la piel al absorber varios radicales libres dentro del citoplasma. La mayoría de estos agentes para aclarar la piel obtenidos de recursos naturales inhiben la producción de melanina en las células de la piel mediante la inhibición de las enzimas tirosinasa, la supresión de la biosíntesis de pigmentos y a través de algunas vías alternativas. Varios compuestos como la hidroquinona, los éteres monobencílicos de hidroquinona, el mercurio, los corticosteroides y la arbutina se utilizan en la formulación comercial de cosméticos para blanquear la piel; sin embargo, sus aplicaciones se han asociado con efectos secundarios graves. Por ejemplo, se informa que el mercurio causa daño a los riñones y que el plomo causa ansiedad, depresión y psicosis 4,5. El uso de corticoides puede causar síndrome de Cushing, diabetes, hipertensión, insuficiencia suprarrenal, inmunosupresión, adelgazamiento de la piel, acné, dermatitis e hipertricosis 6. Tain et al. (2009) informaron que el uso de arbutina en cosméticos para blanquear la piel fue efectivo para concentraciones de hasta el 3 por ciento, pero un mayor aumento en la concentración provocó efectos citotóxicos. Teniendo en cuenta estas limitaciones, las autoridades sanitarias y de seguridad han criticado ampliamente las aplicaciones de estos inhibidores en cosméticos para blanquear la piel. Se ha propuesto que los cosméticos para blanquear la piel podrían alcanzar hasta US$ 155,44 mil millones para el año 2021 con una tasa de crecimiento anual del 4,9 por ciento. Debido a la creciente demanda de agentes blanqueadores de la piel seguros y naturales en todo el mundo, la descolonización enzimática de melanina ha recibido un interés considerable 7–9.

Las enzimas microbianas extracelulares como la lacasa, la peroxidasa de manganeso y la peroxidasa de lignina (LiP) se han probado previamente para la decoloración de la melanina y se consideran una posible alternativa ecológica a los productos químicos tóxicos 1. Entre estos, se encontró que LiP es muy eficaz para la decoloración. de melanina debido a su alto potencial redox para oxidar el alcohol veratrílico (VA) que las otras enzimas relacionadas. A pesar del alto potencial de oxidación y la catálisis eficiente de la melanina, la producción volumétrica y las dificultades en la purificación son las principales limitaciones para las aplicaciones comerciales de LiP en agentes blanqueadores de la piel. Además, LiP pierde su actividad enzimática para la descolonización de la melanina bajo un exceso de peróxido de hidrógeno, que se considera crítico para la oxidación de la melanina. Además de su importante papel, el H2O2 inactiva el LiP, lo que reduce el rendimiento catalítico de la enzima.

Resultados

Decoloración de la melanina por Phanerochaete chrysosporium NK-1.Las cepas fúngicas se probaron para la decoloración de melanina. Los hongos se inocularon puntualmente en el medio sólido que contenía melanina y VA como inductor de LiP. Después de siete días de incubación, Phanerochaete chrysosporium NK-1 mostró la capacidad de decolorar la melanina, como se muestra en la Fig. 1.

Condiciones para una decoloración óptima de la melanina.pH. La enzima purificada se utilizó para la decoloración de la melanina sintética in vitro. Se observaron los efectos de diferentes condiciones sobre la decoloración de la melanina 10. Primero se examinaron los efectos del pH sobre la decoloración de melanina por LiP. Para ello se realizó la decoloración de la melanina a diferentes condiciones de pH variando de 2.0 a 6.0 a una temperatura de 30 grados tanto en presencia como en ausencia de AV durante un periodo de incubación de 6 h. Los resultados de la Fig. 2 muestran que, en general, la decoloración de la melanina en presencia de VA fue mayor en todas las condiciones de pH. En particular, es más prominente en condiciones de pH más alto. VA puede ayudar en la formación de radicales catiónicos 11. Estos radicales tienen un potencial redox mucho mayor para atacar los enlaces C-C de forma no específica en la melanina y provocar la decoloración 12. En presencia de VA, se logró la mayor decoloración de melanina del 88 % a pH 3 seguido por 71 por ciento a pH 2, mientras que la decoloración de melanina más baja de 39 por ciento se observó a pH 6. En ausencia de VA, la decoloración de melanina más alta de 86 por ciento se observó a pH 3 mientras que la decoloración de melanina más baja de 39 por ciento se observó a pH 3 Se observó una decoloración de melanina del 35 por ciento y del 36 por ciento a pH 5 y 6, respectivamente. La decoloración de melanina por LiP en este estudio fue altamente eficiente en condiciones de pH más bajas, es decir, 2 y 3 (Fig. 2), aunque otros estudios mostraron una condición de pH óptima en 4 1.

