Los glucósidos de Cistanche mejoran el aprendizaje y la memoria en el modelo de demencia vascular en ratas

para más información:ali.ma@wecistanche.com

J. CHEN1,2, S.-N. ZHOU1, Y.-M. ZHANG2, Y.-L. FENG2, S. WANG2

1Departamento de Neurología, Hospital Qilu de la Universidad de Shandong, Jinan, China. & Brain Science Research Institute, Universidad de Shandong, Shandong, República Popular China

2Departamento de Neurología, Hospital Popular de la Región Autónoma de Mongolia Interior, RP China

Jin Chen y Yan-Mei Zhang contribuyeron igualmente a este estudio.

Resumen.- OBJETIVO:Glucósidos de cistanche(GC) se extraen de Xin JiangCistanche, que es ampliamente utilizado como hierba china. Este estudio tiene como objetivo evaluar los efectos de GC en la demencia vascular (DV).

MATERIALES Y MÉTODOS: El modelo VD se estableció mediante la ligadura de la arteria carótida común bilateral en ratas Wistar adultas, que recibieron administración ip diaria de solución salina, GC (10 mg/kg de peso corporal/d, ip) o oxiracetam (450 mg/kg de peso corporal/d, ip) durante 14 días. La prueba de Morris Water Maze valoró el rendimiento cognitivo de las ratas. El hipocampo fue disecado y sometido a análisis proteómico e inmunohistoquímico. RESULTADOS: El grupo GC mostró una latencia de escape significativamente menor que el grupo VD a los cuatro y cinco días después de la cirugía. No mostraron diferencias significativas en comparación con el grupo de operación simulada y el grupo de control de oxiracetam. En el hipocampo, las 21 manchas de proteína en el grupo GC mostraron diferentes niveles de expresión en comparación con el grupo VD. Esto incluyó las cuatro proteínas que mostraron una diferencia significativa: tres proteínas reguladas al alza, la proteína 1 similar a la tiorredoxina, la proteína cinasa 1 de la proteína activada por mitógeno de especificidad dual y la proteína 2 relacionada con la dihidropiridinasa (CRMP-2), y una proteína glutatión sintetasa regulada a la baja. El análisis inmunohistoquímico mostró que el nivel de proteína P-tau fue significativamente mayor en el grupo del modelo VD que en el grupo con operación simulada (p < 0,05).="" después="" del="" tratamiento="" con="" gc,="" el="" nivel="" de="" proteína="" p-tau="" en="" las="" ratas="" modelo="" vd="" mostró="" una="" disminución="" significativa="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" vd="" tratado="" con="" solución="" salina="" (p="">< 0,05).="" conclusiones:="" el="" gc="" juega="" un="" papel="" fundamental="" en="" la="" protección="" de="" las="" neuronas="" del="" hipocampo="" en="" el="" vd,="" al="" disminuir="" la="" fosforilación="" de="" p-tau="" y="" aumentar="" el="" nivel="" de="" expresión="" de="" crmp-2.="" la="" manipulación="" farmacológica="" de="" gc="" ofrece="" una="" nueva="" oportunidad="" para="" el="" tratamiento="" de="">

Palabras clave:

Demencia vascular, Glucósidos de cistanche, Proteómica, P-tau, Proteína relacionada con la dihidropirimidinasa 2.

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Introducción

La demencia vascular (DV) es la segunda demencia senil más importante y está causada principalmente por la enfermedad cerebrovascular isquémica. La VD conduce a un deterioro cognitivo heterogéneo y se necesitan nuevos fármacos terapéuticos eficaces que traten o prevengan la progresión de la VD1. Sin embargo, todavía no existe una hierba china eficaz para mejorar el deterioro cognitivo inducido por la isquemia cerebral.

Los glucósidos de cistanche (GC) se han utilizado ampliamente como hierba con efectos neuroprotectores. El extracto de Herba Cistanches mejora laAprendizaje y Memoriade ratones al promover la diferenciación de células neuronales, el crecimiento de neuritas y la formación de sinapsis2. Los glucósidos de cistanche pueden prevenir la apoptosis en las neuronas granulares del cerebelo y ejercer un efecto antiapoptosis al inhibir la activación de la caspasa-3 y la caspasa-83. El echinacósido, un componente activo principal de Herba Cistanches, es suficiente para proteger las células neuronales del daño causado por la rotenona mediante la activación de la señalización de Trk4. Sin embargo, los mecanismos por los que los GC mejoran el deterioro cognitivo en la DV aún se desconocen en gran medida.

