Capacidad de respuesta funcional de las células T de memoria de pacientes con COVID-19

para más información:ali.ma@wecistanche.com

Ece Tavukcuoglua, Utku Horzum1 a, Ahmet Cagkan Inkaya1, Serhat Unal, bb Gunes Esendaglia, *

a Departamento de Oncología Básica, Instituto del Cáncer de la Universidad Hacettepe, Ankara, Turquía

b Departamento de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina, Universidad Hacettepe, Ankara, Turquía

Palabras clave: SARS-CoV-2 CentralmemoriaCélulas T, EfectormemoriaCélulas T, glicoproteína Spike S1 Célula dendrítica Células T auxiliares Linfocitos T citotóxicos

RESUMEN: La presencia dememoriaSe han reconocido las células T en pacientes con COVID-19, sin embargo, la potencia funcional dememoriarespuestas es fundamental para la protección. En este estudio, memoria ingenua, efectora, efectora y centralmemoriaLas células T CD4 plus y CD8 plus obtenidas de los sobrevivientes de COVID-19 se volvieron a exponer a DC derivadas de monocitos autólogas que se cargaron con la glicoproteína S1 del pico del SARS-CoV-2. Capacidad de proliferación, CD25, 4-1BB y PD-1

la expresión y la secreción de IFN-, IL-6, granzima, granulisina y FasL aumentaron en CD4 plus y CD8 plus efectormemoriay centralmemoriacélulas T Si bien se encuentra en niveles heterogéneos, lamemoriaLas células T de las personas con antecedentes de COVID-19 poseen capacidades funcionales para revitalizar la inmunidad antiviral contra el SARS-CoV-2.

Haga clic paraCistanche deserticola ma para mejorar la memoria

1. Introducción

A pesar de los datos emergentes sobre la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), la respuesta inmunitaria al síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) aún debe definirse mejor. La fuerza y ​​la duración de las respuestas humorales y celulares contra el SARS-CoV-2 se han asociado con anticuerpos neutralizantes ymemoriaCélulas T [1,2]. Especialmente, la glicoproteína-S1 del pico tiene una inmunodominancia significativa ya que los anticuerpos neutralizantes bloquean su unión a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y dificultan la entrada viral [3]. Además, aproximadamente el 50 por ciento de los pacientes mostraron respuestas de células T específicas de S1- [4,5].

Sin embargo, la heterogeneidad observada entre los casos de COVID-19 tiene un efecto de confusión. Si bien la mayoría de los pacientes desarrollan inmunidad antiviral, es posible que incluso los individuos convalecientes no estén protegidos de la reinfección, lo que se debe potencialmente a la magnitud y/o estabilidad insuficientes de la producción de células T y anticuerpos [6–8]. Curiosamente, en las infecciones graves por SARS-CoV-2, la interacción entre las células T (Th) auxiliares CD4 más y las células B se mitiga en el centro germinal, lo que potencialmente reduce la longevidad de las respuestas de anticuerpos [9]. Junto con las actividades Th, la solidez de las células T CD8 más citotóxicas también es fundamental para una inmunidad antiviral exitosa [10]. Previamente, la presencia de CD4 plus o CD8 plusmemoriaLas células T se informaron en COVID-19, sin embargo, las capacidades funcionales de estas células deben abordarse a fondo [11–13]. En este estudio, la capacidad de respuesta funcional de ingenuo, efector, centralmemoria, y las células T CD4 plus o CD8 plus de memoria efectora, que se obtuvieron de los pacientes con antecedentes de COVID-19, contra las células dendríticas derivadas de monocitos (DC) que portan el antígeno S1 del SARS-CoV-2.

