Evaluación de las composiciones de ácidos grasos, antioxidantes y actividades farmacológicas del aceite de semilla de calabaza (Cucurbita moschata) de extracción enzimática acuosa Parte 1

May 08, 2023

Abstracto:El aceite de semilla de calabaza es un subproducto, abundante en nutrientes y componentes bioactivos que promueven varios beneficios para la salud. Este estudio tuvo como objetivo comparar las composiciones químicas, las actividades antioxidantes y farmacológicas de los aceites de semilla de calabaza extraídos de Cucurbita moschata Duch. Ex Poir. (PSO1) y Cucurbita moschata (calabaza japonesa) (PSO2) por extracción enzimática acuosa. En el proceso de extracción enzimática se utilizó una mezcla de enzimas compuesta por pectinasa, celulasa y proteasa (1:1:1). La composición de ácidos grasos de los aceites se determinó utilizando éster metílico de ácidos grasos/cromatografía de gases-espectrometría de masas. Los ensayos de actividad antioxidante se midieron mediante el uso de radicales libres estables difenilpicrilhidrazilo, radical catión 2,20 -azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, poder reductor/antioxidante férrico y ensayo de tiocianato férrico. Inhibición de Enzimas involucradas en el proceso de envejecimiento y blanqueamiento de la piel. El ácido linoleico era un componente principal de todos los aceites de semilla de calabaza. Además, también se detectó una cantidad significativa de ácido oleico, ácido palmítico y ácido esteárico. El PSO2 poseía las actividades antioxidantes más altas en comparación con PSO1 y aceites de semilla de calabaza comerciales (COM1 y COM2). Tanto el PSO1 como el PSO2 exhibieron mayores efectos inhibidores sobre la hialuronidasa, la colagenasa y la tirosinasa que los comerciales. Por lo tanto, la extracción enzimática acuosa podría producir aceites de semilla de calabaza con mayor poder antioxidante, antienvejecimiento y actividades de blanqueamiento Esto es beneficioso para estudios farmacológicos adicionales y puede usarse como un alimento funcional para los beneficios de la piel.

Según estudios relevantes,cistanchees una hierba común que se conoce como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente escistanósido, que tiene varios efectos tales comoantioxidante, antiinflamatorio, ypromoción de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche ypiel blanqueoreside en el efecto antioxidante de la cistancheglucósidos. La melanina en la piel humana es producida por la oxidación de tirosina catalizada portirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, por lo tantoinhibiendo la producción de melanina.

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Palabras clave:Cucurbita moschata; calabaza japonesa; aceite de semilla de calabaza; extracción enzimática acuosa; ácidos grasos; antioxidante; antienvejecimiento

1. Introducción

La calabaza pertenece al género Cucurbita y a la familia Cucurbitaceae, una planta común y famosa que se cultivó en el norte de México y se ha extendido a Europa, América occidental y Asia [1]. La calabaza se considera un alimento funcional que contiene abundantes nutrientes como proteínas, carbohidratos, lípidos, fibra, etc., junto con compuestos fitoquímicos como tocoferoles, carotenoides y -sitosterol [2]. Se ha descubierto que los fitonutrientes de varias partes de la calabaza tienen actividades farmacológicas [2]. El extracto de cáscara de calabaza mostró efectos beneficiosos en heridas por quemaduras en modelos animales [3]. La pulpa de calabaza demostró actividad antioxidante, antiinflamatoria y antiangiogénica [2], así como actividad antifatiga en ratones [4]. Además, la semilla de calabaza es una buena fuente natural de ácidos grasos esenciales y fitoesteroles que reducen el riesgo de mortalidad cardiovascular [5,6]. El aceite de semilla de calabaza es un subproducto del procesamiento de las semillas de calabaza, que son ricas en varios ácidos grasos y compuestos bioactivos como -carotenos, -tocoferol, vitamina B, luteína, fitoesteroles y otros minerales [7,8]. El aceite ejerce efectos antioxidantes, antiinflamatorios, antibacterianos y cicatrizantes [1,9]. Además, tiene varios beneficios para la salud contra enfermedades, como la hipertensión, la diabetes y el cáncer [8,10].

