El metabolismo del glutatión contribuye a la inducción de la inmunidad entrenada

Abstracto:

El sistema inmunitario innato muestra características de memoria heteróloga, que se caracterizan por respuestas más fuertes a un desafío secundario. Este fenómeno denominado inmunidad entrenada se basa en el recableado epigenético y metabólico de las células inmunitarias innatas. Como la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se ha asociado con el fenotipo de inmunidad entrenada, planteamos la hipótesis de que el aumento de los niveles de ROS y la principal molécula redox intracelular, el glutatión, juegan un papel en la inducción de la inmunidad entrenada. Aquí mostramos que la inhibición farmacológica de ROS en un modelo in vitro de inmunidad entrenada no influyó en la capacidad de respuesta celular; la modulación de los niveles de glutatión redujo la producción de citoquinas proinflamatorias en monocitos humanos. Se descubrió que los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en los genes implicados en el metabolismo del glutatión están asociados con cambios en la capacidad de producción de citoquinas proinflamatorias tras la inmunidad entrenada.

Además, las concentraciones de glutatión en plasma se asociaron positivamente con la producción ex vivo de IL-1, un biomarcador de inmunidad entrenada, producido por monocitos de individuos vacunados con BCG. En conclusión, el metabolismo del glutatión está involucrado en la inducción de la inmunidad entrenada, y se justifican estudios futuros para explorar sus consecuencias funcionales en enfermedades humanas.

La inmunidad humana es muy importante porque nos protege de enfermedades e infecciones. El sistema inmunitario es un sistema complejo compuesto por muchas células, tejidos y órganos diferentes. Trabajan juntos para hacer frente a varios patógenos dentro y fuera. En la investigación, encontramos que el polisacárido Cistanche deserticola y el verbascósido pueden mejorar la actividad de las enzimas del tejido cardíaco y cerebral y fortalecer la cavidad abdominal. La función fagocítica de las células y la respuesta de proliferación de los linfocitos tienen efectos evidentes en la mejora de la inmunidad.

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Palabras clave:

glutatión; inmunidad entrenada; macrófagos; metabolismo; memoria inmune innata.

1. Introducción

Hasta hace poco, se pensaba que la inmunidad adaptativa era el único componente de la defensa del huésped caracterizado por la capacidad de retener la memoria, adaptando las respuestas de las células T y B a un antígeno específico.

Sin embargo, un creciente cuerpo de investigación reciente también ha atribuido las características de la memoria heteróloga al sistema inmunitario innato, un proceso denominado inmunidad entrenada [1]. Los monocitos expuestos durante un período corto a Candida albicans, el componente de la pared celular fúngica -glucano, o incluso a estímulos estériles como la lipoproteína de baja densidad oxidada (ox-LDL), muestran una mayor producción de citocinas proinflamatorias tras una estimulación secundaria no relacionada mucho después de la se ha eliminado el estímulo inicial [2,3].

Además, los estudios epidemiológicos han demostrado que la vacuna contra la tuberculosis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) aumenta la función antimicrobiana de las células inmunitarias innatas, induciendo posteriormente una protección no específica contra infecciones no relacionadas y disminuyendo la mortalidad por todas las causas [4].

La inmunidad entrenada se basa en cambios epigenéticos que modulan la accesibilidad de los genes de la respuesta proinflamatoria para la maquinaria transcripcional de la célula. El recableado epigenético en células inmunitarias innatas entrenadas se acompaña de cambios metabólicos que promueven vías como la glucólisis, la fosforilación oxidativa y la biosíntesis de colesterol [5,6]. Los metabolitos derivados de estas vías son moléculas de señalización y cofactores que, a su vez, pueden modular la actividad de las enzimas modificadoras de la cromatina. El glutatión (GSH) es el principal antioxidante que preserva el equilibrio redox intracelular y se ha sugerido que contribuye a los cambios epigenéticos [7].

Además, los estímulos que inducen la inmunidad entrenada, como BCG y oxLDL, aumentan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) de los macrófagos tras la estimulación secundaria [8-10]. Presumimos que el aumento de la actividad metabólica de los macrófagos entrenados también aumentaría los niveles de ROS y modularía el GSH, lo que a su vez influiría en la fuerza de las respuestas inmunitarias entrenadas.