Temperatura. La decoloración de la melanina por LiP se estudió a diferentes temperaturas que oscilaban entre 20 y 60 grados tanto en presencia como en ausencia de AV en un período de incubación de 6 h. En ausencia de VA, se observaron porcentajes similares (19 por ciento) de decoloración de melanina a temperatura de 20 y 30 grados (Fig. 3). La decoloración de melanina más alta y más baja en ausencia de AV se observó a 40 y 50 grados, respectivamente. Sin embargo, con VA en la solución, la decoloración de melanina aumentó de 20 a 40 grados y disminuyó hasta 60 grados. En presencia de VA, la mayor decoloración de melanina es de aproximadamente 60 por ciento a 40 grados. La decoloración es generalmente más baja porque el experimento se realizó en una condición de pH más suave.

concentración de LiP. También se examinó la decoloración de la melanina con variaciones en las concentraciones de enzima. Se examinaron cinco concentraciones diferentes, es decir, 5, 10, 15, 20 y 25 UI/mL de LiP para la decoloración de melanina en presencia y ausencia de VA, como se muestra en la Fig. 4. Sorprendentemente, la concentración de enzima más efectiva fue 15 UI/ml para ambas soluciones con y sin VA. Después de un período de incubación de 6 h, la decoloración de melanina más alta fue del 92 % en presencia de VA y del 70 % en ausencia del mediador utilizando una concentración de enzima de 15 UI/mL, mientras que la decoloración de melanina más baja del 23 % se observó en la ausencia de AV utilizando 5 UI/mL de LiP. No está claro que la decoloración sea menos efectiva con altas concentraciones de enzima, es decir, 20 y 25 UI/ml (Fig. 4).

Tiempo de incubación. Los experimentos de decoloración se realizaron a las 2, 4, 6, 8 y 10 h de incubación. Estas reacciones también se llevaron a cabo en presencia y ausencia de VA. Los resultados mostraron que la eficacia de la decoloración se correlaciona positivamente con el tiempo de incubación, como se esperaba (Fig. 5). El aumento de la extensión de la deslocalización fue más prominente en la incubación inicial. La mayor decoloración de melanina (68 por ciento) se observó después de un período de incubación de 10 h en presencia de VA y 59 por ciento en ausencia de VA. La decoloración de melanina fue tan baja como 15 por ciento después de 2 h de incubación sin AV. Por lo tanto, basándonos en los resultados de las pruebas, hemos concluido que las condiciones óptimas son pH 3, 40 grados, 15 UI/ml y 10 h de incubación.

Análisis SEM (microscopio electrónico de barrido) y FTIR (espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier).Los cambios morfológicos y estructurales en la melanina se caracterizaron por SEM y FTIR, respectivamente. La melanina decolorada fue analizada por SEM para observar cambios morfológicos en la superficie. Como control se usó melanina sintética sin ningún tratamiento enzimático. Como se muestra en la Fig. 6, había un espacio vacío en los gránulos de melanina tratados en comparación con la muestra no tratada, lo que sugiere que la enzima atacó las partículas de melanina.

