AbstractoLas actividades antiinflamatorias de la piel de los extractos de pétalos de rosa se han descrito en nuestro estudio anterior. Debido a que la inflamación de la piel está estrechamente relacionada con el envejecimiento de la piel, nuestro estudio investigó los efectos de los pétalos de Rosa gallica en las actividades relacionadas con el envejecimiento de la piel, como el blanqueamiento de la piel y las propiedades antiarrugas. Cada muestra se preparó mediante extracción utilizando diferentes proporciones de etanol para evaluar las condiciones de extracción óptimas para aplicaciones industriales. El extracto acuoso de EtOH al 50 % (v/v) de pétalo de R. gallica suprimió significativamente la actividad de la tirosinasa, la producción de melanina y la metaloproteinasa de matriz inducida por los rayos UV solares-1, un sello distintivo de la formación de arrugas. Además, el extracto acuoso de EtOH al 50 por ciento (v/v) mostró el efecto antioxidante más alto y tuvo los contenidos de flavonoides más altos, de acuerdo con los efectos antienvejecimiento informados. En general, nuestros hallazgos sugieren que los extractos de pétalos de R. gallica exhiben efectos antienvejecimiento. Además, la extracción de EtOH al 50 por ciento, en particular, fue óptima para los efectos antienvejecimiento y antioxidantes más altos, así como para obtener el contenido más alto de flavonoides.

Según estudios relevantes, la cistanche es una hierba común conocida como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente es el cistanosido, que tiene diversos efectos como antioxidante, antiinflamatorio y promotor de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche y el blanqueamiento de la piel radica en el efecto antioxidante de los glucósidos de cistanche. La melanina en la piel humana se produce por la oxidación de la tirosina catalizada por la tirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, inhibiendo así la producción de melanina.

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Palabras claveRosa gallica Envejecimiento de la piel Flavonoide Efecto antioxidante

Introducción

La piel juega un papel vital como barrera protectora contra los factores nocivos asociados con la herencia y la genética, los problemas ambientales, los cambios hormonales y los procesos metabólicos (Mukherjee et al., 2006). Entre estos, los factores ambientales, como la exposición a la radiación solar ultravioleta (UV), actúan como mediadores clave que contribuyen al envejecimiento prematuro (Laga y Murphy, 2009). Los principales síntomas del envejecimiento de la piel, que ocurre como resultado del fotoenvejecimiento, incluyen arrugas profundas, pigmentación anormal y elasticidad (Farage et al., 2013; Wlaschek et al., 2001).

La pigmentación es un síntoma del envejecimiento, causado por la producción anormal de melanina, lo que da como resultado una variedad de trastornos de la piel que incluyen pecas, melasma, manchas de la edad y otros síndromes de hiperpigmentación (D'Mello et al., 2016; Seo et al., 2003). En la vía de la melanogénesis, la tirosinasa es importante como enzima limitante de la velocidad que convierte la L-tirosina en L-DOPA y oxida la L-DOPA para formar DOPA-quinona (Akhtar et al., 2015). Por lo tanto, la inhibición de la tirosinasa está fuertemente asociada con la síntesis de melanina. Además, la formación de arrugas, provocada por la pérdida de fibrillas de colágeno y elastasa, es otra característica del fotoenvejecimiento. La metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1), secretada por los fibroblastos de la piel humana, es la principal responsable de la degradación del colágeno durante el proceso de fotoenvejecimiento (Pandel et al., 2013). La regulación a la baja de la expresión de MMP-1, que inhibe la degradación del colágeno, puede mejorar las funciones de mejora de las arrugas.

Por las razones expuestas anteriormente, el uso de inhibidores de tirosinasa o inhibidores de MMP se considera una estrategia prometedora para paliar el fotoenvejecimiento cutáneo. Estudios previos han indicado que el retinol, el extracto de ajo (ácido de cafeína y cisteína S-ally) y la fitoceramida, el ácido kójico, la arbutina y la vitamina C pueden actuar como inhibidores del envejecimiento de la piel (Couteau y Coiffard, 2016; Kim et al., 2013) . Sin embargo, el uso de estas sustancias implica ciertas limitaciones, como varios efectos secundarios que incluyen citotoxicidad, olor y coloración (Yamakoshi et al., 2003). Por lo tanto, los estudios actuales se centran en el desarrollo de componentes de origen natural más seguros que confieran una fotoprotección eficaz de la piel.