2. Material y métodos

2.1. Pacientes y recogida de muestras.

En dos momentos diferentes, se recolectaron muestras de sangre periférica fresca de los pacientes recuperados de COVID-19 (Tabla 1) y las células mononucleares de sangre periférica se separaron mediante un gradiente de densidad de Ficoll de 1,077 g/mL (Sigma-Aldrich). Todos los protocolos fueron aprobados por los comités éticos locales y el Ministerio de Salud de la República de Turquía. se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes. Se incluyeron en el estudio pacientes con prueba de RT-PCR positiva y/o seropositividad. Los síntomas clínicos se clasificaron en leves (los pacientes no hospitalizados), moderados (los pacientes que tenían neumonía moderada) y graves (los pacientes que tenían neumonía grave y estaban hospitalizados por más de 5 días). Se usaron como controles muestras de sangre de donantes sanos [n=10 (6 mujeres, 4 hombres), mediana de edad 33 (mín. 28–máx. 55)] sin antecedentes de SARS-CoV-2 y seropositividad.

2.2. Establecimiento de cocultivos de células T y DC derivadas de monocitos

DC se generaron a partir de los monocitos (CD14 MACS, Miltenyi) de acuerdo con un protocolo publicado previamente [14]. Carga de antígeno con la proteína S1 recombinante (S1; 10 µg/mL, Abcam) o antígeno Gag del VIH (10 µg/mL, TUBITAK Marmara Research Center) [15] o el toxoide tetánico (TT; 10 µg/mL, Turk Ilac ) se inició simultáneamente con la maduración de DC derivadas de monocitos con LPS (1 µg/mL, Sigma-Aldrich). DC derivadas de monocitos maduros generadas en ausencia de un

se utilizaron antígenos específicos como controles. Al final de 7-un día de incubación, las CD derivadas de monocitos se caracterizaron como una población CD11bhiCD14loCD1a más CD83 más.

Del mismo paciente con COVID-19, T ingenuo autólogo (TN), T efector terminalmente diferenciado (TEMRA), centralmemoriaT (TCM), y efectormemoriaLas células T (TEM) se purificaron (mayor o igual al 96 por ciento) mediante FACS (FACSAria II; Becton Dickinson) como linfocitos CD3-sin tocar, CD19- y CD56- negativos según a la expresión diferencial de los marcadores CD45RA, CD45RO y CCR7 (fig. 1A).

Las DC derivadas de monocitos (5x104) se cocultivaron con los subtipos purificados de células T (10 )5 durante 96 h en una placa de pocillos 96-de fondo redondo que contenía 200 µL de medio RPMI 1640 completado con FBS al 10 %. , 1 por ciento de penicilina/estreptomicina (Biological Industries), 5 ng/mL IL-2 (Bio-

Leyenda). Antes del cocultivo, los subtipos de células T se marcaron con CFSE 5 µM (BioLegend). Como control positivo, se añadió un anticuerpo anti-CD3 (HIT3a, 25 ng/ml; BioLegend) a los cocultivos. La configuración experimental se resume en la Fig. 1A.

2.3. Ensayos de inmunofenotipificación y relacionados con la función mediante citometría de flujo

El inmunofenotipado se realizó con anticuerpos monoclonales anti-CD4 humano (OKT4), -CD8 (RPA-T8), -CD56 (MEM-188), -CD19 (SJ25C1), -CD45RA (HI100), -CD45RO (UCHL1) ), -CCR7 (G043H7), -CD25 (M-A251), -CD38 (HIT2), -4-1BB (4B4-1), -PD-1 (NAT105), -CD14 (M5E2), -CD11b (ICRF44) (BioLegend); -CD1a (REA736), -CD83 (REA714) (Miltenyi). Los valores de la intensidad de fluorescencia media (MFI) se determinaron en células T CD4 plus y CD8 plus, y de acuerdo con la dilución CFSE.

El cambio en el MFI se calculó comparando los datos de los cocultivos con las DC cargadas con antígeno y las DC de control.

Se evaluó la proliferación del porcentaje de células T con dilución CFSE. La capacidad de proliferación específica de antígeno de las células T se calculó como el cambio en la proliferación en el que los datos de los cocultivos con DC derivadas de monocitos de control se usaron como normalizadores. Los sobrenadantes recogidos se utilizaron en un ELISA multiplex (LEGEND-plex, BioLegend). Todos los análisis de citometría de flujo se realizaron en un clasificador FACSAria II.