La melanina decolorada también se analizó mediante FTIR con la melanina no tratada como control (Fig. 7). Se obtuvieron las huellas dactilares moleculares de la melanina decolorada y no tratada y se compararon para confirmar cualquier cambio estructural en la melanina tratada 13. Los espectros FTIR de la melanina (C18H10N2O4) mostraron un amplio espectro de absorción a 3272 cm−1 que podría atribuirse a la característica O –H estirando o N–H estirando las vibraciones del ácido carboxílico y los grupos fenólicos. Los cambios en el espectro FTIR de la melanina tratada fueron notables. La banda ancha en números de onda de 3000–3500 cm−1 indica la presencia de grupos -NH y -OH tanto en las muestras de control como en las tratadas. Sin embargo, la intensidad de la muestra tratada es significativamente mayor que la muestra de control, lo que sugiere que el tratamiento tuvo adiciones de estos grupos funcionales a la estructura por ataques enzimáticos. Los picos en 2884,4 cm-1 y 2822 cm-1 indicaron la presencia de grupos alquilo en el control, mientras que en la melanina decolorada, el pico en el número de onda 2884,4 cm-1 estaba ausente. El pico de 2822 cm-1 se desvió a la longitud de onda de 2835,92 cm-1, lo que también representó los cambios estructurales en la melanina tratada en esta región. El pico en el número de onda 1710 cm−1 en el control se atribuyó a la presencia de ácido carboxílico. Este pico también estuvo ausente o se redujo en gran medida en la melanina decolorada, lo que nuevamente confirma los cambios estructurales en la melanina tratada. También hubo algunos cambios en la región de la huella digital. Entre los números de onda 1500-500 cm-1, por ejemplo, la presencia de nuevos picos en la melanina tratada en 1513, 1464 y 1139 cm-1 representó cambios estructurales. También se detectó un nuevo pico a 2144 cm−1 en la melanina decolorada.

Efectos de citotoxicidad.La citotoxicidad de la melanina degradada y el LiP se investigó utilizando el método de citotoxicidad de camarones en salmuera 14,15. En el presente estudio, los efectos citotóxicos de la melanina y el LiP tratados fueron bajos con tasas viables de larvas de camarón mayores o iguales al 90 por ciento (Tabla 1). El aumento en la concentración de LiP no tuvo impacto en la viabilidad de las larvas de camarón hasta 80 ul/mL (~80 UI/ml), lo que sugiere su baja actividad citotóxica. En los controles positivos con VA, la tasa de mortalidad fue del 100 por ciento, lo que sugiere que se debe tener precaución durante la aplicación de LiP en presencia de VA como mediador en el campo médico y cosmético.

Discusión

En el caso de la temperatura, el mayor crecimiento de hongos y producción de enzimas se logró a 40 grados, que corresponde al hábitat natural de P. chrysosporium. La capacidad de LiP para degradar la melanina se basa en la similitud estructural entre la melanina y la lignina 18. La eficacia de la degradación de melanina por LiP in vitro se ha correlacionado con varios factores, como el pH, la temperatura, la concentración de enzimas y el tiempo de incubación. como la existencia de VA. Un liP puede oxidar VA a sus radicales catiónicos (VA∙ plus) y servir como un mediador redox que decolora aún más la melanina, como se muestra en la Fig. 8.

El H2O2 es un sustrato esencial como aceptor final de electrones durante la decoloración de la melanina. LiP se inactiva fácilmente en su exceso de concentración, lo que induce la ruptura de la estructura hemo o la formación del compuesto inactivo III. Se informa que este efecto inhibidor puede ser atenuado por la oxidación de VA a radical catiónico VA 1 . LiP oxida VA a radicales catiónicos VA, que actúa como un mediador redox para decolorar la melanina. VA es un compuesto natural producido a partir de hongos de podredumbre blanca que se espera que tenga menos efectos secundarios. Sin embargo, la presencia del mediador VA ha resultado en una alta mortalidad de los organismos probados, en comparación con los bajos efectos citotóxicos de la melanina y el LiP tratados. Debe probarse cuidadosamente en la formulación de productos para la salud y el cuidado de la piel.

