Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol rescata los déficits de DA al modular la activación de la microglía pero no el estrés oxidativo

Abstracto: Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) se aisló del hongo medicinal específico de Taiwán Antrodia camphorate, que es conocido por su promoción de la salud y anti- Efectos del envejecimiento en la medicina popular. La enfermedad de Alzheimer (EA) es una de las principales enfermedades asociadas al envejecimiento. Investigamos la eficacia y el mecanismo potencial del ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol para los síntomas de EA. Drosophila con la sobreexpresión panneuronal de amiloide humano (A) se usó como modelo de AD. Comparamos la vida útil, la función motora, el aprendizaje, la memoria, el estrés oxidativo y los biomarcadores de la activación de la microglía y la inflamación de la ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol- grupo tratado a los del control no tratado. Ergosta-7,9(11), el tratamiento con 22-trien-3 -ol mejoró de manera efectiva la vida útil, la función motora, el aprendizaje y la memoria del modelo de EA en comparación con el control sin tratar. Se redujeron los biomarcadores de activación e inflamación de la microglía, mientras que la peroxidación lipídica ubicua, la actividad de catalasa y la actividad de superóxido dismutasa permanecieron sin cambios. En conclusión, el ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol rescata los déficits de AD al modular la activación de la microglía pero no el estrés oxidativo.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y tiene la capacidad de eliminar las especies reactivas de oxígeno y prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres, y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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Palabras clave: enfermedad de Alzheimer; drosófila; EK100; ergosta-7,9(11),22-probado-3 -ol

1. Introducción

Antrodia camphorata es un hongo medicinal exclusivo de Taiwán y fue un cultivo económico importante para el comercio exterior de Taiwán en el siglo XIX [1]. El primer libro de historia de Taiwán, Tâi-uân Thong-sú (literalmente, la Historia general de Taiwán), registró los usos médicos indígenas del alcanforato de Antrodia, incluida la eliminación de patógenos, "mejora de la salud", "vigorización de la sangre", "desintoxicación de alcohol", " proteger el hígado" y "antienvejecimiento" [2–4]. Dado que enfrentamos un desafío de salud de la población mundial debido al envejecimiento [5], el estudio científico de la medicina indígena para aprovechar el conocimiento antienvejecimiento es crucial.

Entre las principales enfermedades asociadas con el envejecimiento, como la degeneración macular, la aterosclerosis, el cáncer y los accidentes cerebrovasculares, la enfermedad de Alzheimer (EA) es un hueso duro de roer debido a su elusivo mecanismo patológico. Todavía no se dispone de un tratamiento modificador de la enfermedad eficaz para la EA [6]. Las hipótesis patológicas actuales de la EA incluyen, entre otras, reducciones en la colina acetiltransferasa, excitotoxicidad del glutamato, agregación de amiloide beta (A), fosforilación de tau, resistencia a la insulina cerebral [7] y alteraciones del microbioma intestinal [8]. Sin embargo, sin importar el tipo de causas que inician la EA involucradas, el estrés oxidativo y la activación de la microglía inflamatoria son los signos comunes que acompañan a la neurodegeneración de la EA [9,10]. Curiosamente, la neuroinflamación y el estrés oxidativo son eventos interrelacionados que se observan tanto en la EA como en la patología de la EA. Por un lado, las placas seniles de depósito de A desencadenan reacciones inflamatorias, activación de la microglía, liberación de citoquinas y astrocitosis, lo que lleva a consecuencias indeseables como daño neuronal progresivo y, finalmente, disfunciones cognitivas. La activación de las respuestas inmunitarias puede inicialmente combatir los patógenos invasores con A o eliminar los depósitos excesivos de A; sin embargo, el proceso inevitablemente produce especies reactivas de oxígeno (ROS), que pueden causar daño neuronal en el microambiente. Por otro lado, A podría causar ROS de manera independiente de la inflamación. Por ejemplo, A se encontró en las membranas mitocondriales de AD post mortem y podría ingresar a las mitocondrias, causando la interrupción de la cadena de transporte de electrones (ETC) y dando como resultado la generación de ROS. Las ROS elevadas pueden, a su vez, desencadenar la liberación de citocinas e iniciar la inflamación [7,9,10]. Por lo tanto, las moléculas antioxidantes y antiinflamatorias podrían ser terapias potenciales para la EA.

