Evaluación del efecto de la inmunidad de las mucosas de la vacuna de subunidad E2Fc y E2Ft del virus de la diarrea viral bovina

Abstracto:

Clasificada como enfermedad infecciosa de clase B por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), la diarrea viral bovina/enfermedad de las mucosas es una enfermedad aguda y altamente contagiosa causada por el virus de la diarrea viral bovina (BVDV). Las endemias esporádicas del BVDV a menudo provocan enormes pérdidas económicas en las industrias láctea y cárnica. Para arrojar luz sobre la prevención y el control del BVDV, desarrollamos dos nuevas vacunas de subunidades mediante la expresión de proteínas recombinantes de fusión del virus de la diarrea viral bovina E2 (E2Fc y E2Ft) a través de células HEK293 suspendidas. También evaluamos los efectos inmunológicos de las vacunas. Los resultados mostraron que ambas vacunas de subunidades indujeron una intensa respuesta inmune mucosa en los terneros. Mecánicamente, E2Fc se unió al receptor Fc (Fc RI) en las células presentadoras de antígenos (APC) y promovió la secreción de IgA, lo que llevó a una respuesta inmune de células T (tipo Th1) más fuerte. El título de anticuerpos neutralizantes estimulado por la vacuna de la subunidad E2Fc inmunizada por mucosas alcanzó 1:64, que fue mayor que el de la vacuna de la subunidad E2Ft y el de la vacuna intramuscular inactivada. Las dos nuevas vacunas de subunidades para la inmunidad de las mucosas desarrolladas en este estudio, E2Fc y E2Ft, se pueden utilizar como nuevas estrategias para controlar el BVDV mejorando la inmunidad celular y humoral.

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Palabras clave: BVDV; vacuna subunitaria; vacunación mucosa; adyuvantes moleculares; receptor Fc; ferritina

1. Introducción

El virus de la diarrea viral bovina (BVDV), junto con el virus de la enfermedad fronteriza (BDV) y el virus de la peste porcina (CSFV), pertenecen al género Pestivirus de la familia Flaviviridae [1]. Una combinación de infección persistente (PI) e infección citopática en terneros a menudo resulta en una enfermedad mucosa grave, con una mortalidad de hasta el 100% [2]. BVDV se distribuye ampliamente en el mundo, con una tasa relativamente alta de anticuerpos positivos. En China, los tipos prevalentes son 1B, 1M y 1Q del tipo-1 BVDV [3–5]. El análisis filogenético reveló que el virus de la diarrea viral bovina tipo 1 se importó a China en la década de 1960 y que al menos ocho genotipos BVDV-1 están en circulación en China. Entre ellos, 1B y 1m son los genotipos principales [6]. Esto es consistente con nuestra investigación epidemiológica del BVDV en el Tíbet. El virión esférico del BVDV tiene aproximadamente 40 a 60 nm de diámetro y está envuelto por una cápsula. El genoma viral de ARN monocatenario del BVDV tiene aproximadamente 12,5 KB de longitud. Posteriormente, la poliproteína viral se escinde mediante una combinación de proteasas virales y del huésped en cuatro proteínas estructurales (C, E0, E1, E2) y ocho no estructurales (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). 8]. BVDV-E2 posee una fuerte inmunogenicidad y la evidencia ha demostrado que los anticuerpos neutralizantes (NAbs) inducidos en animales infectados se dirigen principalmente a E2 [9]. Mientras tanto, las vacunas multivalentes de la subunidad E2 dirigidas a las principales cepas circulantes de BVDV pueden proporcionar protección parcial contra cepas homólogas. Una vacuna recombinante contra el herpesvirus construida con la proteína BVDV E2 y la proteína D del herpesvirus bovino 1 (BoHV-1) indujo respuestas inmunes específicas a ambos virus en el huésped después de la nebulización intranasal [10]. Por lo tanto, podría ser una buena estrategia controlar el BVDV empleando la proteína inmunodominante E2 del BVDV como vacuna de subunidad. La cavidad nasal es rica en linfocitos y células presentadoras de antígenos, proporciona un microambiente adecuado para la inmunización de las mucosas y protege las vacunas proteicas de la desestabilización por ácidos y álcalis. Además, la inmunoglobulina A (IgA) inducida por la vacuna intranasal y los linfocitos B y T de memoria residentes en el tracto respiratorio superior son capaces de bloquear eficazmente la replicación viral [11]. La inmunización a través de la cavidad nasal no sólo induce inmunidad mucosa sino que también estimula respuestas inmunes sistemáticas, que ejercen efectos protectores inmunológicos. Estudios anteriores han descubierto que los antígenos podrían administrarse completamente en el epitelio de la mucosa dirigiendo las vacunas de subunidades al receptor Fc neonatal (FcRn) de las células M en el epitelio de la mucosa, estimulando así eficazmente respuestas inmunitarias específicas [12-14]. Los efectos de inmunización del aerosol nasal se mejoran significativamente mediante la utilización de una vacuna recombinante soluble formada por la fusión de un adyuvante molecular y un antígeno inmune [15]. IgGFc interactúa con FcRn en la superficie de las células inmunes para participar en el transporte de IgG a través de superficies mucosas, mejorando la inmunogenicidad de las proteínas fusionadas con Fc en mamíferos [16]. Se informó que las proteínas de fusión IgGFc forman dímeros estables a través de enlaces disulfuro en la región bisagra de Fc para aumentar la vida media y la estabilidad de las proteínas recombinantes, mejorando así las respuestas inmunes celulares, mucosas y humorales [17,18]. Se han aplicado con éxito nuevas vacunas mediadas por IgGFc al virus de la influenza A (HA-HuFc) [19] y al virus de la peste porcina (CSFV-E2Fc) [20].

