Abstracto

Para lograr una utilización de alto valor de los polisacáridos deCistanche deserticolaresiduos, este estudio utilizó los residuos que quedan después de la extracción de glucósidos de feniletanoides (un proceso industrial basado en la tecnología patentada de separación por membrana,Patente No. ZL200710102756.7, held by Hotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd., https://www.xjcistanche.com/about-us) as the raw material. We systematically investigated the differences in chemical structural characteristics and antioxidant activities among various polysaccharide fractions obtained through membrane separation. The results indicated significant variations in chemical composition and activity among polysaccharide fractions with different molecular weights. Utilising ultrafiltration membranes of varying molecular weight cutoffs (300 kDa, 50 kDa, 10 kDa) combined with alcohol precipitation, four distinct polysaccharide fractions were successfully prepared: >300 kDa (llamado CTP 1), 50–300 kDa (CTP 2), 10–50 kDa (CTP 3) y<10 kDa (CTP 4). Monosaccharide composition analysis indicated that all four fractions primarily contained mannose, rhamnose, galacturonic acid, glucose, galactose, and arabinose, but their proportional ratios differed. Fourier-transform infrared spectroscopy confirmed that all fractions exhibited typical characteristic polysaccharide absorption peaks. Scanning electron microscopy results demonstrated that ultrafiltration membranes with different pore sizes significantly altered the aggregation state and surface roughness of the polysaccharides by retaining components of varying molecular weights. This morphological difference may be related to intermolecular interactions and the sieving effect during ultrafiltration. In antioxidant activity assays, CTP 1 showed the optimal performance, achieving DPPH radical scavenging rates exceeding 61% and ABTS⁺ radical scavenging rates surpassing 95% at 8 mg/mL. All four fractions demonstrated appreciable antioxidant activity. This study confirms that membrane separation technology can effectively fractionate polysaccharides from Cistanche deserticolaresiduo. La investigación proporciona una base teórica y datos que respaldan el reciclaje de recursos de residuos de medicinas a base de hierbas y el desarrollo de alto valor de componentes de polisacáridos.

Palabras clave: Cistanche deserticola; polisacáridos; actividad antioxidante; tecnología de separación por membranas; análisis estructural

 

Patente de tecnología de separación de membranas retenida por la sede de Wecistanche

 

 

 

 

 

 

Introducción

Cistanches Herba(Cistanche), el tallo carnoso seco con hojas escamosas deCistanche deserticolaYC Ma (cistanche del desierto) ocistanche tubulosa(Schenk) Wight (CTP), se registra por primera vez enShennong Bencao Jing (El clásico de Materia Médica de Shennong). Como representante típico de las medicinas tónicas tradicionales chinas en China y sustancia homóloga de los medicamentos alimentarios, se produce principalmente en el desierto del noroeste y en zonas desérticas como Xinjiang y Mongolia Interior, lo que le valió la reputación de "ginseng del desierto". Tiene los efectos de tonificar el yang del riñón, nutrir el yin del riñón, beneficiar la esencia y la sangre y humedecer los intestinos para aliviar el estreñimiento [2-3]. Los glucósidos feniletanoides que contiene tienen importantes actividades biológicas y son las principales sustancias extraídas en la producción industrial actual. Sin embargo, una gran cantidad de sustancias utilizables permanecen en los residuos después de la extracción, que se desechan como desechos, lo que no sólo provoca un desperdicio de recursos sino que también impone una carga potencial para el medio ambiente. Por lo tanto, lograr un reciclaje de alto valor de los residuos es de gran importancia para el desarrollo eficiente de los recursos medicinales chinos y el desarrollo respetuoso con el medio ambiente.

Polisacáridos, como principales componentes activos encistanche, exhiben diversas actividades farmacológicas, como efectos antioxidantes, antienvejecimiento, hepatoprotectores, antiinflamatorios, inmunomoduladores y antitumorales [4-7], y pueden usarse ampliamente en el desarrollo de fármacos, así como en alimentos y productos sanitarios. Estudios anteriores han optimizado ampliamente el proceso de extracción y realizado evaluaciones preliminares de la actividad decistanchepolisacáridos, pero la investigación sistemática sobre los polisacáridos en el residuo después de la extracción de glicósidos feniletanoides sigue siendo escasa, particularmente falta un análisis en profundidad de las tecnologías eficientes de separación y fraccionamiento para los polisacáridos residuales y las diferencias de actividad entre diferentes fracciones, lo que restringe en gran medida la mejora del valor de utilización integral decistancherecursos.