Se han desarrollado diferentes métodos para extraer aceite de semilla, incluidos métodos mecánicos como el prensado en frío [11] y la extracción a alta presión [12]. También se ha documentado la extracción de aceite de semilla con solventes orgánicos como hexano, acetato de etilo, acetona y metanol [13,14]. La extracción asistida por enzimas es un método alternativo para la industria del aceite vegetal porque es una tecnología segura y respetuosa con el medio ambiente. El mecanismo principal de la extracción enzimática acuosa es la hidrólisis y la ruptura de las paredes celulares del material vegetal, lo que conduce a una mayor permeabilidad y liberación de componentes bioactivos, incluida la fase oleosa [15]. Varias mezclas de enzimas aplicadas en esta extracción están compuestas por pectinasas, celulasas, hemicelulasas, arabinosa, -glucanasa y xilanasa [16,17]. Las condiciones optimizadas de una mezcla de enzimas, por ejemplo, temperatura, pH, tiempo de reacción, tamaño de partícula y concentración de enzima, también mejoraron la actividad de la enzima [16]. Hoy en día, este método ha sido ampliamente utilizado para extraer aceite de muchas frutas y semillas de plantas [18,19]. Algunos estudios previos demostraron la condición optimizada del aceite de semilla de calabaza para obtener un alto rendimiento y actividades farmacológicas efectivas [20,21].

Actualmente, las personas consumen aceite de semilla de calabaza en postres o aderezos para ensaladas, y también es un ingrediente popular en los cosméticos. El envejecimiento de la piel es un proceso biológico complejo que se caracteriza por arrugas, pérdida de elasticidad, pérdida de humedad y textura áspera causada por el estrés oxidativo, el daño del ADN y la acumulación avanzada del producto final de la glicación [22]. El ácido hialurónico, el colágeno y la elastina, que son componentes importantes de la piel, pueden degradarse por las enzimas hialuronidasa, colagenasa y elastasa, respectivamente, lo que provoca el envejecimiento de la piel. Varios aceites vegetales, como el aceite de oliva, el aceite de semilla de girasol, el aceite de semilla de uva y el aceite de jojoba, se han utilizado por sus propiedades cosméticas para la piel para retener la humedad, mejorar la función de barrera de la piel y prevenir el envejecimiento de la piel [23]. Además, la pigmentación de la piel es un fenotipo variable y notable en humanos que implica melanogénesis y está regulado por la enzima tirosinasa [24]. En la actualidad, se han probado varios extractos de plantas para cosméticos y productos farmacéuticos para disminuir la producción de melanina, actuando como agentes blanqueadores [25,26].

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Recientemente, C. moschata Duch. Ex Poir es un cultivar de calabaza que se cultiva comúnmente y es popular en Tailandia, pero hay pocos estudios que involucren sus valores funcionales y propiedades farmacológicas. Además, la extracción enzimática acuosa es un método interesante para extraer aceite de semillas de calabaza para obtener un alto rendimiento y eficiencia. Por lo tanto, este estudio se centró en la determinación de los principales constituyentes, las actividades antioxidantes y farmacológicas del aceite de semilla de calabaza de C. moschata Duch. Ex Poir. (cultivar tailandés) y C. moschata (calabaza japonesa) utilizando el método de extracción enzimática acuosa.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales vegetales

Los frutos frescos de C. moschata Duch. Ex Poir y C. moschata (calabaza japonesa) se compraron en un mercado local en Chiang Mai, Tailandia, en diciembre de 2020. Se recolectaron las semillas y se eliminaron todas las hebras fibrosas. Después de la eliminación de la cubierta de la semilla, las semillas de calabaza descascaradas se lavaron y secaron a temperatura ambiente. Las semillas se mantuvieron en una bolsa de plástico sellada hasta su posterior experimentación. Además, se compraron dos muestras comerciales de aceite de semilla de calabaza (COM1 y COM2) en un supermercado en Chiang Mai, Tailandia. Todos los experimentos se realizaron dentro de la fecha de idoneidad para el consumo de los aceites comerciales.