2.4. análisis estadístico

Los resultados se presentan como mediana ± SEM. Para los análisis estadísticos se utilizaron la prueba de Kruskal-Wallis y la corrección de Bonferroni. valor AP<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Resultados

Después de la incubación con S{{0}}DC, se identificó un pequeño porcentaje de células T en proliferación (porcentaje de rango, CD4 plus, TN {{10}}.49–6.8, TEMRA 3.29–7.7, TCM 0.38–20.2, TEM 0.2– 16.7, porcentaje de rango, CD8 plus, TN 0.64–5.6, TEMRA 2.16– 10.3, TCM0.8– 15, TEM 1.6– 19.4). Tanto las células CD4 plus como CD8 plus TCM y TEM exhibieron una frecuencia de proliferación considerablemente mayor que las poblaciones de células T vírgenes o efectoras (Fig. 1B). Las células CD4 más TCM y las células CD8 más TEM mostraron la mayor actividad proliferativa. El CD4 másmemoriaLa proliferación de células T podría inducirse en ~90 por ciento de los pacientes con COVID-19, sin embargo, el CD8 plusmemoriaLa proliferación de células T solo se evidenció en ~60 por ciento de los pacientes (Fig. 1B). Las DC derivadas de monocitos también se cargaron con un antígeno viral irrelevante, HIV Gag; como era de esperar, no se obtuvo una respuesta significativa en las células T de los sobrevivientes de COVID-19 (Fig. 1C). De manera similar, las células T de los individuos sanos no respondieron a S1-DC. Por otro lado, las DC derivadas de monocitos que presentaban el antígeno TT sirvieron como control positivo para las células T.memoriarespuestas (Fig. 1C). Además, la expresión superficial de ciertos marcadores relacionados con la activación, especialmente CD25, PD-1 y 4-1BB, aumentó significativamente en las células T sensibles a S1- (Fig. 1D). Las células TEM estimuladas con S1-DC secretaron los niveles más altos de IFN- e IL-6, que es producido en gran medida por las células T tipo 1 CD4+ y las células T CD8+ citotóxicas. Los marcadores de respuesta citotóxica, granzima A, granulisina, ligando Fas (FasL) y especialmente granzima B también estaban elevados en los cocultivos que albergaban células TEM de pacientes con COVID-19 (Fig. 1E). Los sobrenadantes de cocultivo a partir de los cuales se midieron los factores solubles contenían los mediadores secretados por las células T y las DC; por lo tanto, como se establece en la literatura, las DC también pueden producir cantidades moderadas de citoquinas como TNF-, IL-6, IL-4 e IFN- [16,17]. En algunos casos, las células T sin memoria respondieron a S1-DC, aumentaron la expresión de CD38 y 4-1BB, y la secreción de IL-4 y TNF- (Fig. 1) . También se observó heterogeneidad entre los parámetros de células T estudiados y el tiempo de muestreo de sangre después de la recuperación, la gravedad de los síntomas clínicos o el nivel de anticuerpos anti-S1 (datos no mostrados).