El alcanforato de Antrodia, especialmente uno de sus compuestos sumergidos aislados en caldo entero ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (también conocido como EK100), exhibió un profundo poder antioxidante y anti -actividades inflamatorias [11-13]. Además, Chang et al. [14] han demostrado que el antroquinonol, otro compuesto aislado del micelio fermentado del alcanforato de Antrodia, mejora el aprendizaje y la memoria en un modelo de ratón con AD con astrogliosis y estrés oxidativo reducidos. Sin embargo, las relaciones causales entre la reducción de la astrogliosis y el estrés oxidativo tras el tratamiento con antroquinonol no pudieron confirmarse, y se ha postulado que la reducción del estrés oxidativo es el factor mediador [14]. La seguridad de EK100 se probó previamente siguiendo la directriz 407 de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) en un modelo de ratones de 10 y 20 mg/kg-día [15]. Por lo tanto, adoptamos concentraciones aproximadamente equivalentes de alimentación libre para moscas de la fruta en este estudio.

El modelo de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) de sobreexpresión de A 42 es un modelo animal de EA bien establecido [16], con síntomas característicos de EA que incluyen una vida útil reducida, déficits motores y de aprendizaje [17], estrés oxidativo [18] y activación microglial [19]. Los desafíos del modelado de AD en Drosophila melanogaster incluyen la ausencia de actividad BACE en Drosophila y las diferencias de género, que muestran síntomas más graves en los archivos masculinos. Estos no se observan en la EA humana [20]. Por lo tanto, adoptamos moscas que expresan el péptido A 42 humano para modelar AD, donde la producción de A 42 no requiere actividad BACE. En este estudio, probamos si EK100 mejora los síntomas de la EA y, lo que es más importante, si tanto la modulación del estrés oxidativo como la astrogliosis son esenciales para mejorar la EA.

2. Resultados

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Rescatado Supervivencia y escalada de AD Drosophila

El diagnóstico de EA se asocia con una reducción de la mediana de vida [21], y casi la mitad de los pacientes con EA sufren alteraciones de la actividad [22]. Por lo tanto, probamos si el extracto de Antrodia camphorata ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) mejora la supervivencia y la capacidad de escalada de un Modelo AD Drosophila. Encontramos que el tratamiento con 125 o 250 µg/mL de ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol mejoró significativamente la supervivencia de AD Drosophila (p < 0.01) (Figura 1A y la Tabla complementaria S1), pero que solo una dosis alta (250 µg/mL) mejoró la escalada de AD Drosophila (Figura 1B). Dado que los déficits de supervivencia y movilidad son síntomas clínicos de la EA, en las siguientes investigaciones se utilizó la concentración de 250 µg/mL, que mejoró ambos síntomas.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Aprendizaje rescatado y memoria de una hora de AD Drosophila

A continuación, probamos si el tratamiento con ergosta{{0}},9(11),22-trien-3 -ol mejora los defectos de aprendizaje y memoria, un síntoma característico de la EA. Las moscas AD se trataron con ergosta- 7,9(11),22-trien-3 -ol a 250 ug/ml durante 14 días y se sometieron a pruebas de aprendizaje y memoria con T-laberinto. Como se muestra en la Figura 2A, en comparación con el control de tipo salvaje (AD(-)/EK(-)), la capacidad de aprendizaje del control AD ​​(AD(plus)/EK(-)) disminuyó significativamente (p < 0,01), mientras que El tratamiento con ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol mejoró significativamente la capacidad de aprendizaje de los pacientes con EA (p < 0,05). Además, el tratamiento con ergosta-7,9(11), el 22-trien-3 -ol también mejoró la disminución de la memoria de una hora de AD (Figura 2B).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-probado-3 -ol Activación microglial modulada en AD Drosophila

A continuación, probamos si el tratamiento con ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol disminuye la activación microglial en la EA. En la EA, la microglía activada se acompaña de fagocitosis y neurodegeneración [23]. En Drosophila, el marcador de engullimiento de células microgliales y, por lo tanto, el marcador de activación microglial, es la expresión de Draper (Drpr) y el CED aguas abajo [24]. Después del tratamiento con ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol, se sacrificaron las moscas AD y se extrajo el ARN de la cabeza de las moscas para RT-qPCR. Como se muestra en la Figura 3A, ambos Drpr estaban significativamente regulados a la baja en la AD Drosophila tratada con ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol en comparación con la AD no tratada. Esto implica que el ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol disminuyó la activación microglial en AD Drosophila. Además, el tratamiento con ergosta-7,9(11), el 22-trien-3 -ol también redujo la inflamación del SNC, como se revela en la regulación negativa de los genes relacionados con la inflamación (Figura 3B) .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-probado-3 -ol no moduló el estrés oxidativo ubicuo en AD Drosophila