2.2. Sustancias químicas y reactivos 

Colagenasa de Clostridium histolyticum (ChC—EC.3.4.23.3), elastasa de páncreas porcino (PE—EC 3.4.21.36), N-succinil-Ala-Ala-p-nitroanilida, sulfato férrico (FeSO4), sal sódica de ácido hialurónico de Streptococcus equi, hialuronidasa de pruebas bovinas, pectinasa de Aspergillus niger (EC 3.2.1.15, Mayor o igual a 5 unidades/mg proteína, pH óptimo=4.{{20}}, temperatura óptima=61 ◦C), celulasa de Aspergillus niger (EC 3.2.1.4, Mayor o igual a 0.3 unidades/mg sólido, pH óptimo=6.5, temperatura óptima {{ 30}}–55 ◦C), proteasa de Aspergillus Saito (EC 3.4.21.112, Mayor o igual a 0.6 unidades/mg sólido, pH óptimo=5.1, temperatura óptima=57.2 ◦ C), 2,20 -azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato (ABTS), 2,2-difenil-1-picrilhidrazilhidrato (DPPH), 2,4,6 tripyridil-s-triazina (TPTZ), 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico (Trolox), albúmina sérica bovina, ácido kójico, L -tirosina, L-DOPA, ácido linoleico, fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4·2H2O), fosfato de sodio dibásico y tirosinasa de champiñón se adquirieron de Sigma-Aldrrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Además, se compraron ácido clorhídrico al 37 por ciento, etanol al 95 por ciento, agua destilada (DI), dimetilsulfóxido (DMSO) y metanol de RCI Labscan Co., Ltd. (Bangkok, Tailandia). El tiocianato de amonio (NH4SCN) y el cloruro ferroso (FeCl2) se adquirieron de Loba Chemie Pvt. Ltd. (Mumbai, India). El tris (hidroximetil) aminometano se adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania).

2.3. Extracción enzimática acuosa

Los aceites de semilla de calabaza de C. moschata Duch. Ex Poir y C. moschata (calabaza japonesa) se extrajeron mediante el método de extracción enzimática acuosa utilizando los parámetros de hidrólisis enzimática de un estudio anterior realizado por Kanopka et al. (2016), incluida la concentración de enzima, la relación enzima-sustrato, la temperatura de reacción, el pH y el tiempo de reacción [21]. Se combinaron tres tipos diferentes de enzimas, incluidas pectinasa, celulasa y proteasa, en una proporción de peso de 1:1:1 para generar un cóctel concentrado de enzimas. Posteriormente, el cóctel concentrado resultante se diluyó en agua DI para generar una mezcla enzimática acuosa al 2 por ciento p/p. A continuación, se añadieron las semillas de calabaza sin cáscara a la mezcla enzimática acuosa resultante en una proporción en peso de 1:1. A continuación, la mezcla se molió finamente utilizando un mezclador Moulinex DB81 a temperatura ambiente hasta homogeneidad. A continuación, el pH de la suspensión resultante se ajustó a 4,7 utilizando HCl 0,1 M y se incubó a 54 ◦C durante 15 h. Después de que la suspensión se enfriara a temperatura ambiente, se centrifugó a 11 500 × g durante 10 min. Se recogió la capa superior de sobrenadantes, que era la fase oleosa. La crema producida durante el proceso de extracción no se emulsionó sino que se eliminó mediante sifón con una micropipeta. El residuo de semilla de calabaza se eliminó mediante filtración a través de papel de filtro Whatman No.1 al vacío [21]. Aceite de semilla de calabaza de C. moschata Duch. Ex Poir (PSO1) y C. moschata (calabaza japonesa) (PSO2) se mantuvieron en recipientes resistentes a la luz, bien cerrados, a temperatura ambiente hasta la experimentación adicional.

2.4. Determinación de la composición química del aceite de semilla de calabaza utilizando el método de espectrometría de masas/cromatografía de gases/éster metílico de ácido graso (FAME/GC/MS)

Se determinó la composición de ácidos grasos del aceite de semilla de calabaza usando el método de espectrometría de masas cromatográfica de gases/éster metílico de ácidos grasos (FAME/GC/MS). FAME es un tipo de éster de ácido graso que se deriva de la transesterificación de grasas con metanol catalizada por ácido. En este estudio, los aceites de semilla de calabaza (PSO1, PSO2, COM1 y COM2) se saponificaron mediante la adición de 0solución de NaOH 0,5 M en metanol a 100 ◦C durante 15 min. . Después de enfriar, las muestras de aceite se derivatizaron con trifluoruro de boro (BF3) en una solución de metanol a 100 ◦C durante 1 min para formar productos FAME. Después de enfriar y agregar NaCl saturado y hexano, los FAME se dividieron en fase de hexano y se recogieron en viales para inyección. Los extractos de FAME se analizaron utilizando la técnica de GC/MS en las siguientes condiciones: dimensión de la columna capilar (TR-FAME, tamaño 60 m × 0,25 mm, tamaño de partícula de 0,25-µm), programa de temperatura en ejecución de 50 ◦C ; espera 2 min con rampa 1 tasa de 10 ◦C/min hasta 180 ◦C, espera 15 min; rampa 2 tasa de 4 ◦C/min, temperatura final 230 ◦C, espera 22,50 min. Se utilizó helio como gas portador a un caudal de 1,0 ml/min. Las muestras de aceite se inyectaron en modo splitless (relación de división 1:20 y compañero de división 20 ml/min) a 235 ◦C mediante un muestreador automático. Un detector MS equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) operada a 70 eV con las temperaturas de la fuente de iones y la línea de transferencia ajustadas a 200 ◦C y 220 ◦C, respectivamente, registró espectros de masas en el rango m/z de 38–600. Los compuestos analizados se asignaron comparando sus espectros de masas con los datos publicados (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, 2008). La composición porcentual se calculó integrando picos en cromatogramas de iones totales (TIC). Todas las mediciones fueron realizadas por el Laboratorio de Investigación y Servicio, Centro de Ciencias Halal, Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia, bajo Halal GMP/HACCP y Halal-QHS/ISO 22000.