2. Materiales y métodos

2.1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) y monocitos

Se obtuvieron capas leucocitarias de donantes sanos después del consentimiento informado por escrito (Sanquin Blood Bank, Nijmegen, Países Bajos). Se obtuvo la aprobación ética de la CMO Arnhem-Nijmegen (NL32 357.091.10). El aislamiento se realizó mediante centrifugación de densidad diferencial sobre Ficoll-Paque (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido). Posteriormente, el aislamiento de los monocitos se realizó con una centrifugación en gradiente de densidad Percoll hiperosmótica (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) y se lavó una vez con solución salina tamponada con fosfato fría libre de pirógenos (PBS). Las células se resuspendieron y luego se cultivaron en medio RPMI 1640 holandés modificado (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) suplementado con gentamicina 5 µg/mL (Centraform, Etten-Leur, Países Bajos), Glutamax 2 mM (Gibco, Waltham, MA, EE. UU. ), y piruvato 1 mM (Gibco). Para garantizar la máxima pureza, los monocitos aislados con Percoll se dejaron adherirse a placas de fondo plano de poliestireno (Corning, Sigma-Aldrish, Nueva York, NY, EE. UU.) durante 1 hora a 37 ◦C, 5 % de CO2 y luego se lavaron una vez con PBS tibio.

2.2. Modelo de inmunidad entrenada in vitro

Los monocitos adherentes se cultivaron como se describió anteriormente [11]. Brevemente, se sembraron 105 monocitos en placas de pocillos 96-de fondo plano (Greiner, Kremsmünster, Austria) y se incubaron con 1 µg/mL de -glucano o 5 µg/mL de vacuna BCG (InterVax, Toronto, ON, Canadá) en RPMI con 10 por ciento de suero humano combinado. -1,3-(D)-glucano (-glucano) de Candida albicans fue proporcionado amablemente por el profesor David Williams (Facultad de Medicina, Johnson City, TN, EE. UU.).

Cuando se indicó, las células se preincubaron con {{0}},5 µM de difenilenoyodonio (DPI), 50 µM de a-tocoferol (AT) (Sigma-Aldrich), 0,5 µM de ácido ascórbico (AA), 1 mM de N-acetilo cisteína (NAC) (Sigma-Aldrich), o 100 μM DL-butionina sulfoximina (BSO) (Sigma-Aldrich) durante 1 h antes de la adición de -glucano. Después de 24 h, las células se lavaron una vez con PBS tibio y se dejaron diferenciar en RPMI suplementado con suero humano mezclado al 10 por ciento durante 5 días. El medio se refrescó el día 3 de cultivo. En el día 6, los macrófagos se reestimularon con 10 ng/ml de lipopolisacárido de Escherichia coli (LPS; serotipo 055:B5, Sigma-Aldrich) durante 24 horas más.

2.3. Cuantificación de especies reactivas de oxígeno (ROS)

Los monocitos/macrófagos se cultivaron durante 2 h, 24 h o 6 días, se lavaron, se separaron con PBS frío y se incubaron con H2DCFDA 5 µM (Life Technologies, Waltham, MA, EE. UU.) en PBS durante 30 min a 37 ◦C. Las células se analizaron por citometría de flujo (CytoFlex, Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.). El análisis de datos se realizó con el software Kaluza 2.1. Los agregados de células se separaron en función del gráfico de altura de dispersión frontal (FSC) frente a área de FSC y la población de monocitos/macrófagos se clasificó según FSC y dispersión lateral (SSC). Los datos se presentan como media ± SEM y se analizan con la prueba de Friedman seguida de las pruebas de comparaciones múltiples de Dunn. Un valor de p por debajo de 0.05 se consideró estadísticamente significativo, como lo indican los asteriscos (* p < 0.05).

2.4. Datos de secuenciación de ARN de monocitos humanos estimulados in vitro

El análisis de la expresión génica de monocitos expuestos in vitro a -glucano se realizó utilizando datos de RNA-seq publicados previamente [12]. Brevemente, las PBMC se aislaron mediante centrifugación en Ficoll-Paque (GE Healthcare). Los monocitos se purificaron mediante selección negativa con perlas para células positivas CD3 plus (células T), CD19 plus (células B) y CD56 plus (células NK) (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania). Las células se cultivaron siguiendo el modelo de inmunidad entrenada in vitro descrito y se expusieron a 5 µg/ml de glucano. Los monocitos se recogieron a las 4 hy 24 h después de la exposición. Los genes relacionados con la respuesta antioxidante y el metabolismo del glutatión se extrajeron de la lista de genes significativamente dinámicos (p < 0.05, FC > 2.5, RPKM > 1) en el modelo in vitro de inmunidad entrenada de monocitos a macrófagos. Los datos se presentan como el log10 de la proporción entre monocitos tratados con -glucano y monocitos no estimulados.