La proteína tau es una proteína asociada a los microtúbulos neuronales que estabiliza los microtúbulos neuronales. La fosforilación de la proteína tau (P-tau) afecta su capacidad para interactuar con los microtúbulos e impacta la transmisión sináptica. La acumulación de ovillos neurofibrilares (NFT) consiste en proteína P-tau y es una de las principales características de la enfermedad de Alzheimer (EA)5. Es bien sabido que la DV y la EA son las dos enfermedades demenciales más comunes. Comparten una correlación común con los factores de riesgo vascular, como la hipertensión, la diabetes mellitus y la hipercolesterolemia. Por lo tanto, P-tau también puede estar implicada en VD.

Evaluamos los efectos de los GC enfunción de memoria de aprendizajeen un modelo de rata de VD y realizó análisis proteómicos e inmunohistoquímicos en el hipocampo de ratas VD para proporcionar información sobre los efectos neuroprotectores de GC. Nuestros resultados mostraron que GCmejora del aprendizaje y la memoriaen ratas VD, y cambió los niveles de proteínas como P-tau en ratas VD.

Materiales y métodos

animales

El centro experimental de animales de la provincia de Hubei, China, proporcionó ratas Wistar macho de seis meses (peso 230- 270 g). Todos los procedimientos con animales de experimentación se realizaron de acuerdo con las Pautas para el cuidado de los animales y las Regulaciones éticas locales del Hospital No. 1 de Wuhan, China. El número de aprobación ética es 00014834. Los animales se alojaron por separado en grupos de 4 por jaula a 25 grados con un ciclo de 12-horas de luz/12-horas de oscuridad y acceso libre a alimentos y agua. Los animales (n=45) se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos: grupo modelo (n=12), grupo con operación simulada (n=11), grupo tratado con GC (n{{14} }), y grupo de control tratado con oxiracetam (n=10).

Ligadura bilateral de la arteria carótida común (2-VO)

Bajo anestesia profunda con hidrato de cloral al 10 por ciento (reactivo de la fábrica de reactivos químicos Tianjin Damao, Tianjin, China) (350 mg/kg de peso corporal,

ip), las arterias carótidas comunes bilaterales (CCA) se separaron cuidadosamente de los tejidos circundantes y luego se ligaron firmemente con la sutura. La piel se reconstruyó posteriormente y las ratas se mantuvieron posteriormente a temperatura ambiente y se devolvieron a la jaula hasta la reanimación. Las ratas de control con operación simulada se sometieron al mismo procedimiento quirúrgico sin ligadura de CCA. Las ratas VD se trataron con GC (10 mg/kg de peso corporal/d, ip) u oxiracetam (450 mg/kg de peso corporal/d, ip) inmediatamente después de la cirugía durante 14 días sucesivos. Al grupo modelo se le inyectó el mismo volumen de solución salina normal.

Prueba del laberinto de agua de Morris

La prueba MWM se realizó de acuerdo con un método descrito previamente7. El área de prueba consistía en una piscina circular llena de agua (25 ± 1 grado), opaca con leche para que las ratas no pudieran ver la plataforma submarina 1 cm por debajo de la superficie del agua. La piscina se dividió en cuatro cuadrantes (etiquetados como zonas I, II, III y IV) y se sumergió una plataforma en la zona II. Se colocaron señales visuales en la pared de la sala de pruebas. Los animales se colocaron en el agua en uno de los cuatro puntos del cuadrante inicial, que se varió al azar a lo largo de los ensayos. A las ratas se les dio 2 min para encontrar la plataforma y sentarse en ella durante 15 s. Las ratas que no pudieron encontrar la ubicación dentro de un tiempo determinado fueron guiadas suavemente a la plataforma y se les permitió permanecer en ella durante 15 s. Se utilizó un sistema de seguimiento automático para registrar la ruta de nado, la latencia, la distancia de nado y el tiempo en cada zona. Todas las ratas fueron sacrificadas dos semanas después de la prueba MWM para el análisis posterior.