En el campo de la investigación de polisacáridos, los polisacáridos crudos no clasificados tienen problemas tales como componentes mezclados, contribuciones de actividad poco claras y objetivos ambiguos, lo que dificulta revelar con precisión la base material de sus funciones antioxidantes, inmunomoduladoras y otras. Mientras tanto, las impurezas como proteínas, pigmentos y sales inorgánicas en los polisacáridos crudos también interfieren con la evaluación de su actividad y el desarrollo de aplicaciones. Los métodos tradicionales, como la cromatografía en columna, tienen alta resolución pero son difíciles de ampliar, mientras que el fraccionamiento por precipitación de alcohol es complicado y presenta riesgos ambientales. La tecnología de separación por membranas, con sus ventajas de alta eficiencia, respeto al medio ambiente y fraccionamiento preciso, muestra un gran potencial en la separación y purificación de polisacáridos. Permite el fraccionamiento preciso de componentes de polisacáridos a través de membranas con diferentes límites de peso molecular, proporcionando un soporte técnico ideal para revelar la relación estructura-actividad "peso molecular-actividad" de los polisacáridos [8]. Tang y cols. [9] purificó con éxito tres componentes de polisacáridos directamente deLentinus edodosextractos acuosos utilizando una combinación de membranas de ultrafiltración de 2,5 kDa, 5 kDa y 10 kDa. En particular, la tecnología de separación de membranas empleada en este estudio está protegida por una patente de invención (Patente No. ZL200710102756.7) propiedad de Hotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. (https://www.xjcistanche.com/about-us), que se centra en la producción de materias primas que contienen glucósidos feniletanoides a partir decistancheutilizando separación por membrana, proporcionando una base industrial sólida para nuestra investigación. Los productos desarrollados por nuestro grupo de investigación basados ​​en estudios sistemáticos de glucósidos feniletanoides procedentes decistanche tubulosa[10] han entrado en la etapa de producción piloto. Con base en esto, este estudio utiliza el residuo decistanchedespués de la extracción de glucósidos de feniletanoides como materia prima, emplea membranas de ultrafiltración combinadas con precipitación con alcohol para fraccionar y purificar los polisacáridos en el residuo, y analiza sistemáticamente las diferencias en las características estructurales químicas y las actividades antioxidantes de las fracciones de polisacáridos con diferentes pesos moleculares. El objetivo es abrir nuevas vías para el reciclaje de recursos decistancheresiduos, mejorar la cadena industrial y sentar las bases teóricas y experimentales para el desarrollo de nuevos alimentos funcionales o antioxidantes basados ​​en polisacáridos naturales.

 

Suplementos de extracto de cistanche de acteoside al 50% de echinacósido al 10% extraídos mediante tecnología de separación de membranas

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1 Materiales y métodos

1.1 Materiales e Instrumentos

Cistanche deserticolaEl residuo fue proporcionado porHotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. (Hotan, China), generado a partir de la extracción industrial de glucósidos de feniletanoides mediante la tecnología patentada de separación por membrana (Patente No. ZL200710102756.7; https://www.xjcistanche.com/about-us). El estándar de glucosa se compró en el Instituto de Investigación de Química Fina Tianjin Guangfu. m-hidroxibifenilo (98%), azul brillante de Coomassie G-250, bolsas de diálisis (MD44), kit de ensayo de capacidad de eliminación de radicales DPPH, kit de ensayo de capacidad de eliminación de radicales ABTS, kit de ensayo de capacidad de eliminación de aniones superóxido y kit de ensayo de capacidad antioxidante total se adquirieron de Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. El ácido galacturónico (98%), la albúmina sérica bovina (98%) y el ácido ascórbico (Vc) se adquirieron en Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. Otros reactivos químicos eran de calidad analítica.