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La modificación adecuada de la superficie permite que las nanopartículas residan de manera estable en el sistema circulatorio sanguíneo [21]. Caracterizada por una gran superficie y una estructura esférica hueca, se informó que la ferritina (Ft) forma nanopartículas de 24 polipéptidos idénticos mediante el autoensamblaje con una variedad de proteínas de fusión expresadas, lo que promueve el reconocimiento y la captación de antígenos por parte de las células presentadoras de antígenos, lo que promueve el reconocimiento y la captación de antígenos por parte de las células presentadoras de antígenos. induciendo una fuerte respuesta inmune [22,23]. La ferritina se aplica ampliamente en el desarrollo de vacunas. La integración covalente del antígeno del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína de pico del SARS-CoV-2 y la ferritina no hemo autoensamblada de Helicobacter pylori da como resultado una potente producción de anticuerpos neutralizantes. Las nanopartículas de proteína ferritina también tienen una gran capacidad para mejorar la estabilidad del antígeno, superar barreras biológicas y lograr una administración dirigida. Como las nanovacunas pueden ser capturadas eficazmente por células dendríticas y macrófagos [24], las nanopartículas de ferritina son una plataforma nueva y prometedora para la administración de antígenos. Actualmente, las principales vacunas disponibles contra el BVDV son las vacunas inactivadas y las vacunas de subunidades, las cuales requieren una vacunación que requiere mucho tiempo y trabajo mediante inyección intramuscular. Mientras tanto, las vacunas inactivadas producidas a través de células MDBK son propensas a inducir pancitopenia neonatal bovina (BNP) [25]. Sin embargo, las vacunas subunitarias han mostrado perfiles de seguridad superiores [26]. Se ha demostrado que la inmunización intranasal dirige antígenos al receptor Fc R, provocando respuestas inmunes mucosas y sistémicas [15,16]. Sin embargo, los efectos inmunológicos de la inmunización intranasal con vacunas BVDV y la eficacia de BVDV-E2 combinada con adyuvantes moleculares (IgGFc y Ft) siguen estando poco estudiados. Por tanto, el desarrollo de vacunas mucosas con proteína BVDV-E2 para mejorar su eficacia inmune es una máxima prioridad en este campo. En el estudio actual, se generaron vacunas de subunidad Fc o Ft fusionadas con proteína E2 en células HEK293. Los hallazgos mostraron que la vacunación nasal con la vacuna de la subunidad E2Fc de BVDV fue más efectiva que la vacunación nasal con la vacuna de la subunidad E2Ft, lo que respalda aún más las indicaciones de que la proteína de fusión E2Fc es una opción de vacuna de la subunidad más potente.

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2. Resultados

2.1. La expresión de proteínas recombinantes en células HEK293 suspendidas

Los diagramas estructurales de E2, E2Ft y E2Fc se muestran en la Figura 1A. Los ensayos de inmunofluorescencia indirecta se realizaron por primera vez utilizando el anticuerpo monoclonal (mAb) BVDVE2 conservado para verificar la inmunoexpresión de proteínas de fusión recombinantes. Las células transfectadas con plásmidos que contienen genes E2, E2Ft o E2Fc emitieron una señal fluorescente, mientras que las células tratadas de forma simulada no exhibieron una señal fluorescente (Figura 1B). Esto indicó una fuerte expresión de E2, E2Ft y E2Fc en células HEK293. Para determinar si estas proteínas se expresaron de forma secretora, se recogieron los sobrenadantes de células HEK293 transfectadas con plásmidos que contenían genes E2, E2Ft o E2Fc después de 6 días. Los niveles de inmunoexpresión de cada proteína se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpo BVDV-E2. Los resultados demostraron que las células transfectadas con plásmidos que contienen genes de E2, E2Ft y E2Fc expresaron las proteínas correspondientes con masas moleculares de 45 kDa, 60 kDa y 80 kDa, respectivamente (Figura 1C). Los resultados de la tinción con SDS-PAGE y azul de Coomassie mostraron que las bandas de cada muestra eran consistentes con los resultados de la transferencia (Figura 1D). Para garantizar la especificidad y precisión para detectar la inmunoexpresión de proteínas, primero se realizaron ensayos de preabsorción de BVDV-E2 mAb y luego se realizaron ensayos de replicación viral y Western blot para testificar la especificidad de BVDV E2 mAb. Los resultados revelaron que el anticuerpo solo puede reaccionar con la proteína BVDV-E2 (Figura S1). En conjunto, la evidencia mostró que las proteínas recombinantes E2, E2Fc y E2Ft se expresaban abundantemente en las células HEK293.

Figura 1. Inmunoexpresión e identificación de las proteínas E2, E2Ft y E2Fc en células HEK293. (A) Los diagramas de construcción de BVDV-E2, BVDV-E2Ft y BVDV-E2Fc. (B) Detección de la inmunoexpresión de proteínas recombinantes mediante IFA; 48 h después de transfectarlas con E2, E2Fc o E2Ft, las células HEK293 se fijaron para IFA. Se aplicaron el anticuerpo monoclonal BVDV E2 y la IgG anti-ratón de cabra FITC como anticuerpo primario y secundario, respectivamente. El núcleo se tiñó con DAPI (azul). La barra de escala representa 20 µm. (C) Detección de proteínas recombinantes purificadas mediante transferencia Western. (D) Identificación de proteínas recombinantes purificadas mediante SDS-PAGE.

2.2. Activación del APC-Fc RI por BVDV-E2Fc

El reconocimiento del antígeno BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) por los macrófagos juega un papel importante en la activación de la respuesta inmune. Para detectar el efecto de activación de la proteína de fusión en el sistema inmunológico, se verificó in vitro la función de reconocimiento y la actividad fagocítica de la proteína de fusión por macrófagos alveolares bovinos (BAM). Los resultados mostraron que CD64 (Fc RI), detectado mediante marcadores de anticuerpo IgG anti-conejo de cabra marcado con Cy3- (rojo), se localizó en el citoplasma y la membrana celular de los macrófagos bovinos. E2Fc se detectó utilizando IgG anti-ratón de cabra (fluorescencia verde). Las imágenes se fusionaron para el análisis de la colocalización de CD64 (Fc RI) y E2Fc en macrófagos alveolares bovinos (color amarillo; Figura 2A). Por el contrario, CD64 no se localizó con E2 o E2Ft. Los resultados mostraron que la translocación de la proteína de fusión E2Fc a través de la barrera mucosa estaba mediada por Fc RI.

Figura 2. Activación del APC-Fc RI por BVDV-E2Fc. (A) El análisis de colocalización de CD64 (Fc RI) con la proteína E2Fc en BAM se detectó mediante microscopía confocal. CD64 (Fc RI) en BAM se tiñó con IgG anti-conejo de cabra anti-CD64 y marcada con Cy3- como anticuerpos primarios y secundarios, respectivamente.