Materiales y métodos

Aislamiento e identificación de cepas fúngicas.El aislamiento fúngico se realizó de un sitio contaminado utilizado como vertedero de materiales de madera durante mucho tiempo. La muestra se tomó en frascos estériles y se trasladó al laboratorio para su purificación. La purificación se realizó en un medio de agar dextrosa litoral. Se aislaron y purificaron cuatro colonias fúngicas diferentes de la muestra. La selección de la mejor cepa se realizó en base a la decoloración de melanina y la producción de biomasa en presencia de melanina como única fuente de carbono en el medio de sal mineral (MSM). Sobre la base de la selección, el organismo seleccionado se identificó mediante la secuenciación del ADN de rRNA 5.8S y rRNA 18S utilizando los cebadores universales ITS-1 e ITS-4 10. Su ADN genómico se extrajo según el método de Anderson et al. 19. Después de la purificación, se realizó la secuenciación de los productos de la PCR. Las secuencias se alinearon usando la herramienta BLAST en el NCBI y se analizó la filogenia de los homólogos usando Análisis Genético Evolutivo Molecular (MEGA). Basado en una máxima verosimilitud, se construyó un árbol de unión de vecinos para la identificación de la cepa fúngica aislada. Las secuencias se enviaron al NCBI GenBank con un número de acceso KX064682.1. El análisis filogenético reveló que el aislado KX064682.1 era una cepa de Phanerochaete chrysosporium NK-1.

Ensayo en placa para la decoloración de melanina.El hongo de la podredumbre blanca, Phanerochaete chrysosporium NK-1, se usó para la decoloración de la melanina. Se sabe que Phanerochaete chrysosporium produce LiP. Se utilizó melanina sintética (B049-97–6) como melanina modelo en todos los experimentos de decoloración de melanina. Se usó un medio modificado con VA2 como inductor de LiP para probar la capacidad de decoloración de melanina del hongo. Se usaron placas de Petri para cultivar Phanerochaete chrysosporium NK-1. El medio se preparó disolviendo 10 g de glucosa, 2 g de extracto de malta, 4 g de MgSO4·7H2O, 1 g de KH2PO4, 0.01 g de FeSO4, 0,005 g de ZnSO4, 0,2 g de melanina sintética y 15 g de agar en 1-L de agua destilada. Las placas de Petri inoculadas se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad. Se observó la medida en que la melanina se decoloraba debajo y alrededor de la colonia del hongo. Se encontró que el hongo es capaz de decolorar la melanina y además se usa para preparar soluciones enzimáticas.

Preparación de enzima para la decoloración de melanina.El medio líquido del cultivo contenía 10 g de glucosa, 0.2 g de extracto de levadura, 0.07 g de VA, 3.{{13 }} g de ácido tartárico, 1 g de tween 80, 0,2 g de KH2PO4, 0,146 g de CaCl2·2H2O, 0,157 g de K2HPO4, 0.05 g de MgSO4·7H2O, 42,5 mg de ZnSO4·7H2O, 7.0 mg de CoCl2·6H2O, 7.0 mg de CuCl2·2H2O, 0,54 mg de FeCl3, 0,9 mg de NaCl y 0,2 mg de melanina sintética por litro de agua destilada 20. El pH del medio se ajustó a 4,0 con soluciones de NaOH y HCl. Se esterilizaron en autoclave matraces de 250 ml que contenían alícuotas de 100 ml de medio de cultivo y se inocularon con un inóculo de 5 ml. A continuación, los matraces se incubaron en un agitador rotatorio a 30 grados durante 15 días. Se recolectaron muestras duplicadas para ensayos de actividad de LiP en un intervalo de 24 h.

Ensayo de enzimas.Los reactivos para el ensayo de LiP incluyeron tampón de tartrato de sodio 250 mM pH 5,5, VA 10 mM y H2O2 4 mM (30 por ciento). El ensayo enzimático se llevó a cabo en una cubeta de sílice y la absorbancia se midió a 310 nm con un espectrofotómetro UV-visible (Shimadzu, Kyoto, Japón). La absorbancia se controló en tiempos de 0 a 30 s en condiciones ambientales. La actividad de la enzima se calculó según la Ley de Beer, Eq. (1) 21.

donde c, es la concentración de la especie de atenuación; A es la absorbencia óptica; ε es el coeficiente de atenuación molar; d es la longitud del camino óptico. La medición de la actividad enzimática implica la determinación del cambio en la concentración a lo largo del tiempo, Eq. (2).