2.5. Cuantificación de glutatión

El análisis cuantitativo del glutatión intracelular reducido (GSH) y oxidado (GSSG) se realizó mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) como se describió previamente [13].

Brevemente, se eliminó el medio de crecimiento y las células cultivadas se lavaron con PBS tibio (37 ◦C) y se extinguieron con nitrógeno líquido para detener el metabolismo. Posteriormente, las células se rasparon de las placas y se extrajeron con una solución fría (−80 ◦C) de metanol/cloroformo/agua, 8,1:0,9:1 (vol/vol/vol) . Los extractos se mantuvieron congelados en hielo seco durante al menos 30 min y posteriormente se centrifugaron durante 20 min a 18,{{1{{30}}}}× g a −4 ◦C. El sedimento de proteína se mantuvo para la cuantificación de proteína mientras que los sobrenadantes que contenían los metabolitos intracelulares se secaron bajo una corriente suave de nitrógeno y las muestras de RMN se prepararon disolviendo el material seco con 0,22 ml de tampón de fosfato 0,15 M (pH 7,4) en agua deuterada que contenía 0,05 mM trimetilsilil propiónico-d4-sal sódica como estándar interno para referencia y cuantificación de RMN. Se recolectó un espectro de RMN 1H 1D para cada muestra en una RMN Bruker Avance II de 14,1 T (600 MHz para 1H), usando la secuencia de pulsos noesygppr1d (Topspin v3.0, Bruker Biospin Ltd, Karlsruhe, Alemania). Todos los espectros se procesaron e importaron en Chenomx NMR suite 8.4 (Chenomx NMR suite, v8.0, Edmonton, AB, Canadá) para la cuantificación de glutatión.

Todas las concentraciones se normalizaron a la masa proteica total de cada muestra. Este último se cuantificó disolviendo el sedimento de proteína en tampón (1:1, SDS al 1 %: urea 8 M (0, Tris 0,25 M pH: 8)) con sonicación. Luego se midió la concentración de proteína utilizando el kit de ensayo de proteína PierceTM BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) de acuerdo con su manual.

2.6. Modelos de inmunidad entrenada in vitro e in vivo para análisis genético y metabólico

En el modelo in vitro, los monocitos adherentes se incubaron con medio de cultivo solo como control negativo, 2 µg/ml de -1,3-(D)-glucano o 5 µg/ml de BCG (cohorte 300BCG). : cepa BCG-Bulgaria, Intervax, Canadá), durante 24 h a 37 ◦C en presencia de una mezcla de suero humano al 10 %. El día 6, las células se volvieron a estimular durante 24 h con 200 µl de RPMI o LPS 10 ng/ml (serotipo 055: B5; Sigma-Aldrich).

En el modelo in vivo, se vacunaron adultos sanos con una dosis estándar de 0,1 ml de BCG por vía intradérmica en la parte superior del brazo izquierdo, y se extrajo sangre antes, 14 y 90 días después de la vacunación. En cada visita, se estimularon 5 × 105 PBMC con Staphylococcus aureus muerto por calor (106 CFU/ml) o se dejaron sin estimular a 37 ◦C con un 5 % de CO2. Las citoquinas secretadas se midieron en ambos modelos después de 24 h de estimulación, y el aumento de veces en la capacidad de respuesta de las citoquinas inducida por los estímulos de entrenamiento se usó como una medida para la inmunidad entrenada [14].

2.7. Análisis genético

El análisis genético se realizó utilizando una cohorte de individuos sanos de ascendencia europea occidental del Human Functional Genomics Project [15]. La cohorte 300BCG consta de 325 adultos de los Países Bajos (44 % de hombres y 56 % de mujeres, con un rango de edad de 18 a 71 años). El estudio fue aprobado por el comité de ética local CMO región Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16. Las muestras de ADN de los individuos (n=325) se genotipificaron utilizando el chip SNP disponible comercialmente, Infinium Global Screening Array MD v1.0 de Illumina. Se utilizó 0.7.0 óptico con la configuración predeterminada para la llamada de genotipos [16]. Se excluyeron las muestras con una tasa de llamadas menor o igual a 0.99, así como las variantes con un equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) menor o igual a 0.0001 y una frecuencia de alelo menor (MAF) menor o igual a 0,001. Las cadenas de variantes se alinearon e identificaron con el panel de referencia 1000 Genome usando Genotype Harmonizer [17]. Luego imputamos las muestras en el servidor de imputación de Michigan usando el consorcio de referencia humano (HRC r1.1 2016) como panel de referencia, y filtramos las variantes genéticas con un R2 < 0.3 para la calidad de imputación y MAF < 5 por ciento [18], lo que resultó en aproximadamente 4 millones de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) para el mapeo de QTL de seguimiento. Se obtuvieron datos de genotipos y citoquinas en respuestas inmunitarias entrenadas in vitro para un total de 267 individuos de la cohorte 300 BCG. Se excluyeron tres muestras debido al uso de medicamentos (de las cuales una se identificó como un valor atípico genético), y una muestra se debió a la aparición de diabetes tipo 1 durante el estudio.