La fagocitosis, la absorción de partículas por los macrófagos, se midió como tasa de fagocitosis. Las tasas de fagocitosis de microesferas conjugadas con FITC, proteína E2, E2Ft y E2Fc por los macrófagos alveolares bovinos fueron del 28,9%, 55,6%, 57,1% y 65,6%, respectivamente. En otras palabras, la tasa de fagocitosis de E2Fc fue mayor que la de E2Ft, lo que demostró además que la captura de antígenos por los monocitos se completaba mediante la unión de un receptor específico en su superficie con los ligandos correspondientes. Sin embargo, los macrófagos alveolares bovinos no poseían receptores para las proteínas E2 y E2Ft, y solo eliminaban cuerpos extraños mediante fagocitosis, que es el método de defensa más básico del cuerpo (Figura 2B).

2.3. Potentes respuestas inmunes mucosas y humorales inducidas por E2Fc in vivo

El procedimiento de inmunización de terneros se muestra en la Figura 3A. Los niveles de IgA y SIgA producidos por terneros inmunizados con la proteína de fusión se detectaron mediante ELISA indirecto. Se recogieron y detectaron muestras de suero, heces y mucosa nasal mediante un kit ELISA comercial. El grupo inmunizado con E2Fc exhibió los niveles más altos de IgA y SIgA en suero y mucosa, tanto en animales inmunizados por vía intramuscular como por vía mucosa (p < 0.01) (Figura 3B, C). No se observaron diferencias significativas en los niveles de IgA entre el grupo inmunizado con E2-E2-y el grupo inmunizado con E2Ft, pero sí difirieron en los niveles de SIgA (p <0,05). En conclusión, la proteína de fusión E2Fc fue capaz de inducir respuestas inmunes mucosas y humorales más potentes que otras proteínas.

2.4. E2Fc puede inducir respuestas inmunes de células T (tipo Th1) más fuertes contra BVDV en comparación con E2Ft in vivo

La citocina tipo Th{{0}}IFN- expresada por células T y células NK media la inmunidad celular, que es esencial para la eliminación del virus. Para detectar la distribución de células T CD4+ y CD8+ que expresan IFN en terneros, se aislaron linfocitos de las PBMC de terneros 35 días después de la inmunización. Los linfocitos se estimularon con BVDV inactivado y posteriormente se aplicó citometría de flujo para identificar las células T CD4+ y CD8+ secretoras de IFN- -. Los grupos inmunizados con mucosas con E2Fc y E2Ft exhibieron proporciones significativamente mayores de células T CD4+ y CD8+ secretoras de IFN- -en comparación con el grupo E2. El grupo que fue inmunizado por mucosas con E2Fc tuvo un nivel más alto de células T CD8+ secretantes de IFN- -CD3+ que el grupo inmunizado con BVDV inactivado (p < 0,05) (Figura 4). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en las células T CD4+ derivadas de CD4+ secretoras de IFN- -entre los grupos con E2Fc inmunizado con mucosa y con BVDV inactivado. En resumen, tanto la inyección intramuscular como la inmunización mucosa con E2Fc inducen respuestas inmunes de células T (tipo Th1) más fuertes contra el BVDV en comparación con E2Ft.

Figura 3. Diagrama de flujo de los experimentos de inmunización de terneros y respuestas inmunes humorales y mucosas inducidas por E2Fc in vivo. (A) Diagrama de flujo del experimento de inmunización de terneros y construcción de la vacuna de la subunidad BVDV. (B, C) La medición de los niveles de (B) IgA y (C) IgA secretora en los hisopos nasales, heces y muestras de suero recolectadas el día 14 después de la inmunización secundaria mediante ELISA. n=5, * p < 0.05 y ** p < 0,01

Figura 4. Respuestas inmunes de células T contra el BVDV in vivo. Porcentaje de células T (A) CD4+IFN- + y (B) células T CD8+IFN- + después de la estimulación en células mononucleares de sangre periférica bovina. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 y ** **p<0,0001.

2.5. La inmunización con vacunas de subunidades recombinantes aumenta el contenido de citocinas de tipo Th1-

Para verificar el efecto de la vacuna de subunidades recombinantes sobre las respuestas inmunes celulares, analizamos los niveles de proliferación de linfocitos y citocinas en la sangre periférica de terneros inmunizados. En primer lugar, se recogieron anticoagulantes de los terneros 49 días después de la inmunización. Los linfocitos fueron estimulados por el BVDV inactivado por luz ultravioleta después de la separación y se midieron los índices correlacionados. En comparación con el grupo de PBS, los índices de estimulación de linfocitos (SI) de los grupos inmunizados con las vacunas de subunidades (E2, E2Fc y E2Ft) aumentaron en diferentes grados, con el índice de estimulación de linfocitos más alto (p <0. 001) en los grupos de vacuna inmunizados con E2Fc y de vacuna inactivada (Figura 5A). Además, se aplicaron kits comerciales de ELISA tipo sándwich con doble anticuerpo contra IFN-, IL-2 e IL-4 bovinos para detectar los niveles de citoquinas de tipo Th1- y Th2-en sangre periférica de terneros inmunizados. En comparación con los terneros tratados con PBS, los niveles de IFN- e IL-2 expresados ​​en los terneros inmunizados fueron significativamente más altos que los de IL-4 a los 49 días después de la inmunización. Los niveles de IFN- fueron mayores en el grupo de IN-E2Fc que en el grupo de vacuna inactivada (p < 0,05), pero no hubo diferencias en IL-2 e IL-4 entre IM-E2Fc y los grupos de vacunas inactivadas (Figura 5B-D). Estos resultados sugirieron que la vacuna de la subunidad IN-E2Fc promovió significativamente la respuesta inmune celular de tipo Th1-en terneros.