4. Discusión

En los sobrevivientes de COVID-19, las células TEM y TCM específicas de S1- circulantes retuvieron la capacidad de respuesta funcional y mostraron capacidades efectoras aumentadas, como activación, proliferación y secreción de mediadores inmunitarios. Aunque la respuesta proliferativa en elmemoriaLas células T CD8 plus no fueron tan potentes como en las células CD4 plus.memoriaCélulas T, nuestros datos sugieren que estas células pueden avanzar rápidamente a un estado efector cuando se exponen al antígeno S1 del SARS-CoV-2. Las células TEM son guardianes críticos, ya que tienden a ubicarse en los tejidos propensos a la invasión del microorganismo patógeno, mientras que las células TCM se reclutan en los órganos linfoides secundarios para acelerar las reacciones inmunitarias iniciadas por las DC presentadoras de antígenos [18]. Aunque cubría un número limitado de casos de COVID-19, en nuestro estudio, la mayoría de los pacientes albergaban células TEM y TCM que respondían funcionalmente a la proteína S1 en términos de al menos un parámetro probado. Estos hallazgos preliminares pueden indicar una disparidad probable entre la competencia funcional de las células T y la gravedad de COVID-19. Un estudio anterior informó una mayor frecuencia de células T específicas de S1- que las células T específicas de las proteínas N y M [8]. En consecuencia, la capacidad de respuesta funcional de las células T a otros antígenos del SARS-CoV-2 aún debe dilucidarse mejor. Trabajo seminal recientemente publicado demostró la presencia de largo plazomemoriaen las células T de pacientes con COVID-19 [19,20]. Mediante el uso de un enfoque experimental distinto en el que las DC derivadas de monocitos autólogos se usaron como un elemento factible para probar la respuesta de las células T, nuestro estudio confirmó la función y el carácter de las células T mencionadas anteriormente en las personas con antecedentes de COVID-19. La acumulación de evidencia sobre la inmunidad establecida en los sobrevivientes de COVID-19 proporcionaría una mejor comprensión de la patogénesis de la enfermedad, los enfoques terapéuticos y el desarrollo de vacunas.

Fig. 1. Evaluación de respuestas funcionales en células T de sobrevivientes de COVID-19. A) Se muestra el esquema gráfico de la configuración experimental. Las células dendríticas derivadas de monocitos se generaron a partir de individuos con antecedentes de COVID-19 y se cargaron con SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-S1 (S1-DC); luego, autóloga ingenua T (TN), T efectora terminalmente diferenciada (TEMRA), centralmemoriaT (TCM), y efectormemoriaLas células T (TEM) se purificaron y cocultivaron con estas DC. La proliferación de células T, la expresión de marcadores de activación y la secreción de citocinas se midieron después de 96 h de incubación. B) Se representó gráficamente el cambio en la proliferación de células T CD4 plus y CD8 plus para cada paciente en comparación con el obtenido con cocultivos de control con CD derivadas de monocitos sin carga de antígeno específico. Los histogramas de citometría de flujo representativos se dan en el lado derecho. Los cocultivos estimulados con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 sirvieron como control positivo técnico para la proliferación de células T. C) La respuesta de proliferación de las células TEM y TCM derivadas del paciente contra el S{{1{{20}}}}DC se comparó con las obtenidas con el VIH Gag o con el antígeno del toxoide tetánico (TT). CC cargados. Las células T y las S1-DC obtenidas de individuos sanos (S1(hd)) también se usaron como controles. D) Se mostraron cambios en los niveles de marcadores de activación de células T CD4 plus y CD8 plus en comparación con los obtenidos con cocultivos de control con DC derivadas de monocitos sin carga de antígeno específico. E) Se evaluó la cantidad de citocinas asociadas a células T secretadas en los sobrenadantes del cocultivo. (*p < 0,05,="" **p=""><>

Declaración de contribución de autoría CRediT

Ece Tavukcuoglu: Investigación, Visualización, Análisis formal, Redacción - revisión y edición. Utku Horzum: Investigación, Visualización, Análisis formal, Redacción - revisión y edición. Ahmet Cagkan Inkaya: Conceptualización, Recursos. Serhat Unal: Conceptualización, Recursos. Gunes Esendagli: Conceptualización, Redacción - revisión y edición, Supervisión.

Declaración de interés en competencia

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia conocidos ni relaciones personales que pudieran haber parecido influir en el trabajo informado en este documento.

Referencias

[1] A. Mazzoni, L. Maggi, M. Capone, M. Spinicci, L. Salvati, MG Colao, A. Vanni, ST Kiros, J. Mencarini, L. Zammarchi, E. Mantengoli, L. Menicacci, E Caldini, S. Romagnani, F. Liotta, A. Morettini, GM Rossolini, A. Bartoloni, L. Cosmi, F. Annunziato, Las respuestas inmunes adaptativas humorales y mediadas por células al SARS-CoV-2 son más bajas en pacientes con COVID-19 asintomáticos que sintomáticos, Eur. J. Immunol. 50 (2020) 2013–2024.

