Estudio experimental del efecto protector del pretratamiento de los glucósidos de cistanque en la lesión por isquemia-reperfusión renal

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Zhu Jun, Zhao Ximin

(Departamento de Cirugía, Hospital del Distrito de Baoshan de Medicina Tradicional China y Occidental Integrada, Shanghai 201900)

【Resumen】Objetivo Establecer un modelo de reanimación de shock hemorrágico en ratas y observar el efecto protector deCistancheglucósidos totales (CTG) en la lesión por isquemia-reperfusión renal. Métodos Las ratas SD se dividieron aleatoriamente en 3 grupos: grupo de operación simulada, grupo experimental (grupo de reanimación de choque), grupo de tratamiento con CTG, 10 ratas en cada grupo. El grupo experimental y el grupo de tratamiento con CTG establecieron modelos de isquemia-reperfusión renal. Las ratas en el grupo de tratamiento fueron inyectadas con CTG 400 mg / kg por vía intraperitoneal, y el grupo experimental y el grupo de operación simulada fueron inyectados con solución salina. Se detectó el contenido de miocardio en sangre, el contenido de nitrógeno ureico y la cistatina C de cada grupo para determinar la función renal, se utilizó el análisis de citometría de flujo para detectar la tasa de apoptosis de células renales; Se utilizó el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) para detectar la vinculación del cromosoma X en ratasriñónexpresión tisular del inhibidor ligado al cromosoma X de la proteína de apoptosis (XIAP). Resultados Comparando el grupo CTG con el grupo experimental, la sangre Cr, BUN y Cistatina C se redujeron significativamente (P<0.01), renal="" cell="" apoptosis="" was="" reduced=""><0.05), ctg="" can="" significantly="" increase="" the="" expression="" of="" xiap=""><0.05). conclusion="" the="" total="" glycosides="" of="">cistanchetienen un efecto protector sobre la lesión por isquemia-reperfusión renal en ratas, que puede estar relacionada con la promoción de la expresión de XIAP.

[Palabras clave] riñón; lesión por isquemia-reperfusión; glucósidos totales de cistanche; inhibidor ligado a cromosomas de la proteína de apoptosis; apoptosis; rata

[Número de clasificación de la biblioteca china] R692 [Código de marcado del documento] A [Número de artículo] 1008 -0392 (2015) 02-0037 -04

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La lesión por isquemia-reperfusión (I / R) es un fenómeno fisiopatológico común de daño renal en el proceso de shock hemorrágico, trauma severo,riñóntrasplante, yriñóncirugía tumoral. Los estudios han demostrado que la apoptosis es una parte importante del daño de la función renal causado por la lesión I/R (1). El inhibidor ligado al cromosoma X de la proteína de apoptosis (XIAP) es uno de los inhibidores de la apoptosis endógena más fuertes encontrados hasta ahora (2). Hay pocos estudios sobre el efecto antiapoptótico de XIAP en el tejido renal después de una lesión I/R.CistancheGlucósidos totales (CTG) es un compuesto feniletanoide de glucósidos totales extraído deCistanche, que tiene diversas funciones biológicas. Hay pocos estudios sobre su protección renal después de una lesión I/R. . Este estudio estableció un modelo de reanimación de shock hemorrágico en ratas y estableció un modelo de lesión sistémica I/R para explorar el efecto protector de los glucósidos totales de la hernia cárnica sobre elriñónde la lesión I/R y explorar su posible mecanismo.

1Materiales y métodos

1.1 Animales y agrupación

Hay 30 ratas macho limpias y sanas proporcionadas por el Centro Experimental de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghai, que pesan (320 ± 30) g. Dividido aleatoriamente en 3 grupos: grupo de operación simulada, grupo experimental (grupo de reanimación de choque), grupo CTG, cada uno con 10 ratas.

1.2 Principales reactivos e instrumentos

Los glucósidos totales del arroz glutinoso (número de lote: 20081516) se compraron a Zhejiang Hangzhou Xinghui Tianli Pharmaceutical Co., Ltd.; pentobarbital de sodio, Hoechst 33258 y yoduro de propionilo se compraron a Sigma, EE. UU.; el inhibidor de la apoptosis ligado al cromosoma X de ratón Protein Assay Kit (XIAP) y el ELISA Kit fueron comprados a Shanghai Kemin Biotechnology Co., Ltd.; el lector de microplacas se compró en Thermo Company, EE. UU.; el detector fisiológico multiparamétrico fue comprado a Nihon Kohden Company, Japón; citómetro de flujo BDFACSAria fue comprado a Becton, USA -Dickinson Company; El trocar 24G fue comprado a Shandong Jierui Medical Devices Company.

1.3 Método experimental

1.3.1 La preparación de ratas modelo animal SD se ayunó 12 horas antes del experimento y se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg).