Figura 5. Aumento del contenido de citoquinas de tipo Th1-después de la inmunización con vacunas de subunidades recombinantes. (A) La proliferación celular de linfocitos de sangre periférica de terneros después de la inmunización 49 días se detectó mediante un kit de ensayo de proliferación de linfocitos. (B-D) Las citoquinas Th1 y Th2 en sobrenadantes de linfocitos se detectaron mediante el kit ELISA tipo sándwich de doble anticuerpo IFN-, IL-2, IL-4 bovino. n=5, * p < {{10}}.05, ** p < 0,01 y *** p < 0.00

2.6. Los anticuerpos específicos del BVDV pueden ser fuertemente inducidos por vacunas recombinantes de las subunidades E2Ft y E2Fc in vivo

Se detectaron anticuerpos específicos del BVDV mediante ELISA para explorar la respuesta inmune humoral inducida por las vacunas de las subunidades E2, E2Ft y E2Fc. Los anticuerpos específicos del BVDV no pudieron detectarse en todos los terneros antes de la inmunización. Los niveles de anticuerpos inducidos por las vacunas de las subunidades E2Ft y E2Fc fueron significativamente más altos que los del grupo E2 21 días después del inicio (primera dosis) de la inmunización (p < 0.00 1). Los niveles de anticuerpos para la inmunidad de las mucosas a los 35 días (14 días después de la segunda dosis) y 49 días (14 días después de la tercera dosis) difirieron significativamente entre los grupos E2Ft y E2 (p <0,05). Además, E2Fc fue significativamente mayor que E2 (p <0,001). El nivel de anticuerpos del grupo de inmunización de la mucosa (grupos IN-E2Ft e IN-E2Fc) fue mayor que el del grupo de inyección intramuscular (grupos IM-E2Ft e IM-E2Fc), y el nivel de anticuerpos del grupo de vacuna inactivada no fue significativamente diferente al del grupo IN-E2Fc (Figura 6). En conjunto, las vacunas recombinantes de las subunidades E2Ft y E2Fc fueron capaces de inducir fuertes respuestas inmunes humorales, y la inmunidad de la mucosa fue superior a la de la inyección intramuscular, lo que indica que las vacunas recombinantes de las subunidades E2Fc y E2Ft eran altamente antigénicas.

Figura 6. Detección de anticuerpos en las muestras de suero de terneros inmunizados mediante ELISA los días 0, 21, 35 y 49 después de la inmunización. n=5, * p < 0.05 y *** p < 0,001

2.7. Anticuerpos neutralizantes contra BVDV inducidos por vacunas de subunidades recombinantes in vivo

Se recogieron muestras de sangre de la vena yugular de los terneros los días 0, 21, 35 y 49 después de la primera inmunización. Las muestras de suero se separaron asépticamente y se inactivaron en un baño de agua a 56 ◦C durante 30 min. Se realizaron ensayos de neutralización para determinar los niveles de anticuerpos en el suero separado. Los anticuerpos neutralizantes contra el BVDV se detectaron en grupos inmunizados por mucosas con vacunas de subunidades recombinantes, con un título del anticuerpo neutralizante E2Fc de hasta 1:64. Esto es comparable con la vacuna inactivada y mejor que las vacunas de subunidades recombinantes E2Ft y E2Fc inyectadas por vía intramuscular (Figura 7).

Figura 7. Detección de anticuerpos neutralizantes en las muestras de suero de terneros inmunizados los días 0, 21, 35 y 49 después de la inmunización. Las muestras de suero inactivado se diluyeron en proporción y se preincubaron con 200 TCID50 BVDV XZ02 durante 1 h. Posteriormente se agregaron muestras de suero a las células en placas 96-pocillos y se incubaron durante 72 h. Se emplearon anticuerpos anti-E2 de conejo e IgG anti-conejo de cabra conjugada con FITC como anticuerpos primarios y secundarios. n=5, * p < 0,05 y ** p < 0,01

3. Discusión

Se ha informado que la proteína E2 expresada en células de mamíferos es más eficaz para neutralizar la protección contra BVDV que la proteína E2 obtenida del sistema de expresión de insectos baculovirus (brE2) [27]. El cultivo en suspensión de células de mamíferos se caracteriza por un proceso más sencillo y un mayor rendimiento [28]. Las células HEK293 suspendidas son capaces de crecer en condiciones sin suero y el número de células es varias veces mayor que el del cultivo adherente, que puede usarse para la producción a gran escala de anticuerpos [29]. La eficiencia de expresión de pcDNA3.1 combinada con el sistema de expresión transitoria de células en suspensión eucarióticas aplicado en este estudio fue relativamente alta, y la proteína recombinante pudo recolectarse seis días después de la transfección, con una concentración de hasta 30 mg·L -1, lo que fue suficiente para la aplicación posterior en animales.

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El virus de la diarrea viral bovina invade principalmente el tracto respiratorio superior y el tracto digestivo, lo que causa rinorrea, tos, dificultad para respirar, elevación de la temperatura corporal y leucopenia, y es seguido por viremia una vez que el virus ingresa a la sangre. Por lo tanto, la vacunación intranasal inhalada podría proporcionar una protección más eficaz que las vacunas que se administran directamente en los sitios de infección del virus. Recientemente, se demostró que la inmunización intranasal puede presentar antígenos a los receptores Fc R y provocar respuestas inmunes mucosas y sistemáticas [16]. Además, la IgG1Fc bovina fue capaz de unirse al Fc R bovino, un receptor de alta afinidad para IgG [30]. Nuestros resultados proporcionaron evidencia de que el Fc de la IgG1 bovina podría unirse con el Fc RI en los macrófagos alveolares bovinos (BAM) para lograr el transporte transmucoso. Esto podría prolongar la longevidad de la proteína de fusión en el cuerpo y promover la producción de anticuerpos específicos. Nuestros resultados revelaron que el nivel de SIgA inducido por E2Fc inmunizado en mucosas fue significativamente mayor que el de E2 inmunizado en mucosas (p <0.{{30}}1). Sin embargo, solo se observó una pequeña diferencia entre el grupo de E2Fc inyectado por vía intramuscular y el grupo de E2 inmunizado por mucosas. Esto puede deberse al hecho de que la mucosa del intestino delgado y los ganglios linfáticos mesentéricos liberarían una pequeña cantidad de SIgA en respuesta a la inyección intramuscular de E2Fc con adyuvante 1313VG. Los niveles de IFN-provocados por la inmunización de las mucosas con E2Fc fueron significativamente mayores que los de la inmunización de las mucosas con E2 (p <0,01), la inmunización intramuscular con E2Fc y la inmunización de las mucosas con E2Ft. Los niveles de IL-2 provocados por la inmunización de la mucosa con E2Fc fueron significativamente más altos que los de la inmunización de la mucosa con E2 y la inmunización intramuscular con E2Ft (p <0,01). En el siguiente paso se detectaron los niveles generales de anticuerpos después de la tercera inmunización. Los resultados mostraron que la inmunización mucosa con E2Fc indujo niveles significativamente más altos de anticuerpos generales en comparación con la inmunización mucosa con E2 (p <0,001), mientras que los niveles de anticuerpos inducidos por E2Fc inyectado por vía intramuscular y E2 inmunizado por vía mucosa fueron comparables a los de E2Ft inyectado por vía intramuscular. grupo. Los efectos inmunes generales de la inmunización mucosa de la vacuna de la subunidad E2Fc fueron superiores a los de la inmunización intramuscular. La inmunización mucosa de E2Fc no solo indujo la secreción de SIgA sino que también provocó una respuesta inmune celular específica de tipo Th1- y una respuesta inmune humoral.