[2] Y. Tan, F. Liu, X. Xu, Y. Ling, W. Huang, Z. Zhu, M. Guo, Y. Lin, Z. Fu, D. Liang,T. Zhang, J. Fan, M. Xu, H. Lu, S. Chen, Durabilidad de los anticuerpos neutralizantes y respuesta de células T después de la infección por SARS-CoV-2, Front. Medicina. 14 (2020) 746–751.

[3] C. Conte, F. Sogni, P. Affanni, L. Veronesi, A. Argentiero, S. Esposito, Vacunas contra coronavirus: estado del arte, Vacunas (Basilea) 8 (2020).

[4] CK Li, H. Wu, H. Yan, S. Ma, L. Wang, M. Zhang, X. Tang, NJ Temperton, RA Weiss, JM Brenchley, DC Douek, J. Mongkolsapaya, BH Tran, CL Lin, GR Screaton, JL Hou, AJ McMichael, XN Xu, respuestas de células T al coronavirus SARS completo en humanos, J. Immunol. 181 (2008) 5490–5500.

[5] M. Koblischke, MT Traugott, I. Medits, FS Spitzer, A. Zoufaly, L. Weseslindtner,C. Simonitsch, T. Seitz, W. Hoepler, E. Puchhammer-Stockl, SW Aberle, M. Fodinger, A. Bergthaler, M. Kundi, FX Heinz, K. Stiasny, JH Aberle, Dinámica de las respuestas de anticuerpos y células T CD4 en Pacientes con COVID-19 con diferente gravedad de la enfermedad, Frente. Medicina. (Lausana) 7 (2020), 592629.

[6] GA Polonia, IG Ovsyannikova, RB Kennedy, Inmunidad al SARS-CoV-2: revisión y aplicaciones a vacunas candidatas de fase 3, Lancet 396 (2020) 1595–1606.

[7] R. Zhou, KK To, YC Wong, L. Liu, B. Zhou, X. Li, H. Huang, Y. Mo, TY Luk, TT Lau, P. Yeung, WM Chan, AK Wu, KC Lung, OT Tsang, WS Leung, IF Hung, KY Yuen, Z. Chen, La infección aguda por SARS-CoV-2 afecta las respuestas de las células dendríticas y las células T, Immunity 53 (2020) 864–877 e{ {7}}.

[8] A. Grifoni, D. Weiskopf, SI Ramirez, J. Mateus, JM Dan, CR Moderbacher, SARawlings, A. Sutherland, L. Premkumar, RS Jadi, D. Marrama, AM de Silva, A. Frazier, AF Carlin, JA Greenbaum, B. Peters, F. Krammer, DM Smith, S. Crotty, A. Sette, Objetivos de las respuestas de células T al coronavirus SARS-CoV-2 en humanos con enfermedad de COVID-19 y Individuos no expuestos, Celular, 181 (2020) 1489-1501 e1415.

[9] PF Canete, CG Vinuesa, COVID-19 hace que las células B olviden, pero las células T recuerden, Cell 183 (2020) 13–15.

[10] I. Schulien, J. Kemming, V. Oberhardt, K. Wild, LM Seidel, S. Killmer, F. Sagar, MS Daul, A. Lago, H. Decker, B. Luxenburger, D. Binder, O Bettinger, S. Sogukpinar, M. Rieg, D. Panning, M. Huzly, G. Schwemmle, CF Kochs, A. Waller, D. Nieters, F. Duerschmied, HE Emmerich, AR Mei, S. Schulz, DA Llewellyn -Lacey, T. Price, B. Boettler, R. Bengsch, M. Thimme, C.-H. Hofmann, Caracterización de células T CD8( plus) específicas del SARS-CoV-2-preexistentes e inducidas, Nat. Medicina. 27 (2021) 78–85.

[11] I. Odak, J. Barros-Martins, B. Bosnjak, K. Stahl, S. David, O. Wiesner, M. Busch, M.