Las especies de Rosa, cultivadas en todo el mundo, se consideran una buena fuente de suplementos dietéticos. Se ha informado que el extracto de pétalos de rosa (RPE), que contiene elementos como ácido fenólico, flavonoles y antocianinas, exhibe muchos efectos beneficiosos, como actividades antiinflamatorias de la piel, además de otras funciones biológicas (Bitis et al., 2 017; Lee et al., 2018; Masek et al., 2017; Navarro-González et al., 2015). Debido a que se sabe que estas propiedades del RPE están relacionadas con el envejecimiento de la piel, se ha propuesto como un candidato potencial para la protección de la piel. Sin embargo, se sabe poco sobre el efecto del RPE en el envejecimiento de la piel. Además, el agua y el etanol se consideran los mejores solventes de extracción debido a las diferencias de polaridad y la seguridad de uso (Abarca-Vargas et al., 2016). Por lo tanto, se prepararon mediante extracción muestras con diferentes proporciones de agua y etanol (0, 10, 30, 50, 70, 90 y 100 por ciento de etanol RPE).

El propósito de este estudio fue investigar el efecto de RPE en el blanqueamiento de la piel y la mejora de las arrugas. Se probaron extractos de RPE con diferentes proporciones de solventes de extracción (0, 10, 30, 50, 70, 90 y 100 por ciento de solventes de etanol/agua) para determinar la proporción óptima de solventes para la extracción.

Materiales y métodos

Reactivo

Los pétalos de Rosa gallica se importaron de Turquía a través de GN Bio (Gyeonggi, Corea). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero bovino fetal (FBS), la penicilina-estreptomicina-neomicina y 0.5 por ciento de tripsina-EDTA se adquirieron de GIBCO Invitrogen (Auckland, NZ, EE. UU.). Los anticuerpos específicos contra tirosinasa y b-actina se adquirieron de Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, EE. UU.). El anticuerpo primario de MMP-1 se obtuvo de los sistemas de I+D. Todos los demás productos químicos, incluida la hormona estimulante de los melanocitos alfa (a-MSH), la tirosinasa de hongos y la L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) se adquirieron de Sigma-Aldrich Co., LLC (St. . Louis, MO, EE. UU.).

preparación de la muestra

Se mezclaron pétalos de rosa con 100 ml de 0, 10, 30, 50, 70, 90 y 100 por ciento (v/v) de EtOH (etanol absoluto). A continuación, los componentes solubles se extrajeron en agua a 80 grados utilizando un condensador de reflujo. El extracto se filtró a través de papel filtro número 2 (Whatman, Maidstone, Inglaterra), se concentró al vacío y posteriormente se disolvió en agua destilada y se liofilizó, para ser utilizado como muestras para la prueba de análisis funcional.

Cultivo de células

Las células de melanoma B16F10 se adquirieron del Korean Cell Line Bank (Seúl, Corea). Se obtuvieron células de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) del Dr. Jin Ho Chung (Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, Corea). Ambas células se cultivaron en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (v/v) y penicilina al 1 por ciento (v/v) en condiciones de 37 grados y CO2 al 5 por ciento.

Viabilidad celular

La viabilidad celular se midió mediante MTS [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenilo)-2-({{7 ensayo de }}sulfofenil)-2H-tetrazolio]. Las células se sembraron en 96-placas de pocillos y se cultivaron hasta que confluyeron. Luego, las células se privaron de DMEM sin suero durante la noche y se trataron con las muestras a las concentraciones indicadas durante 24 h. Después de la exposición a las muestras, se permitió que 20 l de solución de MTS reaccionaran con las células durante 1 hora. La absorbancia se midió utilizando un lector de microplacas (Sunrise-Basic Tecan, Tecan Austria GmbH Gro¨dig, Austria) a 570 nm.