Se informó que la glicoproteína E2 del CSFV que se muestra en la superficie de las nanojaulas de ferritina indujo una potente expresión de las citocinas inmunes innatas IL-4 e IFN- en conejos [31]. También se demostró que una vacuna de nanopartículas desarrollada mediante la unión covalente de ferritina autoensamblada al dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 provoca una sólida respuesta inmune humoral y celular [24]. La cavidad nasal es rica en tejido linfoide asociado a la mucosa y demostramos que los niveles de SIgA inducidos por E2Ft inmunizado con mucosa eran más altos que los de E2 (p <0.05). Las células T CD4+ y CD8+ fueron significativamente mayores en el grupo E2Ft inmunizado por mucosas que en el grupo E2 (p <0,01). Las células T CD4+ y CD8+ desempeñan un papel vital en la defensa contra la infección viral [32]. Los resultados de la prueba de neutralización y del ensayo de anticuerpos también mostraron que la inmunización mucosa con E2Ft fue más efectiva que la inmunización con E2Ft y E2 intramusculares. Esto probablemente se debió a que el sistema de presentación y reconocimiento de antígenos del organismo fagocitó eficazmente la ferritina (E2Ft) con polímeros de 24 subunidades, lo que resultó en una respuesta de anticuerpos sensible y eficaz in vivo. Los anticuerpos son secretados por las células plasmáticas y los niveles de anticuerpos neutralizantes son un indicador importante para la detección de efectos inmunitarios. Cuando la potencia de los anticuerpos neutralizantes de la vacuna BVDV es superior a 1:24, indica que la vacuna es inmunogénica [33].

En este estudio, se realizaron ensayos de neutralización para evaluar los niveles de anticuerpos neutralizantes inducidos por las proteínas recombinantes E2. Por lo tanto, se recogió sangre venosa yugular de terneros inmunizados para detectar el nivel de anticuerpos IgG en suero. Los resultados mostraron que todos los terneros inmunizados produjeron diferentes grados de anticuerpos neutralizantes a los 14 días después de la segunda inmunización. Los niveles de anticuerpos neutralizantes en terneros del grupo E2Fc inmunizado por mucosas y del grupo de vacuna inactivada aumentaron significativamente y se mantuvieron en 1:64 a los 14 días después de la tercera inmunización (los títulos de anticuerpos neutralizantes se detectaron hasta la sexta semana). Sin embargo, vale la pena señalar que los niveles de anticuerpos neutralizantes de los grupos E2 y E2Ft inmunizados por mucosas y de E2Fc y E2Ft inmunizados por vía intramuscular se mantuvieron entre 1:8 y 1:16. Inferimos que los antígenos de la vacuna recombinante E2Fc son liberados lentamente por el receptor Fc, provocando así respuestas inmunitarias humorales y celulares prolongadas. Por el contrario, las otras cuatro vacunas de subunidades permanecen poco tiempo en el cuerpo debido a la falta del receptor correspondiente. Por lo tanto, puede ser necesaria una vacunación de refuerzo o un cambio de adyuvante para lograr los efectos inmunitarios esperados.

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4. Materiales y métodos

4.1. Virus y células

La cepa BVDV XZ02 tipo 1b (número de acceso de GenBank: MF278652) se aisló del Tíbet y se cultivó utilizando células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK). En nuestro laboratorio se conservó el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV). Las células MDBK se adquirieron de ATCC (ATCC-CCL-22) y se mantuvieron en DMEM (Cat NO. SH302403.01, HyClone, Shanghai, China), y las células de macrófagos alveolares bovinos (BAM) se mantuvieron en RPMI. {8}} (Nº de catálogo SH30027, Cytiva, Shanghái, China); todos los medios contenían un 10% de suero de caballo inactivado por calor (Cat NO. 16050122, Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se incubaron a 37 ◦C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2. Las células HEK293 suspendidas se adquirieron de ATCC (ATCC CRL-1573) y se cultivaron en un medio KOP293 sin suero (Cat NO. M21201121A, KAIRUI -biotech, Zhuhai, China).

4.2. Anticuerpos y kits de prueba

En este estudio se utilizaron los siguientes anticuerpos y kits de prueba: anticuerpo anti-BVDV E2 (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Reino Unido); anticuerpo anti-ratón de cabra HRP (n.º de catálogo ab205719, Abcam, Cambridge, Reino Unido); Anticuerpo anti-ratón Cy3-de cabra (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, EE. UU.); Anticuerpo anti-ratón de cabra FITC (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, Reino Unido); anticuerpo CD64 (Fc RI) (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, China); Anticuerpo IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor® 488 (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, Reino Unido); anticuerpo IgG anti-conejo Cy3-de cabra (Nº de catálogo ab6939, Abcam, Cambridge, Reino Unido); microesferas conjugadas con FITC (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, EE. UU.); Anticuerpo FITC-CD4 (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, EE. UU.); anticuerpo PE-CD8 (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, EE. UU.); anticuerpo IFN (Cat NO. MCA1783A, BIORAD, Hercules, CA, EE. UU.); Anticuerpo IgG anti-conejo de cabra FITC (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, EE. UU.). Los kits y reactivos incluyen el kit de detección de anticuerpos BVDV-E2 (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Shanghai, China); Kit de detección de IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, China); kit de detección de SIgA (Cat NO.177053b, CAMILO, Nanjing, China); kit de detección de IFN (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, China); kit de detección de IL-2 (Cat NO. 177028b, CAMILO, Nanjing, China); kit de detección de IL-4 (Cat NO. 1770131b, CAMILO, Nanjing, China); reactivo de transfección TA-293 (Cat NO. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, China); Medio de separación de linfocitos (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, EE. UU.).