En primer lugar, se tomó el cambio de pliegue de la producción de citoquinas entre las células entrenadas y las no entrenadas como una medida de la magnitud de la respuesta inmunitaria entrenada. Después de verificar la calidad de la distribución de citoquinas y después de excluir los valores atípicos genéticos, mapeamos los cambios de pliegue transformados logarítmicamente de la producción de citoquinas a los datos del genotipo utilizando un modelo de regresión lineal con la edad y el sexo como covariables para corregir las distribuciones del cambio de pliegue de la producción de citoquinas. Utilizamos un punto de corte de p < 9,99 × 10−3 para identificar asociaciones sugestivas de loci de rasgos cuantitativos (QTL) que afectan las respuestas inmunitarias entrenadas. Usando el modelo de inmunidad entrenado in vivo, se obtuvieron datos de genotipos y citoquinas para un total de 296 individuos.

Además de los valores atípicos descritos para el mapeo de QTL in vitro, se excluyeron 18 individuos vacunados por la noche, lo que resultó en 278 muestras antes del mapeo de QTL. En primer lugar, los niveles de citocinas sin procesar se transformaron logarítmicamente y las proporciones de producción de citocinas entre las visitas se tomaron como el cambio de pliegue de la producción de citocinas. El cambio de pliegue de la producción de citoquinas se asignó a los datos del genotipo usando un modelo de regresión lineal con la edad y el sexo como covariables. Usamos un punto de corte de p < 9.99 × 10−3 para identificar asociaciones QTL sugerentes que afectan las respuestas de inmunidad entrenada. R-package Matrix-eQTL se utilizó para el mapeo de QTL de citoquinas [19].

2.8. Análisis metabolómico

Los niveles de metabolitos de individuos de la cohorte 300 BCG se midieron antes de la vacunación con BCG. Las características metabólicas fueron medidas y anotadas por General Metabolics (Zurich, Suiza) utilizando espectrometría de masas de tiempo de vuelo de inyección de flujo (TOF-M de inyección de flujo) [20]. Los metabolitos no dirigidos se anotaron de acuerdo con la base de datos de metabolitos humanos (HMDB). Todas las mediciones metabolómicas se realizaron por duplicado y se calculó el valor promedio para cada muestra por metabolito. Se realizó un análisis de correlación de Spearman sobre los metabolitos y los cambios de citoquinas ex vivo sobre las respuestas antes de la vacunación. Para probar la relación entre los niveles de glutatión y los SNP de interés identificados en el análisis genético, se realizó un análisis de regresión lineal con la edad y el sexo incluidos como covariables para cada SNP.

2.9. Cuantificación y análisis de citoquinas

La producción de citocinas se determinó utilizando kits ELISA comerciales para IL{{0}} , IL-6 y TNF (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos se presentan como media ± SEM y se analizan con ANOVA de medidas repetidas de dos vías seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Sidak. Un valor de p por debajo de 0.05 se consideró estadísticamente significativo, como se indica mediante asteriscos (* p < 0.05).

3. Resultados

3.1. -La inmunidad entrenada inducida por glucano y BCG desencadena una producción sostenida de especies reactivas de oxígeno

El aumento de la liberación de ROS se ha descrito previamente como una característica del fenotipo de inmunidad entrenada [21]. Los monocitos expuestos a -glucano o BCG durante 2 h y 24 h exhiben un aumento de ROS. Curiosamente, este aumento se mantuvo y estuvo presente después de 5 días de reposo en medios de cultivo (Figura 1A). Los niveles mejorados de ROS van acompañados de cambios transcripcionales de diferentes genes antioxidantes en monocitos expuestos a -glucano durante 24 h (Figura 1B). La superóxido dismutasa mitocondrial SOD2 y diferentes moléculas que contienen tiol están reguladas al alza, a saber, las reductasas de peróxido dependientes de tiorredoxina 1-6 (PRDX 1-6) y la sulfiredoxina 1 (SRXN1). También aumenta la expresión de tiorredoxina (TXN) y tiorredoxina reductasa (TXNRD), eliminadores de ROS que contienen tiol.