La rata se fijó en posición supina, se hizo una incisión de 3 cm en la parte inferior izquierda del abdomen, se separó la arteria femoral, se insertó un trocar 24G y se conectó un detector fisiológico multiparamétrico. La presión arterial promedio de la rata se midió como (113 ± 15) mmHg, 20 ml de heparina de jeringa La presión arterial se redujo a 40 mmHg (l mmHg = 0. 133 kPa) con un dispositivo de conexión química de tres vías. Se consideró que el choque había comenzado y la presión arterial se mantuvo durante 90 minutos. El volumen de sangría fue de (13 ± 3) ml, y luego la sangre autóloga en la jeringa La reinfusión lenta tarda unos 30 minutos, y la presión arterial vuelve a más del 90% del valor básico, y la reanimación se considera exitosa (3). Se extrajo el trócar, se abrió la arteria femoral y se suturó la incisión. Después de que las ratas estaban despiertas, fueron devueltas a la jaula para observación, y fueron libres de comer y beber. 24 h después de la reanimación, se utilizó la inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg / kg) para la anestesia, la laparotomía, se recolectaron 5 ml de sangre de la vena cava inferior, las ratas se sacrificaron inmediatamente y se sacaron los riñones izquierdo y derecho para su uso.

1.3.2 Métodos de medicación El grupo de tratamiento con CTG recibió CTG 2 horas antes de la sangría de las ratas y se inyectó en la cavidad abdominal a una dosis de 400 mg / kg. El grupo experimental fue inyectado intraperitonealmente con 3 ml de solución salina normal 2 horas antes de la sangría; el grupo de operación simulada solo se sometió a anestesia, laparotomía y separación de la arteria femoral, colocación de un trócar y sutura de la incisión, pero no sangrado ni reanimación. El resto eran los mismos que el grupo experimental.

1. 4 indicadores y métodos de detección

1.4.1 Determinación del contenido de BUN, Cr y cistatina C en sangre La cistatina C es un marcador endógeno de cambios en la tasa de filtración glomerular. Cuando la función renal se ve afectada, la tasa de filtración glomerular disminuye, la concentración de cistatina C en la sangre puede aumentar 10 veces y la precisión diagnóstica de la cistatina C es significativamente mejor que la de la intoxicación muscular sérica. El contenido de BUN, Cr y Cistatina C en sangre se sometió al laboratorio de nuestro hospital para su determinación.

1.4.2 Determinación de la tasa de apoptosis celular Se utilizó la citometría de flujo para detectar la tasa de apoptosis de las células renales. Tome el riñón y córtelo con una cuchilla, agregue un poco de PBS y transfiéralo a un tubo de ensayo. Agregue tripsina al 0.3% para digerir en un baño de agua de 37 P, incube durante 20 minutos, cuando el contenido en el tubo de ensayo se vuelva turbio, agregue 2 veces PBS para detener la digestión, filtre con una malla de nylon de malla 300, deseche las impurezas y centrífuga en una centrífuga de baja temperatura. Radio de centrífuga 8 cm, 12,000 r / min, centrífuga durante 5 min, deseche el sobrenadante, ajuste la concentración celular a 1 ~ 1.5 x 106 / ml, tome 0.4 ml de la suspensión celular anterior y agregue 1.2 ml Hoechst 33258 (10 pil / ml), oscuro 37 t: incube en un baño de agua, cubra el tubo de ensayo, enjuague con PBS después de 5 min, radio de centrífuga 8 cm, 12 000 r/min, centrífuga durante 5 min, deseche el sobrenadante, enjuague de nuevo de la misma manera. Agregue 0,4 ml de PI, teñido durante 5 minutos, y detecte el porcentaje de células normales, necróticas y apoptóticas en el riñón. De acuerdo con la afinidad de los dos colorantes de varios tipos de células, se sabe que solo las células de color PI son células muertas, solo las células de color Hoechst 33258 son células apoptóticas, y ninguna de ellas es de color células vivas normales.

1.4.3 Inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) para detectar la expresión de XIAP en tejidos renales de rata Tome cada grupo de riñones y trate los tejidos renales frescos con lisado tisular. Centrifugadora en una centrífuga de baja temperatura a 12 000 r/min durante 5 min. Tome el sobrenadante y opere de acuerdo con las instrucciones del kit XIAP ELISA Kit. Shanghai Jiaotong University Fenghe Technology Co., Ltd. es responsable de las pruebas.

1.5 Procesamiento estadístico

Los datos experimentales de cada grupo están representados por Yuan suelo s y SPSS 17. El software 0 se utiliza para el análisis estadístico. P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