A continuación, probamos si la modulación del estrés oxidativo ubicuo, es decir, de todo el cuerpo, es necesaria para que el ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol rescate la EA. El tratamiento con Ergosta-7,9(11),22-tried- 3 -ol no alteró la peroxidación lipídica (Figura 4A), la actividad de catalasa (Figura 4B), la actividad de superóxido dismutasa (Figura 4C) , o la expresión de genes relacionados con el estrés oxidativo (Figura

3. Discusión

Este estudio informa la eficacia y el posible mecanismo subyacente de ergosta-7,9(11),22-tries-3 -ol, un extracto de alcanforato de Antrodia, para la modificación de los síntomas de la EA usando Drosophila modelo con sobreexpresión humana-A. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol mejoró eficazmente el aprendizaje y la memoria y prolongó la vida útil de los pacientes con EA. Además, se redujeron los biomarcadores de activación e inflamación de la microglía, mientras que el estrés oxidativo ubicuo se mantuvo sin cambios.

Hay muchas fuentes de estrés oxidativo en la EA, que incluyen, entre otras, la activación de la inmunidad innata; por ejemplo, la acumulación de A, la alteración de las mitocondrias por A, la tau hiperfosforilada y el malmetabolismo de metales también son fuentes [25]. Aunque la inflamación y el estrés oxidativo pueden inducirse recíprocamente, podemos suponer que sus cambios sincrónicos solo ocurren bajo circunstancias en las que otras fuentes de estrés oxidativo permanecen constantes. Sin embargo, este no es el caso en este estudio. Una disminución de la inmunidad innata, especialmente la activación de la microglía, al mismo tiempo, atenúa su contribución al aclaramiento de A, lo que puede resultar en la acumulación de A. Curiosamente, la acumulación de A en sí misma desencadena la producción de estrés oxidativo de múltiples maneras. Por lo tanto, la disminución de la activación microglial y las respuestas inflamatorias de EK1000 pueden proteger en parte a las neuronas de los ataques inmunitarios fuera del objetivo, pero pagarán el precio de la atenuación de la eliminación de A. Por lo tanto, el resultado de este estudio puede reflejar la limitación de la estrategia dirigida a la microglía, al menos en el modelo AD Drosophila.

El sistema inmunitario innato mediado por microglía se describe como un arma de doble filo en las enfermedades neurodegenerativas, especialmente la EA [26,27]. La microglía activada intenta eliminar patógenos tóxicos como A, pero inevitablemente causa daño neuronal en el microambiente. La superioridad de 250 µg/mL de EK100 dentro de los 35 días puede implicar que la estrategia de reducción de la activación de la microglía está limitada por el estadio patológico, al menos en el caso del modelo AD de la mosca de la fruta. Además, la reducción significativa de biomarcadores para la activación microglial y la respuesta inflamatoria no se ha traducido en una mejora significativa similar en la supervivencia, y la función del SNC podría explicarse en parte por la característica de espada de doble filo de la microglia. Esto implica que la activación de la microglía no es el único ni el factor dominante del progreso de la EA. La activación microglial reducida también implica que la degradación de la A sobreexpresada se desactivó parcialmente en el modelo de mosca de la fruta, lo que también puede explicar la mayor mortalidad para la mayor concentración de EK100 entre las edades de 35 y 52 días.

Se ha informado que el antroquinonol, otro extracto del alcanforato de Antrodia, es eficaz en el tratamiento de ratones con AD, para los cuales se ha postulado que la reducción del estrés oxidativo es el factor mediador [14]. Por lo tanto, esto puede implicar que el antroquinonol y el ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol mejoran los síntomas de la EA a través de vías independientes, mediando o no el estrés oxidativo, respectivamente. Por lo tanto, sería interesante probar si el tratamiento conjunto con antroquinonol y ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol tendría un efecto sinérgico en la mejora de la EA.