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2.5. Determinación de actividades antioxidantes

2.5.1. Ensayo de captación de radicales de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)

La actividad eliminadora de radicales DPPH (DPPH•) se determinó usando el método establecido por Chaiyana et al. (2017) [27]. En resumen, 20 µL de muestras de aceite (PSO1, PSO2, COM1, COM2) y ácido linoleico disuelto en DMSO se mezclaron con 180 µL de solución etanólica de 167 µM DPPH en una placa de pocillos 96-y luego se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se utilizó ácido ascórbico (1 mg/mL) como control positivo. La densidad óptica (OD) se midió a 520 nm utilizando un lector de microplacas (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, Inglaterra). Los experimentos se realizaron por triplicado y se realizaron en tres independientes. El porcentaje de inhibición de DPPH se calculó utilizando la Ecuación (1):

Inhibición de DPPH (porcentaje)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (1)

donde ODA es la OD de una mezcla que contiene agua DI y solución de DPPH; B es el ODB de una mezcla que contiene agua DI y DMSO; C es el ODC de una mezcla que contiene muestras de aceite y DPPH•solución; y ODD es la OD de una mezcla que contiene muestras de aceite y DMSO.

2.5.2. Ensayo de 2,20 -azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico (ABTS)

La actividad eliminadora de radicales catiónicos ABTS (ABTS• plus) se midió mediante el método colorimétrico según Chaiyana et al. (2017) y Paradee et al. (2019) [27,28] con ligera modificación. ABTS• plus se generó agregando 2 ml de ABTS 7 mM con 3 ml de persulfato de potasio 2,45 mM y se incubó durante 16 a 24 h a temperatura ambiente en la oscuridad. El ABTS• plus resultante se diluyó posteriormente con etanol para obtener una DO de 0,7 ± 0,1 a 750 nm. Brevemente, 20 µL de muestras de aceite (PSO1, PSO2, COM1, COM2) y ácido linoleico disuelto en DMSO se mezclaron con 180 µL de ABTS• más solución etanólica en una placa de pocillos 96-y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente . La DO se midió a 750 nm utilizando un lector de microplacas (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, Inglaterra). Se utilizó ácido ascórbico (1 mg/mL) como control positivo. La curva estándar se produjo trazando la absorbancia a 750 nm frente a diferentes concentraciones de Trolox que oscilan entre 2,5 y 30 µg/ml. La actividad secuestrante de ABTS• plus se calculó a partir de la curva estándar de Trolox (R2=0.9922) y se expresó como capacidad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC). Los experimentos se realizaron por triplicado y se realizaron en tres independientes.

2.5.3. Ensayo de poder antioxidante reductor férrico (FRAP)

El poder antioxidante reductor férrico (FRAP) de cada una de las muestras se determinó utilizando el ensayo FRAP como se describe en un estudio previo de Chaiyana et al. (2017) que había sido ligeramente modificado de Saeio et al. (2011) [27,29]. El reactivo FRAP se generó recientemente mezclando tampón de acetato 300 mM (pH 3,6), 2,4,6 tripiridil-s-triazina (TPTZ) 10 mM en HCl 40 mM y FeCl3 20 mM en una proporción de 10:1:1. En este estudio, se mezclaron 20 µL de muestras de aceite (PSO1, PSO2, COM1, COM2) y ácido linoleico con 180 µL de reactivo FRAP en una placa de 96-pocillos y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La DO se midió a 595 nm utilizando un lector de microplacas (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, Inglaterra). Se utilizó ácido ascórbico (1 mg/mL) como control positivo. La curva estándar se produjo trazando la absorbancia a 595 nm frente a diferentes concentraciones de sulfato férrico (FeSO4) que oscilan entre 0,003 y 0,5 mM. El valor FRAP se calculó a partir de la curva estándar de FeSO4 (R2=0.9965) y se expresó como capacidad equivalente (EC1). Los experimentos se realizaron por triplicado y se realizaron en tres independientes.