Figura 1. Los niveles aumentados de ROS de los monocitos entrenados no contribuyen a su producción mejorada de citocinas proinflamatorias. (A) Niveles de ROS a las 2 h, 24 h y 6 días después de la exposición de monocitos a -glucano y BCG (n=6/9 donantes, agrupados de 2/3 experimentos independientes. Prueba de Fridman Prueba de comparaciones múltiples de Dunn) . (B) Niveles de expresión de genes implicados en la defensa antioxidante en monocitos expuestos a -glucano durante 24 h en comparación con células no estimuladas. La expresión se presenta como log10(ratio). TNF e IL-6 producidos por macrófagos entrenados con -glucano después de un pretratamiento de 1 h con (C) 0.5 µM DPI (n=6 donantes, agrupados de 2 experimentos independientes) y (D ) NAC 1 mM, AT 50 µM o AA 0,5 µM (n=6 donantes, agrupados de dos experimentos independientes, ANOVA bidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). (media ± SEM, * p < 0,05).

Sin embargo, ni la inhibición del principal productor de ROS NADPH oxidasa con difenilenoyodonio (DPI) ni la adición de las moléculas antioxidantes -tocoferol (AT) y ácido ascórbico (AA) antes de la incubación con -glucano, modularon el aumento de la capacidad de respuesta de los macrófagos. En los macrófagos expuestos a la secreción de -glucano, TNF e IL-6 24 h después de la reestimulación con LPS, este enfoque farmacológico no modificó (Figura 1C, D).

Sin embargo, la exposición a DPI solo aumentó la producción de IL-6 tras la estimulación con LPS. (Figura 1C). El pretratamiento con N-acetilcisteína (NAC), eliminador general de ROS, provocó una disminución en la producción de TNF e IL-6 en comparación con las células expuestas a glucano solo (Figura 1D). En conjunto, mostramos que el aumento de la producción de ROS juega un papel menor en el aumento de la producción de citocinas de la inmunidad entrenada inducida por -glucano. Además, la inmunidad entrenada sostenida en niveles elevados de ROS podría estar relacionada con la modulación del antioxidante celular glutatión, ya que la NAC no solo es un eliminador de ROS, sino que también puede actuar como un precursor de la síntesis de glutatión.

3.2. El metabolismo del glutatión influye en las respuestas inmunitarias entrenadas

Los monocitos expuestos a -glucano durante 24 h muestran niveles más altos de la forma oxidada de glutatión (GSSG), que es por los niveles más altos de ROS encontrados en este momento (Figura 2A). Después del período de reposo, la forma reducida de glutatión (GSH) tiende a incrementarse en los macrófagos entrenados, sin que se alteren las concentraciones de la forma oxidada.

Figura 2. Los niveles de glutatión se modulan con la exposición a -glucano. (A) Niveles intracelulares de glutatión oxidado y reducido en monocitos después de 24 h de exposición con 1 µg/ml de glucano y 5 días después del período de reposo (n=4 donantes, agrupados de dos experimentos independientes). (B) Expresión de genes implicados en el metabolismo del glutatión en monocitos expuestos a -glucano durante 4 h y 24 h. La expresión se presenta como log10(ratio). (C) TNF e IL-6 producidos por macrófagos entrenados con -glucano después de un pretratamiento de 1 h con BSO 100 µM (n=9 donantes, agrupados de tres experimentos independientes, * p < 0,05 ANOVA de dos vías , pruebas de comparaciones múltiples de Sidak) (media ± SEM).

Los genes que codifican para las subunidades de la enzima limitante de la velocidad glutamato cisteína ligasa (GCLC y GCLM) muestran una mayor expresión a las 4 h después de la estimulación con β-glucano en comparación con los monocitos de control. La glutatión reductasa (GSR), la glutatión peroxidasa 7 (GPX7) y las enzimas de la familia de las glutaredoxinas (GLRX, 2, 5) también aumentan en el punto de tiempo de 24 h (Figura 2B), lo que sugiere no solo un aumento en la síntesis sino también una mayor tasa de reciclaje de glutatión. La inhibición farmacológica de la actividad de GCL con butionina sulfoximina (BSO) antes de la exposición a -glucano conduce a una disminución en la producción de IL-6 después de la reestimulación con LPS (Figura 2C). Por lo tanto, la modulación exógena de los niveles de glutatión, ya sea mediante la adición del precursor NAC, o su disminución mediante el bloqueo de la enzima GCL con BSO, amortiguó el aumento de la capacidad de respuesta de -glucano a la estimulación secundaria.