Optimización para producción mejorada de LiP y decoloración de melanina in vitro.La optimización para la producción mejorada de LiP a partir de Phanerochaete chrysosporium NK-1 usando melanina como sustrato se llevó a cabo usando un diseño de Placket Burman. Un Placket de longitud completa se basó en el hecho de que socava los efectos interactivos entre diferentes variables, mientras que considera solo tendencias lineales, Eq. (3) 22.

donde Y representa la respuesta y los símbolos indican el coeficiente de regresión y k es el número de factores estudiados. Se estudiaron un total de 9 factores para lograr la mayor concentración de LiP de Phanerochaete chrysosporium NK-1 para la decoloración de la melanina presente en el medio. El diseño de Placket-Burman se construyó con un total de 12 corridas experimentales, como se muestra en la Tabla 2. Los experimentos se realizaron durante un total de 35 días y se midió la respuesta (actividad LiP UI/mL). Los datos experimentales se analizaron utilizando el software estadístico 'Design Expert 9'. El medio optimizado se utilizó para la producción mejorada de LiP y se purificó mediante precipitación con amonio.

Optimización de la producción y purificación de enzimas.Se utilizó un medio sumergido para determinar el tiempo de incubación óptimo en términos de actividades de LiP. Como se muestra en la Fig. 1 complementaria, la solución de cultivo tiene una actividad enzimática máxima en el octavo día, siendo 140 UI/ml. Por lo tanto, se usó un tiempo de incubación de 8 días para producir la solución enzimática.

Se realizaron un total de 12 experimentos para determinar los factores (9) que tienen impacto en las actividades de LiP. Entre las pruebas, los valores de respuesta de la actividad de LiP oscilan entre 171 UI/ml y 576 UI/ml, como se muestra en la Fig. 2 complementaria. 10 (547 UI/ml). Según el análisis de regresión, la temperatura, el tiempo, la concentración de glucosa, la concentración de sustrato y el mediador tienen efectos positivos sobre la actividad de LiP. Se encontró que el efecto del extracto de levadura era insignificante. Otros factores tienen efectos negativos. Las condiciones óptimas para la producción de LiP son tiempo: 35 días, temperatura: 40 grados, glucosa (por litro): 20 g, fructosa: 10 g, extracto de levadura: 2 g, peptona: 2 g, inóculo: 10 ml, sustrato mediador: 0,1 mililitros Estas condiciones se usaron luego para la producción mejorada de LiP que se purificó mediante precipitación con amonio y métodos de cromatografía en gel (Sephadex G-75).

Se realizó la extracción enzimática a pH, temperatura y tiempo de incubación optimizados. Se usó la columna de filtración en gel Sephadex G75 para separar la fracción del contenido de proteína del lisado celular en relación con el gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La abundancia de proteínas en el extracto crudo también se indicó a través del número de bandas que aparecían en un análisis de gel de dodecil poliacrilamida de sodio (SDS-PAGE). El peso molecular de la enzima purificada fue de 46,0 kDa calculado a partir del análisis SDS-PAGE (Fig. 3 complementaria). Las actividades enzimáticas después de la precipitación con amonio y la purificación por cromatografía en gel son 684,0 y 957,6 UI/ml, respectivamente.

La enzima purificada se usó para la decoloración de la melanina en diferentes condiciones fisicoquímicas, incluido el pH, la temperatura, el tiempo de incubación y la concentración de la enzima. Se usó melanina sintética (B049-97-6) como melanina modelo en todos los experimentos de decoloración de melanina según 23.