Actividad de tirosinasa de hongo in vitro

El ensayo de tirosinasa in vitro se realizó de acuerdo con los métodos descritos previamente (Kim et al., 2015). En resumen, se agregaron 40 l de cada muestra al tampón de ensayo (20 l de fosfato de potasio 0,1 M), seguido de incubación durante 30 min con 20 l de tirosinasa de hongo (0,02 mg/mL). Luego, se agregaron 40 l de sustrato (L-DOPA) a cada mezcla. Se permitió que la reacción prosiguiera a temperatura ambiente durante 15 min antes de analizar la formación de dopacromo midiendo la absorbancia a 475 nm utilizando un lector de microplacas (Infinite 2000 PRO, Tecan, Suiza).

Evaluación de la producción de melanina

El ensayo de producción de melanina se realizó de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente (Friedmann y Gilchrest, 1987; Gordon et al., 1989). Se sembraron células B16F10 (8 9 103 células) en 6-placas de pocillos con 2 ml de medio de cultivo. Después de 24 h, las muestras se pretrataron con las células durante 1 h, después de lo cual se expuso a-MSH (100 nM) a las células. Las células se recolectaron después de 72 h y la producción de melanina se midió utilizando un lector de microplacas (Infinite 2000 PRO, Tecan, Suiza) a 495 nm.

mancha occidental

Las muestras de proteínas se obtuvieron de las células, utilizando 19 Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). La concentración de proteínas se estimó utilizando un kit de ensayo de proteínas PierceTM BCA (Thermo Fisher Scientific, San Jose´, CA, EE. UU.). Las muestras de proteínas se cargaron en un gel de poliacrilamida con SDS al 10 % (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, EE. UU.) para electroforesis y luego se transfirieron a una membrana Immobilon P (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). La membrana de PVDF se bloqueó con leche descremada al 5 por ciento durante 1 hora y la membrana se trató con anticuerpo primario específico durante la noche a 4 grados. Las bandas de proteínas se detectaron utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia (GE Healthcare, NJ, EE. UU.) después de la hibridación con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (señalización celular).

Ensayo de captación de radicales DPPH

La actividad eliminadora de radicales DPPH se midió como sigue; Se añadieron {{0}}, 2 mL de cada extracto a 3 mL de -etanol, a los que se añadieron 0,8 mL de DPPH 400 lM disueltos en etanol. Esta mezcla se agitó durante 10 sy se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 min y se midió la absorbancia a 517 nm (Wang et al., 1999). La actividad eliminadora de radicales DPPH se expresó como un porcentaje de la absorbancia del grupo al que no se añadió DPPH. Todos los experimentos se replicaron un mínimo de 3 veces.

Contenido total de flavonoides

El contenido total de flavonoides en los extractos se midió usando el método del cloruro de aluminio (Jia et al., 1999) que se modificó usando catequina. A 100 lL del extracto se le añadieron 500 lL de agua destilada y 30 lL de NaNO2, seguido de lo cual se añadieron 60 lL de AlCl3 6 min después. Después de 5 min, se añadieron 200 l de NaOH 1 M y se llevó hasta 1 ml con agua destilada. La solución se mezcló bien y se centrifugó a 15.928 g, a 4 grados, durante 5 min. Después de la centrifugación, se obtuvieron 200 l del sobrenadante y se midió la absorbancia utilizando un lector de microplacas (Infinite 2000 PRO; Tecan, Suiza) a 510 nm.

análisis estadístico

Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Se usaron pruebas t de Student para comparaciones estadísticas individuales. La significancia estadística se estableció en (#) {{0}} p\ 0.05 y (##)=p\ 0.001 para comparación con el control no tratado; (*)=p\ 0,05 y (**)=p \0,001 para comparación con el grupo tratado con a-MSH.