2.5.4. Ensayo de tiocianato férrico (FTC)

La inhibición de la peroxidación lipídica se investigó mediante el método del tiocianato férrico (FTC). Este método se realizó de acuerdo con los pasos descritos por Osawa et al. (1981) [30] con una ligera modificación. La mezcla estaba compuesta por 50 µL de muestras de aceite (PSO1, PSO2, COM1, COM2) y ácido linoleico, 50 µL de ácido linoleico al 50 % en DMSO, 50 µL de solución acuosa de tiocianato de amonio al 10 % (NH4SCN) , y 50 µL de cloruro ferroso 2 mM (FeCl2). A continuación, la mezcla se incubó a 37 ± 2 ◦C durante 1 h y se midió la DO a 500 nm utilizando un lector de microplacas (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, Inglaterra). -Se utilizó tocoferol (0,025–0,1 mg/mL) como control positivo. Los experimentos se realizaron por triplicado y se realizaron en tres independientes. La actividad de inhibición de la peroxidación de lípidos se calculó usando la Ecuación (2):
Inhibición de la peroxidación lipídica (porcentaje)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA−ODB)} × 100, (2)
donde ODA es la OD de la mezcla que contiene ácido linoleico, NH4SCN y FeCl2; ODB es la OD de DMSO; ODC es la OD de la mezcla que contiene muestras de aceite, ácido linoleico, NH4SCN y FeCl2; y ODD es la OD de la mezcla que contiene muestras de aceite y DMSO.

2.6. Determinación de actividades antienvejecimiento

2.6.1. Actividad anti-hialuronidasa

La medición de la actividad anti-hialuronidasa se realizó como se describió previamente por Chaiyana et al. (2020) [31]. Primero, se mezclaron 20 µL de muestras de aceite (PSO1, PSO2, COM1, COM2) con 100 µL de solución de hialuronidasa de 15 U/mL y se incubaron a 37 ◦C durante 10 min. Después de la incubación, se añadieron 100 µL de ácido hialurónico al 0,03 % p/v que se disolvió en tampón fosfato 20 mM (pH 5,35), luego se incubó a 37 ◦C durante 45 min. Posteriormente, se añadió 1 mL de albúmina de suero bovino al 0,1 por ciento y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. La DO se determinó a 600 nm utilizando un detector multimodo (Beckman Coulter DTX880, Fullerton, CA, EE. UU.). Se utilizó ácido oleanólico (0,25 por ciento p/v) como control positivo. Los experimentos se realizaron por triplicado y se realizaron en tres independientes. El porcentaje de inhibición de la hialuronidasa se calculó utilizando la Ecuación (3):

Inhibición de la hialuronidasa (porcentaje)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (3)
donde ODA es la OD de la mezcla que contiene agua DI, solución de hialuronidasa y ácido hialurónico; ODB es la OD de la mezcla que contiene agua DI y tampón fosfato (pH 5,35); ODC es la OD de la mezcla que contiene muestras de aceite, solución de hialuronidasa y ácido hialurónico; y ODD es la OD de la mezcla que contiene muestras de aceite y tampón de fosfato (pH 5,35).

2.6.2. Actividad Anti-Colagenasa

La medición de la actividad anticolagenasa se realizó de acuerdo con el proceso establecido por Chaiyana et al. (2019) y Thring et al. (2009) con ligeras modificaciones [32,33]. Brevemente, 20 µL de muestras de aceite (PSO1, PSO2, COM1, COM2) se mezclaron con 20 µL de solución de colagenasa de 0,1 U/mL de Clostridium histolyticum y se incubaron a 37 ◦C durante 15 min. Después de la incubación, 80 µL de tampón tricina 50 mM (NaCl 400 mM y CaCl2 10 mM, pH 7,5) y 40 µL de N-[3-(2-furil) acriloil]-Leu-Gly- Se añadió solución de sustrato Pro-Ala (FALGPA). La DO se detectó inmediatamente a 340 nm y luego se midió de forma continua durante 20 min utilizando un lector de microplacas (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, Inglaterra). Se usó ácido oleanólico (1 por ciento p/v) como control positivo. Los experimentos se realizaron por triplicado y se realizaron en tres independientes. El porcentaje de inhibición de la colagenasa se calculó utilizando la Ecuación (4):

Inhibición de colagenasa (porcentaje)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100, (4)
donde ODA es la OD de la mezcla que contiene muestras de aceite, solución de colagenasa, tampón de tricina y sustrato FALGPA; y ODB es la OD de la mezcla que contiene DMSO, solución de colagenasa, tampón de tricina y sustrato FALGPA.