Para la etapa temprana de la EA, el enfoque principal del diseño del fármaco es eliminar el depósito de A (como en el anticuerpo monoclonal recientemente aprobado aducanumab [28], a pesar de su controversia sobre los beneficios clínicos mínimos y la ineficacia en uno de los dos ensayos clínicos de fase III). [29]), o intentos de aumentar la captación microglial de A [30-32]. Sin embargo, para las etapas moderadas o avanzadas de la EA, la sobreactivación de la microglía agrava la neurodegeneración [33] y, por lo tanto, se requieren estrategias terapéuticas alternativas.

4. Materiales y Métodos

4.1. Medición de vida útil y mantenimiento de poblaciones de moscas

La cepa A transgénica de Drosophila H29.3/CyO se obtuvo de [16] y se cruzó con w(CS10) durante seis generaciones. La línea conductora panneural elav-GAL4c155 se cruzó con w(CS10) durante seis generaciones. La línea w1118 de ojo blanco (Bloomington Drosophila Stock Center #3605) cruzada con la línea Canton S (Bloomington Drosophila Stock Center # 64349) 10 veces (w (CS10)) se usó como el material estándar. La línea conductora panneural elav-GAL4c155 se obtuvo del Bloomington Drosophila Stock Center (#458). El genotipo de las moscas experimentales, es decir, el modelo AD, fue [elav; H29.3/ plus], que se seleccionó de la descendencia F1 sin el marcador CyO. Las moscas se mantuvieron en medio estándar de harina de maíz a 25 ◦C bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Para T-maze, lo emergente [elav; Se recolectaron moscas H29.3/ plus] (ambos sexos mezclados y no vírgenes) y se cultivaron con o sin tratamiento con EK100 hasta el día 14 después de la emergencia. Para supervivencia, escalada y RT-qPCR, solo se usaron moscas macho. Las muestras de ARN se recolectaron en el día 30 después de la emergencia, cuando tanto la vida útil como las curvas ascendentes mostraron una separación significativa en comparación con el modelo de AD no tratado.

En un análisis de vida útil, se criaron de veinte a treinta moscas en un vial de alimento con o sin CS; se prepararon al menos cuatro viales para cada tratamiento. Los viales de alimento se reemplazaban cada 2 o 3 días y en ese momento se contaban las moscas muertas. Se realizaron al menos tres repeticiones por ensayo. El porcentaje de supervivencia se define como el número de moscas vivas dividido por el número total de moscas al comienzo de la prueba.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol se extrajo del amable regalo de Antrodia camphorata, como se describió anteriormente [34]. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol forma un polvo de color amarillo claro a temperatura ambiente. La solución madre se preparó a una concentración de 6,25 mg/mL en EtOH justo antes de su uso. Para los ensayos de longevidad y anti-geotaxis, las concentraciones finales fueron 125 y 250 µg/mL. Para los ensayos de memoria de aprendizaje y expresión génica, la concentración final fue de 250 µg/mL. El peso molecular de EK100 es 396,65. Entonces, las concentraciones molares correspondientes son 315 o 630 µM, respectivamente. Las moscas fueron tratadas con dos dosis de EK100 con las concentraciones finales de 125 y 250 µg/mL mezcladas en el alimento por alimentación Ad libitum. El alimento de control contenía la misma cantidad de solvente EtOH que los grupos experimentales con una concentración final de EtOH de 3 por ciento v/v. El tratamiento comenzó desde la emergencia hasta el momento de la recolección de datos de cada ensayo. Para el ensayo de supervivencia y escalada, el tratamiento se administró durante toda la vida. El número de moscas para cada replicación se describió en la sección de método de cada ensayo. También probamos ensayos de vida útil con moscas de tipo salvaje tratadas o no tratadas para garantizar la seguridad del ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol en modelos de moscas (Figura complementaria S1 ).