UV-19001 espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu Instruments Co., Ltd.); balanza electrónica YP10002 (Shanghai Hengji Scientific Instruments Co., Ltd.); balanza electrónica SQP (Sartorius Scientific Instruments Co., Ltd.); baño maría EYELA (SB-1200); CA-1111 dispositivo de circulación de agua de refrigeración (Shanghai Ailang Instruments Co., Ltd.); Bomba de vacío de agua circulante SHZ-D (Shanghai Jinfu Experimental Instrument Equipment Co., Ltd.); N-1100 evaporador rotatorio; XCLD-10FE liofilizador (Shanghai Xingchuang Scientific Instrument Equipment Co., Ltd.); Máquina experimental de separación de membranas orgánicas BONA-GM-18C; membranas de ultrafiltración de 300 kDa, 50 kDa, 10 kDa (polietersulfona, Jinan Bona Co., Ltd., Shandong); TGL-16A centrífuga (Changsha Pingfan Instruments); Balanza analítica BT25S (Sartorius Scientific Instruments); cromatógrafo líquido de alto rendimiento Dionex U3000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.); soplador de nitrógeno LC-DCY-12GK (Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.); sistema de agua ultrapura UPH-I-10T (Chengdu Ultra Pure Technology Co., Ltd.); DF-101S espectrómetro de infrarrojos (Shimadzu Instruments Co., Ltd.); Microscopio electrónico de barrido Zeiss Supra55VP (Carl Zeiss (Shanghai) Management Co., Ltd.).

 

Especificaciones del cistanche

1.2 Métodos experimentales

1.2.1 Extracción de CrudocistanchePolisacáridos

Según el proceso de extracción obtenido de pruebas previas preliminares, 150 g deCistanche deserticolaEl residuo se pesó, se extrajo a 100 grados durante 3 h con una relación sólido-líquido de 1:20 g/ml, se centrifugó a 4000 r/min durante 10 min y se recogió el sobrenadante (contenido de polisacárido: 4,4 mg/ml) para obtener el extracto de polisacárido.

1.2.2 Fraccionamiento y Separación decistanchePolisacáridos

El extracto acuoso decistancheLos polisacáridos se sometieron a fraccionamiento por ultrafiltración utilizando membranas de ultrafiltración de 300 kDa, 50 kDa y 10 kDa en condiciones de 0,18 MPa de presión y 40 grados de temperatura. Los retenidos y permeados se recogieron por separado, se concentraron mediante evaporación rotatoria y se añadió etanol al 95% para lograr una concentración final de etanol del 80%. La mezcla se colocó a 4 grados durante 24 h, luego se centrifugó a 4000 rpm durante 10 min y se descartó el sobrenadante para obtener el precipitado. El precipitado se redisolvió en agua, se dializó frente a una bolsa de diálisis de 3500 Da durante 48 h y se liofilizó para obtenercistanche polysaccharides. Four fractions were obtained by collecting retentates and permeates: >300 kDa (llamado CTP 1), 50–300 kDa (CTP 2), 10–50 kDa (CTP 3) y<10 kDa (CTP 4).

1.2.3 Determinación de componentes químicos de polisacáridos

1.2.3.1 Determinación del Contenido Total de Azúcar

Se utilizó el método del ácido fenol-sulfúrico para determinar el contenido de polisacáridos en las muestras [11]. Se preparó una curva estándar usando glucosa, con una solución estándar de glucosa de 0,1 mg/ml. Se transfirieron volúmenes precisos de 0,4 ml, 0,8 ml, 1,2 ml, 1,6 ml y 2,0 ml de la solución estándar a tubos de ensayo con tapón de 10 ml y se añadió agua hasta un volumen total de 2,0 ml. Luego, se añadió 1,0 ml de solución de fenol al 6 % recién preparada, se mezcló bien y se añadieron rápidamente 5,0 ml de ácido sulfúrico concentrado a lo largo de la pared del tubo. La mezcla se agitó, se calentó en un baño de agua a 90 grados durante 15 minutos, luego se retiró y se enfrió hasta temperatura ambiente. Utilizando agua destilada como blanco, se midió la absorbancia a 490 nm con un espectrofotómetro UV-Vis. La curva estándar obtenida fue y=16.196x+0.0834, con R2=0.999. Se preparó una solución de polisacárido de 0,1 mg/mL y se midió la absorbancia de cada fracción de polisacárido utilizando el mismo método. El contenido total de azúcar de cada fracción se calculó sustituyendo en la curva estándar.