4.3. Construcción de plásmidos

El E2 truncado (denominado en adelante E2) se generó eliminando la región transmembrana de E2 (número de acceso a la secuencia del gen: MF278652) utilizando la herramienta web TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/, consultado el 12 Enero de 2023) y agregando una etiqueta de histidina al extremo C (Figura 1A). La secuencia del gen se muestra en el Material complementario S1. El plásmido E2Fc se construyó añadiendo un fragmento Fc que contiene la región bisagra de la IgG1 bovina (número de acceso: x62916.1) al C-terminal de E2 con la posición ordinal de E2-región bisagra del péptido flexible sintético -CH2-Dominio CH3-6 × Su [20]. La secuencia del gen se muestra en el Material complementario S2. El plásmido E2Ft se construyó uniendo E2 a la ferritina de Helicobacter pylori (residuos 5-167) a través del conector (Gly)3Ser [34]. La secuencia del gen se muestra en el Material complementario S3. El péptido señal IL-2 se añadió al N-terminal de E2, E2Fc y E2Ft para facilitar la expresión secretora [35]. Los genes diana (E2, E2Ft y E2Fc) se clonaron en pcDNA3.1 con BamHI y XhoI, respectivamente.

4.4. Expresión y purificación de proteínas.

Se transfectaron aproximadamente 10{{30}} ml de células HEK293 suspendidas en la etapa exponencial (aproximadamente 2 ~ 4 × 106 células/ml) con los plásmidos correspondientes. Brevemente, se añadieron 5 ml de KPM (tampón de transfección) y 100 µg de ADN plasmídico estéril a un tubo de centrífuga estéril, y 5 ml de KPM y 500 µl de TA-293 (Cat NO. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, China ) se agregaron reactivos de transfección a otro tubo de centrífuga estéril. Luego, se añadió un reactivo de transfección diluido al plásmido diluido y se mezcló completamente. Después de una incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, se añadió a las células un complejo de reactivo de transfección de ADN, acompañado de agitación. Las células se incubaron en una incubadora humidificada a 37 ◦C con 5% de CO2 a una velocidad de agitación de 140 rpm/min. Las células se recogieron seis días después de la transfección mediante centrifugación durante 30 minutos a 12 000 rpm/min y se filtraron con un filtro de 0,22 mm para eliminar los restos celulares residuales. Las columnas de cromatografía de afinidad de níquel (Cat NO. 17531801, GE, Boston, MA, EE. UU.) se emplearon para la purificación por afinidad marcada con histidina (His) de las proteínas E2, E2Ft y E2Fc [36]. Brevemente, se agregaron muestras de 100 ml a columnas de afinidad a una velocidad de 1 ml/min. Posteriormente, las columnas se lavaron con cinco volúmenes de columna (CV) de tampón A (PBS 0,1 M, NaCl 300 mM, 5 mM) a una velocidad de 1 ml/min. Finalmente, se permitió que fluyeran gradientes de concentración de imidazol (de 0 a 500 mM) a través de la columna a una velocidad de 1 ml/min para recoger el líquido correspondiente al pico principal. Las concentraciones de proteínas se cuantificaron con un kit de detección de proteínas BCA. Las proteínas recolectadas se utilizaron además para el análisis de transferencia Western.

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4.5. Transferencia occidental

Las proteínas se separaron usando SDS-PAGE. Después de transferirlas a la membrana del filtro NC, las proteínas se bloquearon con leche desnatada en polvo al 2% durante la noche a 4 ◦C y posteriormente se incubaron con anticuerpo anti-BVDV E2 (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Reino Unido) durante 2 h a temperatura ambiente. . Después de lavarlas tres veces con TBS-T, las membranas se incubaron con anticuerpos anti-ratón de cabra HRP (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavarlo tres veces con TBS-T, se empleó el sistema de quimioluminiscencia ECL para detectar la inmunoexpresión de proteínas.

4.6. Inmunofluorescencia indirecta

Para la detección por inmunofluorescencia de la inmunoexpresión de proteínas recombinantes, se transfectaron células HEK293 con plásmidos que expresaban E2, E2Ft y E2Fc; 48 h después de la transfección, las células se fijaron con paraformaldehído durante 15 min. Después de lavarlas tres veces con PBS, las células se permeabilizaron con 0.5% Trition-X100 durante 15 min. Después de un lavado intensivo con PBS, las células se bloquearon posteriormente con BSA al 2% y se incubaron con un anticuerpo monoclonal BVDV E2 diluido 1:500 (preparado en nuestro laboratorio) a 37 ◦C durante 2 h. Se aplicaron Cy3 (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, EE. UU.) o anticuerpos anti-ratón de cabra conjugados con FITC (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, Reino Unido) como anticuerpo secundario. Los núcleos se tiñeron con DAPI durante 10 min a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron mediante microscopía confocal (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Alemania) [37].

4.7. Orientación a APC de la proteína de fusión recombinante E2Fc

Se realizó un análisis de colocalización por inmunofluorescencia para confirmar la unión de la proteína de fusión BVDV-E2Fc al Fc RI en macrófagos alveolares bovinos (BAM). Brevemente, se añadieron 3 µg de E2, E2Ft o E2Fc purificados a macrófagos alveolares bovinos. Después de la incubación durante 12 h a 37 ◦C, las células se lavaron con 0.BSA al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron con metanol/acetona (1:1) a 20 ◦ C. Posteriormente, las células se permeabilizaron con Trition-X100 al 0,5% durante 15 min y se bloquearon con BSA al 2% a 37 ◦C durante 2 h. Luego, las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con el anticuerpo monoclonal BVDV E2 (fuente de ratón; preparado en nuestro laboratorio) y el anticuerpo policlonal bovino CD64 (Fc RI) (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, China) durante 2 h. Las células se lavaron tres veces con PBS y se cubrieron con IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor® 488 (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y anticuerpo IgG anti-conejo de cabra marcado con Cy3- (Cat NO. ab6939, Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 1 h a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes se fotografiaron mediante colocalización por inmunofluorescencia (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Alemania).