4.3. Ensayos de antigeotaxis

El presente protocolo se basa en un método publicado previamente [35], con algunas modificaciones. Brevemente, se usó como aparato de geotaxis un vial de plástico cilíndrico transparente con un diámetro de 2,5 cm y una altura de 9,5 cm (más largo estará bien, pero será más difícil de manejar). El fondo del vial estaba recubierto con una sola capa de alimento para moscas a modo de cojín. Se fijó una marca de 5 cm por encima de la almohadilla a la superficie exterior del vial. El otro extremo del vial estaba abierto y desde allí se cargaban las moscas. Dado que el ensayo se realizó al mismo tiempo que el ensayo de supervivencia, el número de moscas cargadas fue idéntico al de las supervivientes en ese momento. Las moscas se cargaron en el vial; la parte superior se selló con una tapa y el fondo del vial se golpeó repetidamente (durante dos segundos) contra la superficie dura sobre la que estaba de pie (banco de laboratorio en este caso). El golpe fue lo suficientemente fuerte como para asustar a las moscas y hacer que treparan por las paredes del vial, pero no tan fuerte como para dañarlas físicamente. Todo el proceso se grabó en video durante 18 segundos, y se anotó el número de moscas que trepaban por encima de la marca de 5 cm y se expresó como un porcentaje para cada grupo. Se contó el número de moscas que subieron por encima de la marca de 5 cm. Se realizaron cuatro repeticiones para cada grupo. El porcentaje de capacidad trepadora se define como el número de moscas trepadoras dividido por el número total de moscas al comienzo de la prueba. La capacidad de trepar también se probó en moscas de tipo salvaje tratadas/no tratadas para garantizar la seguridad de ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol en modelos de moscas (Figura complementaria S2) .

4.4. Plataforma de aprendizaje y memoria de Drosophila (T-Maze)

Para observar el aprendizaje y la memoria de Drosophila, primero se colocaron alrededor de 100 moscas en la cámara de cobre superior, que puede recibir voltaje eléctrico y administrar una descarga eléctrica a las moscas. Las moscas se entregaron por primera vez en olor 1 (MCH) junto con ondas de choque eléctrico. Luego, las moscas recibieron el olor 2 (OCT) sin ondas de choque eléctrico. Después del entrenamiento, las moscas se trasladaron al espacio inferior, en el que dos lados abiertos recibieron el olor 1 o el olor 2, respectivamente. Al observar la dirección de movimiento de las moscas, el sesgo del olor 2 sobre el olor 1 se puede estimar con el índice de rendimiento (PI), definido como la diferencia en el número de moscas entre dos olores dividido por el número total de moscas. El Performance Index representa la capacidad de aprendizaje y memoria de Drosophila [36]. Otro grupo de moscas fue condicionado con los pares de olores invertidos, de modo que cada olor sirvió una vez como una descarga eléctrica positiva y una vez como una descarga eléctrica −. Los PI de estas dos pruebas se promediaron como el PI final de una réplica. La "memoria de 1 h" se probó después de un intervalo de 1 h con el entrenamiento, mientras que el "aprendizaje", por el contrario, se probó después de un intervalo de 1,5 min con el entrenamiento. También probamos la evitación de MCH y OCT de las moscas AD con o sin tratamiento con EK100 para garantizar que el tratamiento provoque un sesgo contra los olores aversivos (Figura complementaria S3).

4.5. PCR cuantitativa

Las cabezas y los cuerpos se separaron antes de la extracción del ARN. Para una réplica, las moscas se anestesiaron con CO2; recogidos, 100 a la vez, en tubos Eppendorf; y luego se sumerge en nitrógeno líquido durante 1 min para que los cuerpos se vuelvan quebradizos. Los cadáveres congelados resultantes se cargaron luego en pilas de tamizadores (Bunsekifurui, No. 40 y No. 25) y se agitaron. Los cuerpos se separaron y se clasificaron según el tamaño de las mallas del tamiz en dos fracciones separadas: "cabezas" y "cuerpos". El ARN total se extrajo con el kit RNeasy Mini (Qiagen, Düsseldorf, Alemania) y luego se usó para sintetizar ADNc con el kit de síntesis de ADNc VersoTM (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los niveles de expresión de ARN de los genes investigados se cuantificaron mediante PCR en tiempo real (Applied Biosystems 7700, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) con Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los resultados se normalizaron a la cantidad relativa de Gapdh o Rpl32. Los cebadores utilizados se enumeran a continuación. Brecha: 50 -GAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 y 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGAGGAC-30 y 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 y 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30; Gato: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 y 50 -TTGATTCCAATGGGTGCTC-30; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGTGT-30 y 50 -CGGTCTGCTTGGCCTTTA-30; CNC: 50 -GCCAACTATGGTGG TGGAGT-30 y 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAGAATCGTCAC CT-30 y 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30 ; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 y 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30; SOD3: 50 -TCAGCATGGGGTGCTCACTAT-30 y 50 -TAATGCCCGTGGAGTTGG-30; mkk3: 50 -CCGCTACCCATACGACAAT-30 y 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30 ; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 y 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 y 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30 ; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 y 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30 ; gusto: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 y 50 -TCTCCCTTCTCCG GATACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAGCTGT-30 y 50 -CGACGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Ensayos de estrés oxidativo

BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, EE. UU.), el Catalase Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI , EE. UU.), y el kit de ensayo de superóxido dismutasa (Caimán), respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, la actividad de SOD se evaluó midiendo la dismutación de los radicales superóxido generados por la xantina oxidasa suministrada por el kit y se detectó transformando la sal de tetrazolio en colorante de formazán, luego se cuantificó por absorbancia a 440–460 nm. La actividad de CAT se evaluó midiendo la formación de formaldehído a partir de metanol en presencia de H2O2 catalizada por CAT, detectada por el cromogénico 4-amino-3- hidrazino-5-mercapto-1 suministrado por el kit. ,2,4-triazol, luego cuantificado por la absorbancia a 540 nm. La actividad de peroxidación de lípidos se evaluó midiendo la descomposición de los peróxidos de ácidos grasos poliinsaturados en malonaldehído (MDA) e 4-hidroxialquenales, detectados por el N-metil-2-fenilindol cromogénico suministrado por el kit, luego cuantificado por absorbancia a 586 Nuevo Méjico. Para los ensayos SOD, Cat y LPO, el número de moscas homogeneizadas completas de cada réplica fue 50, 50 y 100, respectivamente.

4.7. Análisis estadístico

La importancia de la diferencia entre las curvas de supervivencia y las curvas ascendentes de los grupos tratados con ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol y de control se evaluó mediante log-rank (Mantel– Cox) y las pruebas de Gehan-Breslow-Wilcoxon. La importancia de la diferencia entre el índice de rendimiento de la memoria de aprendizaje de los grupos tratados con ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol y de control se juzgó mediante la prueba t de Student.

5. Conclusiones

Verificamos que el ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) del alcanforato de Antrodia mejora la supervivencia, el aprendizaje y la memoria en un modelo de Drosophila de AD, con biomarcadores reducidos de la activación e inflamación de la microglía. Además, la modificación de los síntomas no se produjo a través de la reducción del estrés oxidativo omnipresente, lo que significa que el ergosta-7,9(11) y el 22-trien-3 -ol mejoran los síntomas de la EA a través de diferentes vías hacia otro Extracto de alcanforato de antrodia, antroquinonol. EK100 disminuyó efectivamente la activación y la inflamación microgliales, lo que puede ayudar a revertir los déficits cognitivos típicos asociados con la EA, como los déficits de aprendizaje y memoria.

Materiales complementarios:Los siguientes están disponibles en línea. Figura S1: Supervivencia de moscas de tipo salvaje tratadas con EK100; Figura S2: Escalada de moscas de tipo salvaje tratadas con EK100; Figura S3: Evitación de olores aversivos de moscas AD tratadas con EK100; Tabla S1: Estadísticas de las curvas de supervivencia.

Contribuciones de autor:H.-PL, Y.-HK y W.-YL diseñaron los experimentos. Y.-HK contribuyó a la preparación de EK100. JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS y T.-NC realizaron los experimentos. Todos los autores participaron en la preparación del manuscrito. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos: Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 108-2320-B-039-031-MY3, MOST 109-2314-B-039-030, MOST 110-2314- B-039-009), China Medical University & Hospital (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, CMU109- AWARD-02, y DMR-109-150), y del Programa Centro de Investigación de Áreas Destacadas en el marco del Proyecto Brote de Educación Superior del Ministerio de Educación (MOE) en Taiwán (CMRC-CHM-2-1).

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:No aplica.

Declaración de consentimiento informado:No aplica.

Declaración de disponibilidad de datos:Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.

Conflictos de interés:Y.-HK es uno de los inventores, pero no el cesionario, de la patente US-9757393-B2 titulada "Derivatives of ergostatrien-3- -ol from aniridia camphorate and anti glucemic, antihyperlipidemic and reductor de grasa hepática". Otros autores declaran que no tienen intereses en competencia. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito, o en la decisión de publicar los resultados.

Disponibilidad de muestras:Las muestras de los compuestos están disponibles de los autores.

Referencias

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