2.6.3. Actividad Anti-Elastasa

La medición de la actividad antielastasa se realizó de acuerdo con el proceso establecido por Chaiyana et al. (2019) y Thring et al. (2009) con ligeras modificaciones [32,33]. Brevemente, se mezclaron 10 µL de muestras de aceite (PSO1, PSO2, COM1, COM2) con 40 µL de solución de elastasa 0,03 U/mL de páncreas porcino, luego 50 µL de tampón Tris-HCL 200 mM (pH 8,0) y 100 µL de Se añadió solución de sustrato de N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (AAAPVN) 0,8 mM. La DO se detectó inmediatamente a 410 nm y luego se midió de forma continua durante 20 min utilizando un lector de microplacas (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, Inglaterra). Se usó ácido oleanólico (1 por ciento p/v) como control positivo. Los experimentos se realizaron por triplicado y se realizaron en tres independientes. El porcentaje de inhibición de elastasa se calculó utilizando la Ecuación (5):

Inhibición de elastasa (porcentaje)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100, (5)
donde ODA es la OD de la mezcla que contiene muestras de aceite, solución de elastasa, tampón Tris-HCl y sustrato AAAPVN; y ODB es la OD de la mezcla que contiene DMSO, solución de elastasa, tampón Tris-HCl y sustrato AAAPVN.

2.7. Determinación de actividades anti-tirosinasa

El efecto blanqueador de un extracto natural se estableció mediante la medición de la actividad anti-tirosinasa que se realizó de acuerdo con Saeio et al. (2011) y Laosirisathian et al. (2020) [29,34]. L-tirosina y L-DOPA fueron los sustratos de la enzima tirosinasa en este estudio. En resumen, se mezclaron 10 µL de muestras de aceite (PSO1, PSO2, COM1, COM2) con 30 µL de tirosinasa en una placa de pozo 96-, luego se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Después de la incubación, se añadieron 100 µL del sustrato, que es L-tirosina o L-DOPA 2,5 mM, y se incubó durante 30 min. La DO se determinó a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, Inglaterra). Se utilizó ácido kójico (20 µg/mL) como control positivo. Los experimentos se realizaron por triplicado y se realizaron en tres independientes. El porcentaje de inhibición de tirosinasa se calculó utilizando la Ecuación (6):

Inhibición de tirosinasa (porcentaje)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (6)
donde ODA es la OD de la mezcla que contiene DMSO, enzima tirosinasa y L-tirosina; ODB es la OD de la mezcla que contiene enzima tirosinasa y PBS con un pH de 6,8; ODC es la OD de la mezcla que contiene muestras de aceite, enzima tirosinasa y L-tirosina; y ODD es la OD de la mezcla que contiene muestras de aceite, enzima tirosinasa y PBS con un pH de 6,8.

2.8. Análisis estadístico

Todos los datos se demostraron como media ± desviación estándar (DE). La significación estadística se analizó mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post-hoc de Tukey utilizando GraphPad Prism (versión 8.0, GraphPad Software), y se consideró p < 0.05 Estadísticamente significante.