Extracción de proteínas

Bajo anestesia profunda con hidrato de cloral al 10 por ciento, todas las ratas sometidas a la prueba MWM fueron decapitadas. Los tejidos del hipocampo se recogieron rápidamente en hielo y luego se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Todos los tejidos se homogeneizaron bajo nitrógeno líquido utilizando un mortero y una maja y se recogieron en tampón de lisis (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 2 por ciento, Tris 20 mM). Las partículas insolubles se eliminaron por centrifugación a 12,000 rpm durante 20 min a 4 grados. Los ácidos nucleicos contaminados en las muestras se rompieron mediante oscilación sónica intermitente durante 5 min. Los sobrenadantes se recogieron después de la centrifugación en las mismas condiciones descritas anteriormente. La concentración de proteína en los sobrenadantes se midió mediante el ensayo de Bradford y los sobrenadantes se almacenaron a 80 grados.

Electroforesis en gel bidimensional

Las alícuotas de proteína (120 µg) se ajustaron con un tampón de rehidratación (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 4 %, DTT al 1 % peso/vol, tampón IPG 0, 5 % y una traza de azul de bromofenol) en un volumen de 350 µL. El enfoque isoeléctrico (IEF) se realizó en tiras de IPG (pH 4-7, tamaño 22 cm) a 300 V durante 12 min, 700 V durante 18 min, 1500 V durante 1,5 h, 9900 V durante 3 h, 9990 V durante 6,5 h y luego 600 V durante 20 h en un sistema Ettan IPGphor II (GE ETTAN IPGPHOR3). Después del programa IEF, las tiras se equilibraron en un tampón de equilibrio IPG I (urea 6 M, SDS al 2 %, glicerol al 30 %, Tris 0,375 M, pH 8,8, DTT 20 mg/ml y trazas de azul de bromofenol) y luego se alquiló (25 mg/ml de yodoacetamida en lugar de DTT en un tampón de equilibrio) durante 15 min. 2-DE se realizó en geles de poliacrilamida SDS al 12,5 % (24 cm × 19,5 cm × 1,0 mm) con pegamento sellador de agarosa al 0,5 %, utilizando el sistema de electroforesis Ettan DALT Six (GE ETTAN DALTsix, PA, EE. UU.). La electroforesis se llevó a cabo a 2 W durante 45 min, seguida de una separación a 17 W durante cuatro h hasta que el azul de bromofenol casi llegó al fondo de los geles. Las manchas de proteína se visualizaron mediante tinción con plata (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory) en geles analíticos. 2-Lavadora DE formada por triplicado y a partir de tres extracciones de proteínas independientes para cada grupo.

Electroforesis en gel preparativa

Se sometieron muestras de proteínas (600 µg) de cuatro grupos de ratas a 2-DE siguiendo el método descrito anteriormente. Las manchas de proteína se visualizaron mediante tinción con azul brillante de Coomassie (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory) en geles preparativos.

Adquisición y análisis de imágenes

Las imágenes del gel se capturaron en un sistema de escaneo de imágenes {{0}}DE (UMAX Powerlook1100, VT, EE. UU.) y se analizaron con el software Image Master 2D Platinum 5.0 (GE, PA, EE. UU.). Las manchas de proteína se detectaron automáticamente y luego se editaron manualmente para eliminar rayas, motas y artefactos.

Espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS)

Para la toma de huellas dactilares de la masa peptídica y el análisis posterior, los geles se cortaron en rodajas y las manchas teñidas con Coomassie se destiñeron y lavaron con bicarbonato de amonio 100 mM y acetonitrilo, se redujeron con DTT a 60 grados durante 40 minutos y luego se alquilaron con IAA. durante 30 min en la oscuridad. El gel se incluyó en 50 μl de una solución de tripsina modificada de 12 ng/μl en bicarbonato de amonio 50 mM (pH 8,6) a 37 grados durante la noche. Los péptidos se extrajeron del tapón de gel con 1 por ciento de ácido fórmico/2 por ciento de acetonitrilo y se concentraron utilizando C-18 Zip-Tips. Las digestiones se colocaron (cuatro réplicas) en un objetivo MALDI utilizando ácido a-ciano 4-hidroxicinámico (2 mg/ml en acetonitrilo al 50 por ciento, TFA al 0,1 por ciento que contenía fosfato de amonio diez mM) como matriz. Los espectros se adquirieron en un espectrómetro de masas 4700 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems, NY, EE. UU.) y se analizaron mediante el software GPS Explorer TM (Applied Biosystems).