4.8. Determinación de la tasa fagocítica de macrófagos alveolares bovinos

Para determinar los efectos de las proteínas recombinantes E2, E2Ft y E2Fc en la fagocitosis de macrófagos alveolares bovinos (BAM), se preincubaron macrófagos alveolares bovinos a una concentración de 1 × 106 células/ml con proteínas recombinantes. E2, E2Ft o E2Fc (todas las concentraciones se ajustaron a 350 ng/mL) durante 4 h. Después de lavar tres veces con PBS, se agregaron a cada pocillo 10 µL de microesferas conjugadas con FITC (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, EE. UU.) y 990 µL del medio RPMI-1640 . Después de 2 h de incubación, las células se lavaron con PBS para eliminar las microesferas extracelulares conjugadas con FITC. Los macrófagos adherentes se digirieron con tripsina (Gibco) que contenía EDTA al 0,05% y la digestión se terminó con el medio completo 1640 después de la digestión completa. Luego se agregaron las células a la capa superior de 10 ml de PBS con 0,45 g de glucosa y 0,3 g de BSA, seguido de una centrifugación en gradiente a 400 x g durante 10 minutos. Las células separadas se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron con 800 µl de PBS. La intensidad de la fluorescencia a 488 nm se determinó mediante el citómetro de flujo Beckman (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, CA, EE. UU.).

4.9. Procedimiento de preparación y vacunación de vacunas.

Se emulsionaron E2, E2Ft y E2Fc expresados ​​con HEK{{0}} con adyuvante IMS 1313VG (Seppic, Francia) en proporciones iguales hasta una concentración final de proteína de 200 µg/mL, y se almacenaron a 4 ◦C después de la inspeccion de calidad. Los anticuerpos BVDV-E0 y BVDV-E2 negativos (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) 3-terneros de un mes (n=35) fueron dividido en siete grupos iguales. Los terneros de cuatro grupos fueron inmunizados por la mucosa nasal (in) con PBS, E2, E2Ft y E2Fc, respectivamente. A los terneros de los tres grupos restantes se les inyectaron por vía intramuscular (im) vacunas inactivadas E2Ft, E2Fc y BVDV como control positivo (Cat NO. 202002003, Huaweit, Jiangsu, China). Los terneros fueron vacunados los días 1, 21 y 35 del experimento, y a cada ternero se le inoculó 1 ml de vacuna con una concentración de proteína de 200 µg/mL. Se extrajo sangre de terneros los días 1, 21, 35 y 49 del experimento para otros índices (Figura 3A). Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Agrícola de Huazhong, Hubei, China (No. HZAUCA-2022-0011).

4.10. Producción de IgA en las heces y el suero.

Se recogieron hisopos nasales, heces y muestras de suero de terneros el día 14 después de la inmunización secundaria. Las heces frescas de vaca se diluyeron en una suspensión fecal al 15 % con PBS, la suspensión se centrifugó a 18,{3}} × g a 4 ◦C durante 30 min y el sobrenadante se recogió para su uso posterior. Los hisopos nasales se recogieron girando el hisopo de algodón esterilizado profundamente en la cavidad nasal de la vaca durante 6 a 8 vueltas. Los hisopos se colocaron en un tubo de PBS que contenía penicilina-estreptomicina al 1% y se mezclaron ampliamente. Las muestras se centrifugaron a 18,000×g a 4 ◦C durante 10 min y el sobrenadante se recogió para su uso posterior. Se recogieron muestras de sangre bovina con un tubo anticoagulante que contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)-- y las muestras de suero se obtuvieron centrifugando las muestras de sangre a 4 ◦C y 400 g durante 5 minutos. IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, China) y SIgA se detectaron con el kit ELISA (Cat NO.177053b CAMILO, Nanjing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4.11. Análisis de citometría de flujo

Las frecuencias de células T CD- -que producen IFN3+CD4+ y CD3+CD8+ entre los linfocitos CD3+ en la sangre fueron analizados mediante citometría de flujo. Las muestras se recogieron 14 días después de la vacunación de refuerzo [36]. Se resuspendieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se diluyeron a 1 x 106 células/ml con medio RPMI-1640 completo, se estimularon con BVDV XZ02 inactivado por UV (MOI=0.1) y se incubaron a 37ºC. ◦C con 5% CO2 durante 72 h. Se utilizó concanavalina A (Con A) (5 µg/ml; Sigma) como control positivo. Se añadió el inhibidor del transporte de proteínas brefeldina A (BFA, 3 µg/ml, eBioscience) a todas las muestras 12 h antes de la recolección de células para bloquear la secreción de IFN-. Se transfirió una cantidad de 200 µl de la célula a tubos FCM y se tiñó con el anticuerpo CD4 marcado con FITC (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, EE. UU.) durante 30 minutos a 4 ◦C en la oscuridad. Después de lavarlas tres veces con PBS, las células se incubaron con el anticuerpo CD8 marcado con R-PE (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, EE. UU.). Después de lavarlas tres veces, las células se incubaron con el anticuerpo anti-IFN bovino de ratón (Nº de catálogo MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, CA, EE. UU.) durante 20 minutos en la oscuridad para la tinción con citocinas intracelulares. Después del lavado, las células se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 1%. La citometría de flujo se realizó con el citómetro de flujo FACS Caliber (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.) y los datos se recopilaron y analizaron como se describió anteriormente [38].