M. Hoeper, I. Pink, T. Welte, M. Cornberg, M. Stoll, L. Goudeva, R. Blasczyk, A. Ganser, I. Prinz, R. Forster, C. Koenecke, CR Schultze-Florey, Reaparición de células T efectoras está asociado con la recuperación de COVID-19, EBioMedicine 57 (2020), 102885.

[12] AE Oja, A. Saris, CA Ghandour, NAM Kragten, BM Hogema, EJ Nossent, LMA Heunks, S. Cuvalay, E. Slot, F. Linty, FH Swaneveld, H. Vrielink, G. Vidarsson, T. Rispens, E. van der Schoot, RAW van Lier, A. Ten Brinke, P. Hombrink, Divergent SARS-CoV-2-respuestas específicas de células T y B en pacientes con COVID grave pero no leve-19 , EUR. J. Immunol. 50 (2020) 1998–2012.

[13] B. Kratzer, D. Trapin, P. Ettel, U. Kormoczi, A. Rottal, F. Tuppy, M. Feichter,P. Gattinger, K. Borochova, Y. Dorofeeva, I. Tulaeva, M. Weber, K. Grabmeier-Pfistershammer, PA Tauber, M. Gerdov, B. Muhl, T. Perkmann, I. Fae, S. Wenda, H. Fuhrer , R. Henning, R. Valenta, WF Pickl, Impresión inmunológica de COVID-19 en poblaciones de leucocitos de sangre periférica humana, Alergia (2020).

[14] AM Bruger, C. Vanhaver, K. Bruderek, G. Amodio, E. Tavukcuoglu, G. Esendagli,S. Gregori, S. Brandau, P. van der Bruggen, Protocolo para evaluar la supresión de la proliferación de células T por MDSC humana, Methods Enzymol. 632 (2020) 155–192.

[15] SA Younes, B. Yassine-Diab, AR Dumont, MR Boulassel, Z. Grossman, JP Routy, RP Sekaly, la viremia del VIH-1 previene el establecimiento de la producción de interleucina 2- específica del VIH.memoriaCélulas T CD4 plus dotadas de capacidad proliferativa, J. Exp. Medicina. 198 (2003) 1909–1922.

[16] DM Frucht, T. Fukao, C. Bogdan, H. Schindler, JJ O'Shea, S. Koyasu, Producción de IFN-gamma por células presentadoras de antígenos: surgen mecanismos, Trends Immunol. 22 (2001) 556–560.

[17] EO Gubernatorova, EA Gorshkova, OA Namakanova, RV Zvartsev, J. Hidalgo, MS Drutskaya, AV Tumanov, SA Nedospasov, Funciones no redundantes de IL-6 producidas por macrófagos y células dendríticas en la inflamación alérgica de las vías respiratorias, Frente. inmunol. 9 (2018) 2718.

[18] YD Mahnke, TM Brodie, F. Sallusto, M. Roederer, E. Lugli, El quién es quién de la diferenciación de células T: humanomemoriasubconjuntos de células T, Eur. J. Immunol. 43 (2013) 2797–2809.

[19] JM Dan, J. Mateus, Y. Kato, KM Hastie, ED Yu, CE Faliti, A. Grifoni, SI Ramirez, S. Haupt, A. Frazier, C. Nakao, V. Rayaprolu, SA Rawlings, B Peters, F. Krammer, V. Simon, EO Saphire, DM Smith, D. Weiskopf, A. Sette, S. Crotty, Inmunológicomemoriaal SARS-CoV-2 evaluado hasta 8 meses después de la infección, Science 371 (2021).

[20] LB Rodda, J. Netland, L. Shehata, KB Pruner, PA Morawski, CD Thouvenel, KK Takehara, J. Eggenberger, EA Hemann, HR Waterman, ML Fahning, Y. Chen,M. Hale, J. Rathe, C. Stokes, S. Wrenn, B. Fiala, L. Carter, JA Hamerman, NP King, M. Gale, Jr., DJ Campbell, DJ Rawlings, M. Pepper, SARS-CoV funcional{ {2}}inmunidad específicamemoriapersiste después de COVID leve-19, Cell, 184 (2021) 169-183 e117.