1.2.3.2 Determinación del contenido de proteínas

Se utilizó el método Coomassie Brilliant Blue para determinar el contenido de proteína en las muestras [12]. Se preparó una curva estándar utilizando albúmina sérica bovina, con una solución estándar de proteína de 0,1 mg/ml. La solución de proteína estándar se diluyó a concentraciones de 0,02, 0,03, 0,05, 0,07 y 0,09 mg/ml. Luego, se añadió 1 ml de cada concentración de la solución de proteína estándar a los tubos de ensayo, seguido de 5,0 ml de reactivo cromogénico Coomassie Brilliant Blue y se mezcló mediante agitación. Usando agua destilada como blanco, se midió la absorbancia a 595 nm después de 10 minutos de reacción. La curva estándar obtenida fue y=0.0034x+0.7673, con R2=0.996. La absorbancia de cada fracción de polisacárido se midió usando el mismo método y el contenido de proteína de cada fracción se calculó sustituyendo en la curva estándar.

1.2.3.3 Determinación del contenido de ácido urónico

Se utilizó el método del m-hidroxibifenilo para determinar el contenido de ácido urónico en las muestras [13]. Se preparó una curva estándar usando ácido galacturónico, con una solución estándar de ácido galacturónico de 0,1 mg/ml. La solución estándar se diluyó a concentraciones de 0,01, 0,02, 0,03, 0,05 y 0,1 mg/ml. Luego, se añadió 1 ml de cada concentración de la solución estándar a los tubos de ensayo y se agregaron 6 ml de solución de tetraborato de sodio-ácido sulfúrico en condiciones de baño de agua helada, se mezcló mediante agitación, se calentó en agua hirviendo durante 5 minutos, se enfrió a temperatura ambiente y se agregaron 0,1 ml de reactivo de m-hidroxibifenilo, se mezcló bien y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Utilizando agua destilada como blanco, se midió la absorbancia a 525 nm. La curva estándar obtenida fue y=7.5339x+0.0494, con R2=0.995. Se preparó una solución de polisacárido de 0,1 mg/mL y se midió la absorbancia de cada fracción de polisacárido utilizando el mismo método. El contenido de ácido urónico de cada fracción se calculó sustituyendo en la curva estándar.

 

Fabricante Wecistanche

1.2.4 Determinación de la composición de monosacáridos

Condiciones cromatográficas: Sistema de cromatografía líquida Thermo U3000, equipado con una columna Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). La fase móvil fue acetonitrilo: tampón fosfato (12 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, pH ajustado a 6,8 con 2 mol/l de NaOH) en una relación de volumen de 17:83, con elución isocrática. El caudal fue de 0,8 ml/min, la temperatura de la columna fue de 30 grados, la longitud de onda de detección fue de 250 nm y el volumen de inyección fue de 10 µl.

Preparación de solución estándar.: Se pesaron secuencialmente 5 mg de ramnosa, arabinosa, galactosa, glucosa, xilosa, manosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, clorhidrato de glucosamina y clorhidrato de galactosamina, y 10 mg de fucosa, se disolvieron y se completaron hasta 10 ml en un matraz volumétrico para preparar la solución madre estándar.