4.12. Proliferación de linfocitos y detección de citocinas

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) anticoaguladas de cada ternero se aislaron utilizando un medio de separación de linfocitos (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, EE. UU.) el día 49 después de la inmunización. Los linfocitos de sangre periférica bovina se diluyeron con medio FBS 1640 al 10% hasta 1 x 106 células/ml. Luego, se agregaron 100 µl de células diluidas a cada pocillo de una placa de 96-pocillos y se estimularon con BVDV inactivado por UV, concanavalina (control positivo) o medio de cultivo (control negativo), respectivamente. Después de 72 h de incubación a 37 ◦C con 5% de CO2, se agregaron 30 µL de MTS a cada pocillo y las células continuaron cultivándose a 37 ◦C durante 1 h según las instrucciones del fabricante. La absorbancia a 492 nm se midió con un analizador de microplacas automatizado. El título de proliferación de linfocitos de cada muestra se determinó mediante el índice de estimulación (SI). SI calculado=(OD de la muestra-OD del control en blanco)/(OD de la muestra negativa-OD del control en blanco) [39]. Se detectaron interferón (IFN)-, interleucina (IL)-2 e interleucina (IL)-4 mediante kits de ELISA. Brevemente, las PBMC se aislaron y se diluyeron a 4 x 106 células/ml con medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10 % y se colocaron en placas de cultivo de tejidos 24-pocillos. Las células se estimularon con BVDV XZ02 inactivado (MOI=1) durante 48 h a 37 ◦C y posteriormente se recogió el sobrenadante. El IFN- (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, China), IL-2 (Cat NO. 177028b, CAMILO, Nanjing, China) e IL-4 (Cat NO. 1770131b, CAMILO, Nanjing, China) se detectaron utilizando los kits ELISA correspondientes según las instrucciones del fabricante. El contenido de IFN-, IL-2 e IL-4 en la muestra se calculó utilizando la curva estándar.

4.13. Pruebas serológicas

Para detectar anticuerpos E2/E0, se recolectaron muestras de sangre de cada ternero los días 0, 21, 35 y 49 después de la inmunización. Las muestras de suero se recogieron centrifugando muestras de sangre a 1000 x g durante 20 minutos. Las muestras de suero se procesaron de acuerdo con los requisitos del kit de detección de anticuerpos BVDV E2 (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China). Las microplacas recubiertas con el antígeno BVBV E2 se equilibraron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, se agregaron a la microplaca 50 µL de control negativo, control positivo y muestras de suero, respectivamente. Posteriormente se añadió a la microplaca una cantidad de 50 µL de anticuerpo de detección marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y se incubó a 37 ◦C durante 60 min. Después de lavarlo cinco veces con un tampón de lavado, se añadió una solución cromogénica para medir la absorbancia del lector de microplacas a 450 nm para determinar el nivel de anticuerpo E2 en cada grupo de inmunización. Se empleó el método de dilución de suero de virus fijo para detectar el nivel de anticuerpos neutralizantes de las muestras de suero. Brevemente, las muestras de suero inmune completamente inactivadas se diluyeron de 2-1 a 2-12, y se agregaron 50 µl de suero en cada título de dilución a las placas de 96-pocillos. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 50 µl de solución de virus diluida que contenía 200 TCID50- BVDV XZ02. Las placas se agitaron y mezclaron suavemente. Después de 1 h de incubación a 37 ◦C, se agregaron células MDBK con una concentración de 5 × 105 células/mL a placas de pocillos 96- y se incubaron a 37 ◦C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 durante 72 h. Para detectar el efecto neutralizante de las muestras de suero, las células se trataron con el anticuerpo específico de E2-como anticuerpo primario (n.º de catálogo orb312169, Biorbyt, Cambridge, Reino Unido) e IgG anti-conejo de cabra conjugada con FITC como anticuerpo secundario. anticuerpo, (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, EE. UU.). Una señal fluorescente verde típica indicó la ausencia de neutralización. Las fotografías se tomaron con un microscopio de fluorescencia (TE2000, Nikon, Tokio, Japón). El título de neutralización del suero se calculó según el método de Reed-Muench y se determinó como título de neutralización del suero la dilución máxima de suero que podría inhibir completamente la fluorescencia.

4.14. Detección de especificidad del anticuerpo monoclonal BVDV E2

Primero se realizaron ensayos de preabsorción del anticuerpo monoclonal BVDV E2, seguidos de ensayos de replicación viral y transferencia Western para testificar la especificidad del mAb BVDV E2. Para el ensayo de replicación viral, se preincubaron 400 TCID50 de BVDV con PBS y 100 µg o 200 µg de mAb E2 a 37 ◦C durante 1 h, respectivamente. Después de la incubación, el BVDV pretratado se inoculó en células MDBK y las células se cultivaron a 37 ◦C en una incubadora humidificada. Las células se recogieron a las 18 o 24 hpi (hora post-infección) y se extrajo el ARN con reactivo TRIZOL. Se realizó RT-qPCR para determinar la expresión relativa del gen BVDV E2. Para el ensayo de transferencia Western, el mAb E2 se preincubó con Tween20, proteína PEDV S o proteína BVDV E2 en TBS-T durante 2 h a 4 ◦C, respectivamente. El mAb E2 pretratado se sometió a un ensayo de transferencia Western como anticuerpo primario para detectar la reacción a la proteína BVDV E2 o PEDV S.

4.15. Análisis estadístico

Para todos los análisis se utilizó el programa estadístico GraphPad Prism. Se utilizó la prueba t no apareada de dos colas para analizar los datos y producir los valores de p (*, p < 0.05; **, p < 0.{{ 8}}1; ***, p < 0,001, **** p < 0,0001). Salvo que se indique lo contrario, los datos se muestran como media ± DE.

5. Conclusiones

En nuestro estudio, se expresaron tres proteínas recombinantes, BVDV-E2, BVDV-E2Ft y BVDV-E2Fc, y se generaron las vacunas de subunidades correspondientes. Las pruebas in vivo demostraron que la vacuna de la subunidad E2Fc era más eficaz que la E2Ft y la E2, tanto en la inmunización mucosa como intramuscular. Confirmamos que los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos por E2Fc y E2Ft inmunizados con mucosas fueron 1:64 y 1:16, respectivamente, lo que indica además que E2Fc se unió con Fc RI en macrófagos alveolares bovinos para lograr el transporte transmucoso. La vacunación de las mucosas con la vacuna multivalente de la subunidad E2Fc de la principal cepa epidémica del BVDV mejoró significativamente los efectos inmunitarios y es adecuada para su uso práctico. Nuestro estudio proporciona una solución a la vacunación convencional que requiere mucho tiempo y mano de obra mediante el empleo de una vacuna mucosa. La proteína BVDV E2 es un objetivo ideal para los anticuerpos neutralizantes, y se espera que las proteínas de fusión E2Fc y E2Ft construidas en este estudio se apliquen aún más como vacunas subunitarias seguras y eficaces contra la infección por BVDV.

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