Resultados y discusión

Extracción de los pétalos de Rosa gallica según diferentes proporciones de solventes

Anteriormente, el RPE se producía mediante extracción acuosa de EtOH al 70 % (v/v) (Lee et al., 2018). Sin embargo, si el RPE está destinado a fines de aplicación industrial, las condiciones de extracción deben ser óptimas. Con el fin de investigar las condiciones óptimas de extracción de RPE para la actividad antienvejecimiento de la piel, se usaron varios disolventes para RPE (Fig. 1A). Curiosamente, el color de cada extracto varió, según la observación visual (Fig. 1B). El color de los extractos de EtOH, al 90 por ciento o más, era claro, mientras que el extracto de EtOH al 50 por ciento (v/v) parecía ser el más rojizo. El resultado del colorímetro reveló un valor a* de enrojecimiento para EtOH al 50 por ciento, que mostró el nivel más alto entre los extractos (Fig. 1C).

Efecto de los extractos de pétalo de rosa sobre la actividad blanqueadora de la piel

Dado que la tirosinasa es una enzima clave involucrada en la hiperpigmentación a través de la producción de melanina (Chang, 2009), analizamos el efecto inhibitorio de los extractos sobre la actividad de la tirosinasa in vitro. La mayoría de los extractos, excepto el 100 por ciento de EtOH, revelaron una regresión dependiente de la dosis en la actividad de tirosinasa in vitro (Fig. 2A). Además, los extractos de EtOH al 30 por ciento y al 50 por ciento mostraron efectos inhibidores más fuertes que el ácido ascórbico. El ácido ascórbico se describió como agente blanqueador de la piel en la literatura anterior (Chang, 2009). Para evaluar la actividad blanqueadora de la piel de los extractos en un modelo celular, se evaluó la producción de melanina en células de melanoma B16F10 después del tratamiento con cada extracto. Una porción de 100 nM de a-MSH aumentó la producción de melanina y cada extracto de pétalo de rosa inhibió la producción de melanina (Fig. 2B). Además, los extractos de EtOH al 30 por ciento y al 50 por ciento mostraron el efecto inhibidor más fuerte sobre la actividad de tirosinasa y la producción de melanina in vitro, respectivamente. En condiciones similares, se examinó el efecto de cada uno de los extractos sobre la expresión de tirosinasa. Además, la a-MSH aumentó la expresión de tirosinasa y 100 μg/mL de cada uno de los extractos atenuó la expresión de tirosinasa (Fig. 2C). El tratamiento con extractos a 100 µg/mL no provocó citotoxicidad celular en células de melanoma B16F10 (Fig. 2D). Así, la inhibición de la melanina por parte del RPE se atribuye a la doble función de actividad tirosinasa y expresión de ausencia de citotoxicidad.

Efecto del RPE sobre la expresión de MMP-1 inducida por UV solar (sUV) en fibroblastos dérmicos humanos

Los inhibidores de MMP-1 pueden considerarse agentes antiarrugas (Park et al., 2018; Yang et al., 2018). Esto se debe a que MMP-1 es una enzima clave, responsable de la formación de arrugas durante el proceso de envejecimiento de la piel (Pittayapruek et al., 2016). Para determinar los efectos antiarrugas del RPE, se evaluó la expresión de MMP-1 en fibroblastos dérmicos humanos mediante análisis de transferencia Western. La expresión de MMP-1 aumentó drásticamente por la irradiación con sUV (30 kJ/cm2), y todos los extractos inhibieron la expresión de MMP-1 inducida por sUV (Fig. 3A). Mientras que los extractos de EtOH al 100 % exhibieron un efecto leve, los extractos de EtOH al 50 % mostraron la actividad supresora más fuerte en la expresión de MMP-1 inducida por sUV. A continuación, investigamos los niveles de producción de MMP-1 en medios de cultivo, porque MMP-1 es una proteína secretada para la degradación del colágeno. Similar a lo que se muestra en la Fig. 3A, cada extracto suprimió el nivel de MMP-1 en los medios de cultivo (Fig. 3B). En particular, el extracto de EtOH al 50 % mostró la actividad supresora más alta en la expresión de MMP-1 inducida por sUV, y el extracto de EtOH al 100 % mostró un efecto leve en comparación con otros extractos.