Para investigar más a fondo si la variación genética en los genes implicados en el metabolismo del glutatión influye en la inmunidad entrenada, se realizó un mapeo de QTL utilizando una cohorte de 325 individuos sanos. Probamos si los SNP comunes con una frecuencia alélica menor (MAF) > 0.05 en genes relevantes para el metabolismo del glutatión se asociaron con cambios en la capacidad de producción de citocinas proinflamatorias de los monocitos tras el entrenamiento in vitro con -glucano y BCG (Figura 3A, C).

Del mismo modo, también evaluamos el impacto de estas variantes genéticas en la inmunidad entrenada in vivo inducida por la vacunación con BCG de 278 individuos sanos (Figura 3B, C). Varios SNP dentro de una ventana de 250 kb de genes implicados en el metabolismo del glutatión se asociaron sugestivamente (valor p < 9,99 × 10−3) con la regulación positiva de la secreción de IL-1, TNF e IL-6 después del entrenamiento (Figura 3A, B).

En la misma cohorte, medimos los metabolitos plasmáticos involucrados en el metabolismo del glutatión antes de la vacunación con BCG. Los SNP identificados en los análisis in vitro e in vivo se asociaron significativamente con las concentraciones de glutatión circulante (valor p < 0.05) (Figura 3D). Además, encontramos una asociación positiva entre la concentración de glutatión en plasma y la producción de IL-1 ex vivo 90 días después de la vacunación con BCG tras la exposición in vitro al estímulo heterólogo Staphylococcus aureus (Figura 3E). La regulación positiva de la producción de IL-1 por la vacunación con BCG también se asocia positivamente con la concentración circulante de otros metabolitos involucrados en el metabolismo del glutatión, como la metionina, la cisteína, el glutamato y la glicina (Figura 3E). En general, los genes involucrados en el metabolismo del glutatión que contienen QTL para respuestas heterólogas innatas, a LPS (Figura 3A) o a S. aureus (Figura 3B), y la correlación entre los niveles séricos de glutatión y la producción de IL-1 ex vivo, ambos apuntan a un papel de esta vía en el establecimiento de la inmunidad entrenada.

Figura 3. El glutatión está asociado con funciones de inmunidad entrenada. Mapa de calor de los valores p de asociación (p < 9,99 × 10−3) entre los SNP asignados a genes implicados en el metabolismo del glutatión y la magnitud de la capacidad de producción de citoquinas por monocitos entrenados in vitro con (A) -glucano y BCG (n=251 voluntarios sanos para IL-6 y n=238 voluntarios sanos para TNF) y (B) respuestas de entrenamiento de BCG in vivo (n {{10}} voluntarios sanos). (C) Diagrama de caja del SNP de valor p más bajo por análisis (rs7768134, rs35568915). (D) Diagramas de caja que muestran los niveles plasmáticos de glutatión (corregidos por edad y sexo) estratificados por genotipo para rs2233294 (GPX3) y rs10136944 (GLRX5, n=302). El valor p para cada SNP se deriva de un modelo de regresión lineal con el SNP de interés como variable independiente y el glutatión (corregido por edad y sexo) como variable dependiente. (E) Correlaciones de Spearman entre los metabolitos circulantes al inicio del estudio involucrados en el metabolismo del glutatión frente a los cambios de pliegue de las respuestas de IL-6, IL-1 y TNF inducidas por S. aureus derivadas de PBMC medidas a los 14 o 90 días después Vacunación con BCG en comparación con la línea de base (n=297 voluntarios sanos). La tabla presenta el rho de Spearman para cada correlación, y las correlaciones en rojo resaltan las correlaciones positivas significativas (* p < 0,05, ** p < 0,01). La correlación entre la concentración de glutatión y el cambio de pliegue de la producción de IL-1 a los 90 días en comparación con el día 0 se proporciona como ejemplo en un diagrama de dispersión.

4. Discusión

Los macrófagos son células plásticas que adaptan su fenotipo a diferentes estímulos ambientales. Los macrófagos entrenados se basan en un metabolismo de alta energía, con aumento de la glucólisis, el ciclo TCA y la fosforilación oxidativa, para montar una respuesta con una mayor producción de citocinas proinflamatorias [6,22].