Preparación de la solución de muestra.: Se pesaron 5 mg de cada una de las cuatro fracciones de polisacárido, se agregaron a 1 ml de solución de TFA de 2 mol/l y se calentaron a 121 grados durante 2 h. Se purgó nitrógeno para secar la solución. Luego se añadieron 3 ml de metanol para lavar y la solución se secó nuevamente; Este paso de lavado con metanol se repitió 2 a 3 veces. El residuo se disolvió en 1 ml de agua estéril y se transfirió a un vial cromatográfico para su análisis. Luego, se agregaron 0,2 ml del hidrolizado de polisacárido a un tubo de centrífuga cónico con tapón, seguido de 0,2 ml de una solución de hidróxido de sodio de 0,5 mol/l y 0,5 ml de una solución de metanol de PMP de 0,5 mol/l. La mezcla se agitó y reaccionó en un baño de agua a 70 grados durante 1 h. Después de la reacción, se agregaron 0,2 ml de ácido clorhídrico de 0,5 mol/l para neutralizar el hidróxido de sodio, se añadió 1 ml de cloroformo y la mezcla se agitó para extracción tres veces para eliminar el exceso de PMP. Se descartó la capa de cloroformo, se tomaron 0,3 ml de la capa acuosa y se añadió agua para completar hasta 1 ml. Luego, se derivatizaron 0,2 ml de cada uno de los 11 estándares de monosacáridos utilizando el mismo método [14-15].

1.2.5 Análisis de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR)

Se colocó una cantidad adecuada de cada una de las cuatro fracciones de polisacáridos en la etapa de muestra del accesorio ATR del espectrómetro infrarrojo y se realizaron mediciones FT-IR utilizando un espectrofotómetro infrarrojo por transformada de Fourier en el rango de frecuencia de 4000 a 400 cm⁻¹ [16].

1.2.6 Análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM)

La morfología de las cuatro fracciones de polisacáridos se analizó mediante SEM [17]. Se fijó uniformemente una pequeña cantidad de cada fracción de polisacárido sobre una fina placa de cobre y se evaporó una capa de polvo de oro sobre la superficie de la muestra mediante pulverización iónica. La morfología de la superficie se observó a 5,00 kV.

1.2.7 Determinación de la actividad antioxidante in vitro

1.2.7.1 Determinación de la capacidad de eliminación de radicales del DPPH·

Las concentraciones de las cuatro fracciones de polisacáridos se establecieron en 1, 2, 3, 4 y 8 mg/ml, y el grupo de control positivo (Vc) también se estableció en las mismas concentraciones. La determinación se realizó según las instrucciones del kit de ensayo de capacidad de eliminación de radicales DPPH·.

1.2.7.2 Determinación de la capacidad de eliminación del anión superóxido

Las concentraciones de las cuatro fracciones de polisacáridos se establecieron en 0,5, 1, 2, 4 y 8 mg/ml, y el grupo de control positivo (Vc) también se estableció en las mismas concentraciones. La determinación se realizó según las instrucciones del kit de ensayo de capacidad de eliminación de aniones superóxido.

1.2.7.3 Determinación de la capacidad antioxidante total

Las concentraciones de las cuatro fracciones de polisacáridos se establecieron en 0,5, 1, 2, 4 y 8 mg/ml, y el grupo de control positivo (Vc) también se estableció en las mismas concentraciones. La determinación se realizó según las instrucciones del kit de ensayo de capacidad antioxidante total.

1.2.7.4 Determinación de la capacidad de eliminación de radicales ABTS⁺

Las concentraciones de las cuatro fracciones de polisacáridos se establecieron en 0,5, 1, 2, 4 y 8 mg/ml, y el grupo de control positivo (Vc) también se estableció en las mismas concentraciones. La determinación se realizó según las instrucciones del kit de ensayo de capacidad de eliminación de radicales ABTS.

1.3 Procesamiento de datos

Cada experimento se repitió tres veces en las mismas condiciones y los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. Se utilizó el software SPSS 21.0 para el análisis de significancia, con ANOVA unidireccional para el análisis unifactorial; P <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se utilizaron Origin 2024 y GraphPad Prism 10.1.2 para realizar gráficos.

 

Materias primas de alta calidad

Referencias

[1] Comisión Estatal de Farmacopea.Farmacopea de la República Popular China, Volumen I[METRO]. Beijing: China Pharmaceutical Technology Press, 2020.