Experimentos de decoloración.Efectos del pH sobre la decoloración de la melanina. Para observar los efectos del pH en la decoloración de la melanina por LiP, se llevaron a cabo reacciones de decoloración de la melanina a un pH que se extendía desde 2.0– 6.0. La mezcla de reacción contenía 10 µl de la enzima cruda disuelta en un tampón TE y 1990 µl de melanina al 0,02 por ciento p/v. Estas reacciones se realizaron tanto en presencia como en ausencia de VA. Las mezclas de reacción se incubaron a una temperatura de 30 grados durante 6 h. Los experimentos de control se realizaron en paralelo reemplazando el LiP activo con la enzima desnaturalizada que se hirvió a 95 grados. Se controló la decoloración de melanina de las mezclas de reacción usando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm antes y después de la incubación. La eficiencia de decoloración de la enzima se expresó en porcentaje ( por ciento ). La decoloración de melanina se calculó mediante la ecuación. (4) 11.

Efectos del tiempo de incubación sobre la decoloración de la melanina. Para optimizar el tiempo de incubación, las reacciones de decoloración de melanina se llevaron a cabo en tiempos de incubación que se extienden de 2 a 10 h. La mezcla de reacción contenía 10 µl de la enzima cruda disuelta en un tampón y 1990 µl de melanina al 0,02 por ciento p/v a pH 4 en presencia y ausencia de VA. A continuación, las mezclas de reacción se incubaron a una temperatura de 30 grados y se obtuvo el porcentaje de decoloración por melanina.

Análisis SEM de melanina degradada. Los cambios morfológicos superficiales de la melanina se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido (JEOL JSM-5910, Peabody, MA, EE. UU.) 24. Se usó melanina no tratada como control. Las muestras fueron secadas y fijadas sobre tacos de cobre (10x10mm2) con cinta de carbón de doble cara (pegajosa por ambas caras). Los talones se lavaron con detergente y se secaron con un secador de pistola de calor (KADA 85U/SMD) a 200 grados durante 2 minutos antes de la fijación de la muestra. Se utilizó conducción de pasta de plata (SPI-CHEM, West Chester, PA, EE. UU.) para garantizar la conducción del haz de electrones. El oro se depositó sobre la muestra con plasma creado con condiciones de alto voltaje (25 mA de corriente durante 50 s) y vacío (10−2 ATM). La morfología superficial de las muestras se examinó con un aumento de 3000.

Análisis FTIR de melanina decolorada.Las reacciones o muestras que mostraron la mayor decoloración de melanina en el experimento de optimización se analizaron adicionalmente mediante espectroscopia FTIR (Modelo No 56, Merlin, Alemania). Las muestras se centrifugaron (10,000 rpm durante 1 min) y se secaron al aire como paso de preparación para el análisis FTIR 20. Se realizó un análisis cualitativo de las muestras de melanina utilizando un espectrómetro UV-Vis de infrarrojo cercano (NIR). Instrumentos Lambda 900/Perkin Elmer. Los espectros se registraron en el rango de 1000 a 3500 cm−1. Las muestras se prepararon en gránulos de KBr con dispersión de polvo. La melanina sintética sin tratar se usó como control en este análisis.

Citotoxicidad de melanina degradada y LiP.Se realizaron pruebas de letalidad de camarones de salmuera para verificar la citotoxicidad de la melanina degradada 14,15. Los huevos de los camarones en salmuera se incubaron en un plato rectangular con agua de mar artificial. El plato contenía un separador de plástico con pequeños agujeros y dividía el plato en dos compartimentos desiguales. Los huevos se salpicaron en el compartimento más grande y se cubrieron para evitar la penetración de la luz, mientras que el compartimento más pequeño se iluminó con una lámpara encima. Las larvas nacidas fueron atraídas por la luz hacia el pequeño compartimento. Después de 48 h de incubación, los nauplios maduros se recolectaron del compartimiento iluminado usando una pipeta pasteurizada.

Análisis estadístico.Los datos experimentales se analizaron utilizando el software estadístico 'Design Expert 9'. Las imágenes gráficas se dibujaron utilizando los medios de tres ensayos experimentales con desviación estándar calculada. La significación estadística de la ejecución experimental se calculó mediante ANOVA.