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3. Resultados y discusión

3.1. Carácter de aceite de semilla de calabaza

En este estudio, utilizamos extracción enzimática acuosa en lugar de extracción con solvente orgánico para extraer aceite de semilla de calabaza de C. moschata Duch. Ex Poir (PSO1) y C. moschata (PSO2) porque es un proceso simple, efectivo y productivo [15,21]. PSO1 era un líquido marrón oscuro con baja viscosidad, mientras que PSO2 era un líquido marrón verdoso con baja viscosidad. Ambos aceites de semilla de calabaza tenían su olor característico. Los rendimientos de PSO1 y PSO2 fueron 17,7 por ciento v/py 15,6 por ciento v/p, respectivamente. Además del aceite, se ha informado que la semilla de calabaza contiene una variedad de compuestos nutricionales. Las composiciones próximas de C. moschata fueron principalmente carbohidratos (39,51 %), seguidas de grasas (28,49 %), proteínas (19,23 %), agua (7,67 %) y cenizas (5,18 %), respectivamente [35]. Sin embargo, en comparación con estudios previos que utilizaron prensado mecánico y solvente, el presente estudio reveló rendimientos más bajos de aceite de C. moschata. Aunque la extracción por solventes se ha descrito como el método de extracción de aceite más efectivo, extrayendo hasta el 98 por ciento de los aceites de las semillas, existen algunos problemas relacionados con los residuos de solventes y la pureza del aceite producido [36]. Adicionalmente, el solvente empleado en el proceso de extracción afectó el rendimiento del aceite generado. La extracción con hexano, éter de petróleo, benceno de petróleo, ciclohexano, éter isopropílico, acetato de etilo, tetrahidrofurano, propano-2-ol y acetona produjo 43,4–64,4 por ciento [37,38]. Por lo tanto, el prensado en frío era preferible a la extracción con disolventes. Sin embargo, una prensa en frío puede causar algunas complejidades en la etapa inicial de uso de una prensa de tornillo [39]. Por lo tanto, la extracción enzimática acuosa podría ser un método de extracción alternativo, ya que produjo un mayor contenido de aceite de semilla de calabaza (36,0 por ciento) en comparación con el aceite prensado en frío (33,5 por ciento) [21]. Aunque el proceso de extracción enzimática acuosa fue más complicado que el prensado en frío, implica un costo de inversión relativamente más económico, una disminución continua en el costo de las preparaciones enzimáticas comerciales, un potencial para aislar simultáneamente componentes fitoquímicos únicos y valiosos, así como abordar el deseo generalizado de la implementación de tecnologías verdes [21]. Los estudios preliminares describieron que varias enzimas, como celulasas, pectinasas, hemicelulasas y proteasas, se han utilizado a menudo para destruir la estructura de la pared celular de las plantas para mejorar la extracción bioactiva de las plantas [16,17]. Por lo tanto, diseñamos este estudio para extraer aceite de semilla usando una mezcla de enzimas que contiene pectinasa, celulasa y proteasa (1: 1: 1) como lo describió previamente Kanopka et al. (2016), quienes optimizaron las condiciones de hidrólisis enzimática para obtener el mayor rendimiento de aceite de semilla de calabaza [21]. Además, este método muestra alternativas más seguras y ambientalmente sostenibles a la extracción por solventes, aquí denominada "extracción verde".

3.2. Composición química del aceite de semilla de calabaza

Para el análisis de la composición de ácidos grasos, se comparó y analizó el aceite de semilla de calabaza con extracción enzimática acuosa (PSO1 y PSO2) junto con el aceite de semilla de calabaza comercial (COM1 y COM2) producido por extracción en frío. Las composiciones de ácidos grasos de PSO1, PSO2, COM1 y COM2 se muestran en la Tabla 1. Todas las muestras de aceite de semilla de calabaza consistían en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), monoinsaturados (MUFA) y saturados. El ácido cis-linoleico (C18:2) fue el componente principal en todas las muestras de aceite. COM2 contenía el mayor contenido de ácidos grasos (51,74 por ciento), seguido de COM1 (48,00 por ciento), PSO1 (39,09 por ciento) y PSO2 (37,63 por ciento), respectivamente. De manera similar, el ácido cis-oleico (C18:1) estuvo presente en un alto porcentaje, especialmente en PSO2 (37,45 por ciento), seguido de COM1 (33,39 por ciento), PSO1 (31,22 por ciento) y COM2 (28,64 por ciento). Los ácidos grasos saturados como el ácido palmítico (C16:0) y el ácido esteárico (C18:0) se encontraron solo en pequeñas cantidades en cada una de las muestras de aceite. También se observaron e identificaron trazas de otros PUFA, MUFA y ácidos grasos saturados.

En la literatura, el ácido linoleico también se conoce como omega-6, un ácido graso esencial que no puede ser sintetizado por el cuerpo humano, solo se recibe a través del consumo dietético. El ácido linoleico es un nutriente importante para las funciones de salud en los seres humanos, ya que implica un precursor de las ceramidas, que es un componente principal de las membranas celulares, la vitamina D y una variedad de hormonas [40,41]. Los estudios en animales han demostrado que la deficiencia de ácido linoleico puede causar escamas y picazón en la piel [23]. Además, el ácido linoleico del aceite vegetal ha favorecido la cicatrización de heridas en la piel, además de prevenir la inflamación de la piel y el acné [23]. Además, el ácido oleico, u omega-9, ha sido beneficioso para prevenir el cáncer y enfermedades autoinmunes e inflamatorias [42]. De hecho, el ácido oleico redujo significativamente la producción de óxido nítrico en el sitio de la herida, lo que resultó en un cierre más rápido de la herida [43]. Estos datos respaldan que el aceite de semilla de calabaza, que enriquece el ácido linoleico (omega-6) ​​y el ácido oleico (omega-9), exhibe beneficios potenciales para la salud.