Además de la producción de citoquinas, el estallido oxidativo con la producción rápida de ROS aumenta en los macrófagos entrenados con BCG reestimulados [8]. Los neutrófilos esplénicos aislados de ratones tratados con BCG también muestran una mayor producción de ROS [23]. En línea con la tasa metabólica aumentada y la mayor capacidad para montar un estallido oxidativo, observamos que los monocitos y macrófagos expuestos a -glucano o BCG exhiben un aumento en la producción basal de ROS. Anteriormente se informó un aumento similar en la liberación de ROS en monocitos entrenados con oxLDL [9]. ROS tiene funciones efectoras en la eliminación de patógenos, pero también puede mediar en la transducción de señales [24]. La inhibición farmacológica de la enzima productora de ROS NOX o el tratamiento con moléculas antioxidantes -tocoferol y ácido ascórbico no eliminó la producción de citocinas aumentada por -glucano. Sin embargo, el eliminador de ROS NAC inhibió la producción de TNF potenciada por -glucano, lo que indica un posible papel de ROS en la inmunidad entrenada.

Curiosamente, la NAC no es solo una molécula antioxidante, sino que también actúa como precursora del glutatión, la principal molécula antioxidante endógena. Hay dos sistemas redox celulares principales, los nucleótidos de piridina, como NAD más /NADH, y los sistemas de tioles, que incluyen glutatión y tiorredoxinas. La relación NAD más/NADH aumenta en monocitos expuestos a glucano de manera sostenida después del período de diferenciación en macrófagos entrenados [22], similar a lo que informamos para los niveles de ROS. Aquí mostramos que las concentraciones de GSH también se modulan en la inmunidad entrenada.

Lo más sorprendente es que la concentración de la forma reducida de GSH solo aumenta en macrófagos entrenados diferenciados, mientras que los niveles de GSSG oxidado son estables. Esto sugiere que los macrófagos entrenados han aumentado las reservas de GSH, que a diferencia de NAD más /NADH no se asocian con la producción sostenida de ROS. La contribución del metabolismo del glutatión a la inmunidad entrenada se fortalece aún más mediante el análisis genético y metabólico de una cohorte de individuos sanos (300BCG). Se encontró que los polimorfismos genéticos comunes dentro de los genes relacionados con GSH influyen en la magnitud de la producción de citocinas sobre la inmunidad entrenada in vitro e in vivo (p < 9,99 × 10−3). Además, se encontró que dos de estos loci QTL, GPX3 en chr5 y GLRX5 en chr14, estaban asociados con las concentraciones plasmáticas de GSH (p < 0,05).

GSH es una molécula antioxidante, pero también se sabe que regula la expresión génica a través de diferentes mecanismos epigenéticos. El GSH participa en las modificaciones postraduccionales, como se observa en la S-glutationilación de la proteína del nucleosoma histona H3, y está alimentado por la vía de la metionina que finalmente conduce a la producción de s-adenosil metionina (SAM). A su vez, SAM es el principal donante de metilo utilizado para la metilación del ADN y las histonas [7]. El metabolito fumarato del ciclo TCA se acumula en los macrófagos entrenados, y su derivado monometilfumarato induce un fenotipo de inmunidad entrenada [5]. En los astrocitos, la exposición aguda al derivado dimetilfumarato agota el GSH intracelular pero aumenta el GSH total en puntos de tiempo posteriores [25]. La inmunidad entrenada está anclada por modificaciones epigenéticas que confieren memoria a largo plazo [26]. El aumento del contenido de GSH observado en este documento de los macrófagos entrenados podría facilitar el recableado epigenético necesario para el establecimiento de la memoria inmune innata.

Aquí, mostramos que la modulación farmacológica del glutatión y el estado redox de la célula disminuye la respuesta heteróloga de los macrófagos, como se ve por el efecto de BSO o NAC en la producción de citoquinas potenciada por -glucano. Además, en una cohorte de individuos sanos, el metabolismo de GSH se asocia con rasgos de inmunidad entrenados. Los mecanismos de inmunidad entrenados que están formados por el metabolismo de GSH aún deben explorarse más a fondo, pero la participación potencial de los paisajes metabólicos y epigenéticos hace que este centro metabólico sea una vía interesante para investigar en estudios futuros. Estos conocimientos contribuyen a desentrañar el cableado metabólico y epigenético de la inmunidad entrenada, lo que permite una mejor comprensión del impacto de la inmunidad innata en la salud y la enfermedad. En última instancia, una mejor comprensión ayudará a identificar nuevos objetivos de terapia en enfermedades caracterizadas por la desregulación de los procesos inmunitarios innatos.