Disponibilidad de datos

Referencias

4. Clarkson, TW, Magos, L. & Myers, GJ Te toxicología del mercurio: exposiciones actuales y manifestaciones clínicas. N. ingl. J.Med. 349, 1731–1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. Tratamientos tópicos para el melasma y la hiperpigmentación posinflamatoria. Terapia de la piel Lett. 11, 1–6 (2006).

6. Hughes, J. & Rustin, M. Corticosteroides. clin. Dermatol. 15, 715–721 (1997).

7. Płonka, P. & Grabacka, M. Síntesis de melanina en microorganismos: aspectos médicos y biotecnológicos. Acta Biochim. polaco 53, 423–443 (2006).

8. Lim, Y.-J. et al. Efectos inhibitorios de la arbutina sobre la biosíntesis de melanina de la hiperpigmentación inducida por hormonas estimulantes de melanocitos en tejidos de piel de cobayo marrón cultivados. Arco. Res. Farmacéutica 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Revisión de los productos para aclarar la piel. En t. J. Cosmet. ciencia 25, 169–181 (2003).

10. Rättö, M., Chatani, M., Ritschkof, A.-C. & Viikari, L. Detección de microorganismos para la decoloración de melaninas producidas por hongos de tinción azul. aplicación Microbiol. Biotecnología. 55, 210–213 (2001).

11. Nagasaki, K. et al. Purificación, caracterización y clonación de genes de Ceriporiopsis sp. cepa MD-1 peroxidasas que decoloran la melanina del cabello humano. aplicación Reinar. Microbiol. 74, 5106–5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas, FJ & Martínez, Á. T. Degradación microbiana de la lignina: cómo se recicla eficientemente un polímero recalcitrante voluminoso en la naturaleza y cómo podemos aprovechar esto. Microbio. Biotecnología. 2, 164–177 (2009).

13. Holmes, EW y Tompson, KD (Patentes de Google, 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Citotoxicidad del camarón de salmuera, propiedades antiinflamatorias y analgésicas de las flores de Woodfordia fruticosa Kurz. Irán. J. Pharm. Res.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. Pruebas de toxicidad de materiales dentales restaurativos usando larvas de camarón de salmuera (Artemia salina). Aplicación J. Ciencia oral.

16, 297–301 (2008). 16. Falade, AO et al. Funcionalidades de la lignina peroxidasa y posibles aplicaciones. Microbiologíaopen 6, e00394.

17. Sung, HJ Decoloración de la melanina por la lignina peroxidasa con H2O2 generado in situ para la aplicación de cosméticos blanqueadores (2020).

18. Pérez, J., Muñoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. Biodegradación y tratamientos biológicos de celulosa, hemicelulosa y lignina: una visión general. En t. Microbiol. 5, 53–63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW Tipificación molecular mediante amplificación aleatoria de ADN polimórfico e hibridación sureña M13 de aislados emparejados relacionados de Aspergillus fumigatus. J. Clin. Microbiol. 34, 87–93 (1996).

20. Sabar, MA et al. Degradación de carbón de bajo rango por Rhizopus oryzae aislado de una mina de carbón paquistaní y sus liberaciones mejoradas de sustancias orgánicas. Combustible 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. & Yadava, S. Purificación, caracterización y actividad de despolimerización del carbón de la lignina peroxidasa de Lenzitus betulina MTCC-1183. aplicación Bioquímica Microbiol. 48, 583–589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. & Arunkumar, C. Aplicación del diseño de Plackett-Burman para la selección de los componentes de los medios para la producción de tanasa a partir de la cáscara del programa mediante fermentación sumergida. En t. J. Pharm. Res. Rev. 2, 24–29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS y Kim, EK Decoloración de la melanina por la lignina peroxidasa de Phanerochaete chrysosporium. Biotecnología. bioproceso. Ing. 9, 256 (2004).

24. Karp, JM et al. El cultivo de células madre embrionarias humanas sin el paso del cuerpo embrioide mejora la osteogénesis in vitro. Stem Cells 24, 835–843 (2006).

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