Cistanche puede mejorar la función sexual

2 resultados

Los índices de función renal Cr, BUN y Cistatina C fueron estadísticamente significativos (F<0.01); the="" experimental="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" the="" sham="" operation="" group="" (p=""><0.01), indicating="" that="" the="" rat="" the="" kidney="" i/r="" model="" was="" successfully="" prepared;="" compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" values="" of="" cr,="" bun="" and="" cystatin="" c="" in="" the="" ctg="" group="" were="" significantly="" reduced=""><0.01). renal="" cell="" apoptosis="" rate:="" in="" the="" sham-operated="" group,="" only="" a="" few="" cells="" in="" the="" kidney="" tissue="" experienced="" apoptosis.="" apoptotic="" cells="" accounted="" for="" 0.42%="" ±="" 0.08%,="" and="" the="" experimental="" group="" had="" a="" significant="" increase="" in="" apoptosis,="" accounting="" for="" 18.="" 22%="" ±="" 5.="" 32%="" (p=""><0.01). compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" ctg="" group="" showed="" apoptosis="" the="" number="" decreased="" to="" 12.71%="" ±="" 3.81%="">< 0.01).="" the="" effect="" of="" ctg="" on="" the="" expression="" of="" xiap="" in="" i/r="" injured="" renal="" tissue:="" the="" sham="" operation="" group="" only="" had="" weak="" xiap="" expression,="" while="" the="" experimental="" group="" xiap="" expression="" increased="" significantly,="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" ctg="" group="" can="" significantly="" increase="" the="" expression="" of="" xiap="" (f=""><0.05), see="" table="">

Tabla 1 Índices de función renal Valores de Cr, BUN y Cistatina-C de ratas en cada grupo Tab. 1 Índices de función renal en tres grupos

En comparación con el grupo de operación simulada, *P<0.01; compared="" with="" the="" experimental="" group,=""><0.05><>

El mecanismo de la lesión renal por isquemia-reperfusión es muy complicado. Es un proceso patológico que ocurre de muchas maneras bajo la acción de diversos factores, como la sobrecarga de iones de calcio, el daño por peroxidación lipídica, la apoptosis celular y la necrosis, entre los cuales la apoptosis celular dependiente de caspasa es una de las principales formas de daño celular epitelial tubular renal inducido por lesión renal I / R (4). El inhibidor de la familia de las proteínas de apoptosis (IAP) es el único inhibidor endógeno de la caspasa que se encuentra en las células de mamíferos hasta ahora, lo que puede prevenir eficazmente la aparición de apoptosis celular. XIAP es el miembro con el efecto inhibitorio más fuerte sobre la caspasa en la familia IAP. Puede inhibir la apoptosis celular causada por una variedad de estímulos patológicos y desempeñar un efecto protector sobre los órganos dañados (5).

En la actualidad, la mayoría de los métodos para establecer modelos animales de lesión renal I/R son extirpar un riñón y sujetar el otro lado del pedículo renal o arteria renal (6) para simular el estado del trasplante renal. Este estudio utiliza un modelo de shock hemorrágico / reanimación, que está más cerca del proceso fisiopatológico de isquemia-reperfusión sistémica que ocurre en el shock traumático clínico. En este experimento, los niveles sanguíneos de BUN, Cr y cistatina C de ratas SD Mejora significativa, función renal gravemente deteriorada, es un modelo animal ideal para estudiar la lesión renal I / R.

CTG es un ingrediente medicinal importante de la pasta de carne de niña de la medicina tradicional china. La pasta de berenjena, que es de naturaleza cálida, dulce y salada, regresa al meridiano del riñón y del intestino grueso y originalmente estaba contenida en la Materia Médica de Shennong. "Ben Sutra": Cinco labores principales y siete lesiones, nutrir el medio, nutrir los cinco órganos internos, fortalecer el yin, nutrir la esencia y el qi;Cistanchese ha utilizado en mi país durante dos mil años. Ocupa el puesto número 1 en fórmulas para aumentar la fuerza en el pasado y ocupa el puesto número 2 en fórmulas nutritivas después del ginseng. Los estudios han demostrado queCistancheenlatarmejorar la función sexual,regular neuroendocrinaymejorar la función inmune. ,Antioxidantes, promover el metabolismo material, proteger el miocardio isquémico y otras funciones. Como el principal ingrediente medicinal del puré de la familia de la carne, CTG tiene muchas funciones. La investigación sobre modelos de isquemia-reperfusión cerebral encontró que CTG puede reducir los aminoácidos excitadores en el tejido cerebral después de la isquemia-reperfusión y proteger el tejido cerebral de ratas SD (7). CTG tiene unefecto antioxidanteen los tejidos de ratón y tiene un cierto efecto protector sobre la hipoxia cerebral aguda en ratones y el daño muscular cardíaco en ratones (9). CTG puede mejorar significativamente el neuroconducto deParkinsonmodelar ratones e inhibir la disminución en el número de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra (9). Al mejorar la actividad de las enzimas eliminadoras de radicales libres, prevenir la peroxidación lipídica, inhibir la deposición del péptido B-amiloide en el cerebro e inhibir la apoptosis de las células cerebrales, CTG mejora significativamente el aprendizaje deAlzheimerratones causados por el péptido B-amiloide Capacidad de memoria w. Este estudio mostró que después de la aplicación del pretratamiento con CTG, el contenido de BUN, Cr y cistatina C en sangre de las ratas disminuyó significativamente y el daño renal se redujo. CTG aumentó la proteína inhibidora de la apoptosis XIAP en el tejido renal lesionado I / R y bloqueó la apoptosis celular. La aparición de la muerte tiene un efecto protector sobre el daño al riñón.