Contribuciones de autor:

Conceptualización: FAV y JD-A.; metodología: AVF, VACMK, VM y JCA-B., MAG; análisis formal: AVF, VACMK, VM y JCA-B.; investigación AVF, JCA-B., SK, LCJdB, SJCFMM, VPM y BN; curación de datos: AVF, VACMK, VM y BN; redacción—preparación del borrador original, AVF; redacción—revisión y edición: todos los coautores; supervisión: MAG, MGN y JD-A.; adquisición de fondos: MAG y MGN Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.

Fondos:

JD-A. cuenta con el apoyo de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (subvención VENI 09150161910024). MGN. cuenta con el apoyo de una subvención avanzada ERC (833247) y una subvención Spinoza de la Organización Holandesa para la Investigación Científica. AVF cuenta con el apoyo de la Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT, Ph.D. grant PD/BD/135449/2017). JCAB cuenta con el apoyo de una beca del Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación, COLCIENCIAS, en Colombia (Convocatoria 756/2016). BN cuenta con el apoyo de una subvención para investigadores del NHMRC (Australia) (APP1173314).

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:

El estudio 300BCG fue aprobado por el comité de ética local CMO región Arnhem- Nijmegen, NL58553.091.16.

Declaración de consentimiento informado:

Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio, de acuerdo con la aprobación del comité ético de Arnhem-Nijmegen (nr. 2010-104).

Declaración de disponibilidad de datos:

Los datos de secuenciación de ARN presentados en este estudio están disponibles en NCBI Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE85243.

Expresiones de gratitud:

Los autores desean agradecer a todos los voluntarios por participar en el estudio 300BCG.

Conflictos de interés:

MGN es un fundador científico de TTxD. Los restantes autores declaran no tener conflicto de intereses. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito, o en la decisión de publicar los resultados.

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Anaisa V. Ferreira 1,2,* , Valerie ACM Koeken 1,3,4 , Vasiliki Matzaraki 1 , Sarantos Kostidis 5 , Juan Carlos Alarcon-Barrera 5 , L. Charlotte J. de Bree 1 , Simone JCFM Moorlag 1 , Vera P Mourits 1 , Boris Novakovic 6,7, Martin A. Giera 5 , Mihai G. Netea 1,8 y Jorge Domínguez-Andrés.

1 Departamento de Medicina Interna y Centro Radboud de Enfermedades Infecciosas (RCI), Centro Médico de Nijmegen de la Universidad Radboud, 6500 HB Nijmegen, Países Bajos;

Valerie.Koeken@radboudumc.nl (VACMK); Vasiliki.Matzaraki@radboudumc.nl (VM);

Charlotte.deBree@radboudumc.nl (LCJdB); Simone.Moorlag@radboudumc.nl (SJCFMM);

Vera.Mourits@radboudumc.nl (VPM); Mihai.Netea@radboudumc.nl (MGN).

2 Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4050-313 Porto, Portugal.

3 TWINCORE, una empresa conjunta entre el Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones (HZI) y la Facultad de Medicina de Hannover (MHH), 30625 Hannover, Alemania.

4 Centro de Medicina de Infecciones Individualizadas (CiiM), Departamento de Biología Computacional para Medicina de Infecciones Individualizadas, una empresa conjunta entre el Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones (HZI) y la Facultad de Medicina de Hannover (MHH), 30625 Hannover, Alemania.

5 Centro de Proteómica y Metabolómica, Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC), 2333 ZA Leiden, Países Bajos; s.kostidis@lumc.nl (SK); jcalarcon_barrera@lumc.nl (JCA-B.);m.a.giera@lumc.nl (MAG)

6 Investigación Epigenética, Instituto de Investigación Infantil Murdoch, Parkville, VIC 3052, Australia;boris.novakovic@mcri.edu.au.

7 Departamento de Pediatría, Universidad de Melbourne, Melbourne, VIC 3052, Australia.

8 Departamento de Genómica e Inmunorregulación, Instituto de Ciencias Médicas y de la Vida (LIMES), Universidad de Bonn, 53115 Bonn, Alemania.

* Correspondencia: anaisa.validoferreira@radboudumc.nl (AVF); Jorge.dominguezandres@radboudumc.nl (JD-A.); Tel.: más 31-2436-16636 (JD-A.).

For more information:1950477648nn@gmail.com