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Según nuestros hallazgos, el aceite de semilla de calabaza (PSO1, PSO2, COM1 y COM2) constaba de muchos ácidos grasos, incluido el ácido linoleico (C18:2), ácido oleico (C18:2), ácido palmítico (C16:0) y ácido esteárico (C18:0) que son componentes comunes que se encuentran en el aceite de semilla de calabaza [44]. El ácido linoleico (omega-6) y los ácidos oleico (omega-9) fueron dominantes en todas las muestras de aceite. La mayor cantidad de ácido linoleico fue COM2, seguida de COM1, PSO1 y PSO2, respectivamente. Además, la mayor cantidad de ácido oleico fue PSO2, seguido de COM1, PSO1 y COM2. Estos resultados explican que la extracción enzimática acuosa del aceite de semilla de calabaza tenía un ácido linoleico ligeramente más bajo, pero no ácido oleico, que la extracción por prensado en frío. La razón del menor contenido de ácido linoleico en las semillas de calabaza de la extracción enzimática acuosa que en las muestras de aceite comercial se debió a una diferencia en el proceso de extracción. Estudios previos han encontrado inconsistencias en la cantidad de ácidos grasos insaturados, especialmente ácido oleico y ácido linoleico, en aceites de semilla de calabaza de distintas extracciones [39]. El contenido de ácido oleico varió del 28,19 % en el aceite de semilla de calabaza prensado en frío al 30,56 % en el aceite de semilla de calabaza extraído con pentano, mientras que el contenido de ácido linoleico varió del 43,86 % en el aceite de semilla de calabaza extraído con pentano al 46,67 por ciento en aceite de semilla de calabaza prensado en frío [39]. Además de los diferentes métodos de extracción, los solventes utilizados en el proceso de extracción y la temperatura durante la maduración de las semillas también afectaron el contenido de ácido linoleico de las semillas de las plantas. Un estudio anterior destacó que el éter de petróleo producía aceite de linaza con un bajo contenido de linoleico (26,2 por ciento), mientras que el n-hexano arrojaba resultados contradictorios con un contenido de ácido linoleico del 46,5 por ciento [45]. Además, el ácido linoleico es inversamente proporcional a la temperatura durante la maduración de las semillas de girasol [46].

Además, un estudio relativo descubrió que la composición química en términos de composición de ácidos grasos reveló que los ácidos linoleico y oleico estaban presentes en un 47,45 % y un 35 %, respectivamente, en el aceite de semilla de calabaza (C. maxima) extraído con éter dietílico [47] . Según Akin et al. (2018), el contenido de ácido linoleico osciló entre el 53,19 % y el 53,27 %, seguido del ácido oleico, que también estuvo presente en cantidades elevadas que oscilaron entre el 27,52 % y el 27,59 % en la extracción de aceite de semilla de C. pepo L. prensado en frío [48 ]. Por lo tanto, la extracción enzimática acuosa en este estudio también obtuvo menores rendimientos de ácidos grasos que la extracción con solvente y la extracción por prensado en frío mencionadas en estudios previos. En la comparación de cultivares, encontramos que PSO1 (C. moschata Duch. Ex Poir) mostró una mayor cantidad de ácido linoleico que PSO2 (C. moschata, o calabaza japonesa). De forma diversa, PSO2 presentó una mayor cantidad de ácido oleico que PSO1. Es importante destacar que las variaciones en los perfiles de ácidos grasos y las cantidades de aceite de semilla de calabaza dependían del origen de los cultivares particulares, las condiciones climáticas y el manejo posterior a la cosecha [49]. Además de las diferencias en los perfiles de ácidos grasos de los aceites de semilla de calabaza obtenidos de diferentes métodos de extracción, se informó que los aceites de la tecnología enzimática acuosa son ricos en fitoesteroles y tocoferoles [50]. Por lo tanto, PSO1 y PSO2, que se produjeron a partir del método de extracción en verde, se sugieren como aceites de semilla de calabaza alternativos para futuras aplicaciones.


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