[2] GUO Y, CAO L, ZHAO Q, et al. Caracterizaciones preliminares, actividad antioxidante y hepatoprotectora del polisacárido deCistanche deserticola [J]. Revista internacional de macromoléculas biológicas, 2016, 93: 678-685.

[3] ZHANG XY, JIANG QW, YANG SH, et al. El análisis quimiométrico y el enfoque farmacológico integrado para descifrar el efecto y el mecanismo entre crudo y procesado.cistanche tubulosa [J]. Revista de etnofarmacología, 2024, 328.

[4] CHENG N, WANG H, HAO H, et al. Avances de la investigación sobre los componentes polisacáridos deCistanche deserticolacomo posibles agentes farmacéuticos [J].Revista Europea de Química Medicinal, 2023, 245.

[5] TAO J, ZHONG X, LIN H, et al. El potencial, los desafíos y las perspectivas de los polisacáridos del género.cistanchecomo agentes terapéuticos para enfermedades relacionadas con el envejecimiento: una revisión [J].Revista internacional de macromoléculas biológicas, 2025, 312.

[6] ZHOU S, FENG D, ZHOU Y, et al. Análisis de los principios activos y aplicaciones en salud decistanche [J]. Fronteras en nutrición, 2023, 10.

[7] ZHANG X, LIU Z, LI Z, et al. Vías de ferroptosis: revelando el poder neuroprotector deCistanche deserticolaglucósidos feniletanoides [J].Revista de etnofarmacología, 2024, 333.

[8] CAI M, XING H, TIAN B, et al. Características y actividad antifatiga de polisacáridos graduados deGanoderma lucidumseparados por tecnología de membrana en cascada [J].Polímeros de carbohidratos, 2021, 269: 118329.

[9] TANG W, LIU C, LIU J, et al. Purificación de polisacárido deLentinus edodosextracto acuoso por separación de membranas y su composición química y caracterización de su estructura [J].Hidrocoloides alimentarios, 2020, 105.

[10] Ainur Memetiturxun, GAO L, HUO SX, et al. Optimización del proceso de extracción centrífuga de verbascósido utilizando la metodología de superficie de respuesta Box-Behnken [J].Revista china de farmacia aplicada moderna, 2022, 39(23): 3086-3091.

[11] JIN W, ZHOU H, ZHAO H, et al. Aislamiento, capacidad antioxidante in vitro, actividad hipoglucemiante y evaluación de inmunoactividad de polisacáridos decilantro sativumL [J/OL].Antioxidantes, 2025, 14(2): 149. https://doi.org/10.3390/antiox14020149

[12] SPLITTGERBER AG, SOHL J. No linealidad en ensayos de proteínas mediante el método de unión del tinte azul de Coomassie [J].Bioquímica analítica, 1989, 179(1): 198-201.

[13] CAI M, XING HY, XU J, et al. Separación graduada deGanoderma lucidumPolisacáridos crudos utilizando tecnología de membranas y comparación de sus actividades antioxidantes [J].Ciencia y tecnología de la industria alimentaria, 2021, 42(10): 29-35.

[14] GUO Y, WANG L, LIU K, et al. Un método UHPLC rápido y preciso para la determinación de monosacáridos en polisacáridos de diferentes fuentes deRadix astrágaloy su análisis de actividad inmune [J/OL].Moléculas, 2024, 29(10): 2287. https://doi.org/10.3390/molecules29102287

[15] DU C, LIU X, ALGADI H, et al. Optimización de la extracción de polisacáridos, composición de monosacáridos y análisis de la actividad antioxidante de diferentes variedades degastrodia elataLicenciado en Derecho. partes aéreas [J].Conversión de biomasa y biorrefinería, 2023, 14(23): 29353-29365.[16] HONG T, YIN JY, NIE SP, et al. Aplicaciones de la espectroscopia infrarroja en el análisis estructural de polisacáridos: avances, desafíos y perspectivas [J].Química de los alimentos: X, 2021, 12.[17] ZHOU S, HUANG G. Extracción, caracterización de la estructura y actividad biológica del polisacárido de la cáscara de coco [J].Tecnologías químicas y biológicas en la agricultura, 2023, 10(1).