Actividad antioxidante y contenido total de flavonoides de los extractos de pétalos de rosa

Se sabe que los antioxidantes que inhiben la producción de ROS reducen la hiperpigmentación o previenen la producción de melanina inducida por los rayos UV (Yamakoshi et al., 2003). Se determinó la actividad de captación de radicales DPPH para comparar la actividad antioxidante de los extractos. Curiosamente, cada extracto mostró una actividad de eliminación de radicales drástica, dependiente de la dosis. Las muestras de 500 lg/mL mostraron una actividad antioxidante similar a la de la vitamina C. Entre los extractos, el extracto de EtOH al 50 % mostró el efecto antioxidante más fuerte a la concentración más baja (50 lg/mL) (Fig. 4A).

Hay muchos compuestos diferentes como terpenos, flavonoides y antocianinas en los pétalos de rosa (Knapp et al., 1998; Kumar et al., 2008; Oka et al., 1998; Schieber et al., 2005). Estos químicos representan muchas actividades biológicas (Kumar et al., 2009). En particular, los flavonoides han sido descritos como el principal grupo de compuestos fenólicos responsables de las propiedades biológicas de los efectos antioxidantes y antiinflamatorios (Du et al., 2016; Jung et al., 2015). A continuación, se midió el contenido total de flavonoides de cada extracto. Grandes cantidades de flavonoides estaban presentes en cada extracto (Fig. 4B). Los resultados indicaron que el extracto de EtOH al 50 por ciento contenía el mayor contenido de flavonoides entre las muestras. Esta tendencia fue similar a la observada en el resultado del ensayo antioxidante.

Se supone que el color rojo oscuro del solvente EtOH al 50 por ciento de los pétalos de rosa está relacionado con la antocianina, un flavonoide (Fig. 1). Este resultado corrobora los hallazgos de un estudio anterior (Oancea et al., 2012). Según el estudio anterior, las antocianinas de los arándanos (Vaccinium orymbosum L.) se extrajeron mejor en un solvente de EtOH al 50 % que en cualquier otro solvente, incluido el 60 %, el 70 % y el 80 % de EtOH (Oancea et al., 2012). Naturalmente, las antocianinas se presentan como glucósidos. Por lo tanto, supusimos que la polaridad de las antocianinas puede haber sido otorgada por el solvente EtOH al 50 por ciento. La fuerte actividad antioxidante de las antocianinas está bien demostrada en varios sistemas modelo (Kalt et al., 2003; RiceEvans et al., 1995). Debido a que el extracto de pétalos de rosa con 50 % de EtOH tenía el mayor contenido de antocianina, la actividad antioxidante del extracto con 50 % de EtOH fue la más fuerte entre los extractos de 50 lg/mL.

En resumen, nuestro estudio demostró el potencial del RPE como ingrediente antienvejecimiento de la piel. Para fines de aplicación industrial, la optimización de las condiciones de extracción es esencial para reducir los costos de producción. El estudio actual investigó los solventes más adecuados para la extracción de pétalos de rosa, con referencia a la actividad antienvejecimiento de la piel. Los flavonoides de los pétalos de rosa se extrajeron mejor con el solvente EtOH al 50 por ciento. Este extracto mostró la actividad antioxidante más fuerte, así como la actividad antienvejecimiento de la piel, como el blanqueamiento de la piel y la supresión de arrugas. Es posible que se requieran estudios clínicos y análisis de estabilidad para probar su idoneidad para aplicaciones industriales.

AgradecimientosEsta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Principal (E0183112-02) del Instituto de Investigación de Alimentos de Corea (KFRI) financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura y por el Instituto de Planificación y Evaluación de Tecnología en Alimentos, Agricultura de Corea , Silvicultura y Pesca (IPET) a través del Programa de Desarrollo de Tecnologías Alimentarias de Alto Valor Agregado, financiado por el Ministerio de Agricultura, Alimentación y Asuntos Rurales (MAFRA) (118060-03-2- HD020).

Cumplimiento de normas éticas

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