inmunohistoquímica

Las secciones coronales del hipocampo se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento antes de incrustarse en parafina y luego se cortaron en secciones de 4- µm de espesor. Las secciones del hipocampo coronal finalizadas por departamento se procesaron para extinguir la actividad de la peroxidasa endógena utilizando H2O2 al 3 por ciento en solución salina tamponada con fosfato. Las inmunorreacciones inespecíficas se bloquearon a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpo P-tau y anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 30 min y se visualizaron después de la reacción con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (Dako, Tokio, Japón). Las imágenes se capturaron con un microscopio óptico (Olympus, Tokio, Japón) y se procesaron con el software Photoshop (versión 7.0, Adobe, San José, CA, EE. UU.).

Análisis estadístico

Los datos cuantitativos se expresaron como medias ± DE. Se realizó un análisis de varianza bidireccional (ANOVA) utilizando el software de análisis SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). p < 0,05="" se="" consideró="">

Resultados

GC promueve el aprendizaje y la memoria en ratas VD

Para evaluar los efectos de GC en la función cognitiva del modelo de rata VD, realizamos la prueba MWM. En la prueba de MWM, el grupo GC mostró una latencia de escape significativamente menor que el grupo VD a los 4 y 5 días después de la cirugía, pero no mostró diferencias significativas en comparación con el grupo de operación simulada y el grupo control de oxiracetam (Tabla I). Estos datos sugieren que GC promueve el aprendizaje y la memoria en ratas VD. GC cambia los perfiles proteómicos del hipocampo de ratas VD.

Por análisis proteómico del hipocampo de rata, encontramos que 21 puntos de proteína en el grupo GC mostraron diferentes niveles de expresión en comparación con el grupo VD. Entre ellas, cuatro proteínas mostraron una diferencia significativa en el hipocampo de las ratas GC (Tabla II): incluidas tres proteínas reguladas al alza, la proteína 1 similar a la tiorredoxina (TXNL 1), la proteína quinasa quinasa 1 activada por mitógeno de doble especificidad (MAPKK 1) y proteína 2 relacionada con dihidropirimidinasa (DPYSL2); y una proteína glutatión sintetasa (GCL) regulada negativamente. Los perfiles típicos de electroforesis en gel bidimensional (2-DE) de DPYSL2 se muestran en la Figura 1.

GC modula el nivel de P-tau en el hipocampo de ratas VD

Por análisis de inmunohistoquímica, encontramos que el nivel de proteína P-tau fue significativamente más alto en el grupo modelo VD que en el grupo con operación simulada (p < 0.05).="" después="" del="" tratamiento="" con="" gc,="" el="" nivel="" de="" proteína="" p-tau="" en="" las="" ratas="" modelo="" vd="" mostró="" una="" disminución="" significativa="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" vd="" tratado="" con="" solución="" salina="" (p="">< 0,05),="" pero="" no="" mostró="" una="" diferencia="" significativa="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control="" de="" oxiracetam="" (figura="">

Discusión

La DV se debe al deterioro de la memoria y del funcionamiento cognitivo causado principalmente por enfermedades cerebrovasculares8,9,10,11. El modelo de oclusión de dos vasos (2VO) es simple y estable y se reconoce como el modelo estándar de isquemia cerebral. En este estudio, utilizamos el modelo 2VO para establecer el modelo animal VD. Mediante la prueba MWM, encontramos que el grupo de VD mostró una capacidad cognitiva disminuida en comparación con el grupo de operación simulada, lo que confirma que establecimos el modelo de VD con éxito. Con base en este modelo, encontramos que el tratamiento con GC mejoró la capacidad cognitiva espacial de las ratas VD en una medida similar con oxiracetam, un control positivo. Estos datos indican que GC podría promover el aprendizaje espacial y el deterioro de la memoria en VD.

Para investigar el mecanismo por el cual GC ejerce efectos neuroprotectores en VD, empleamos un enfoque proteómico para detectar proteínas expresadas diferencialmente en el hipocampo de ratas VD. Encontramos que varias proteínas relacionadas con el metabolismo energético, el plegamiento de proteínas, la vía de señalización y el citoesqueleto mostraron diferentes expresiones en el hipocampo de las ratas VD tratadas con GC en comparación con las tratadas con solución salina como control.

Una de las proteínas expresadas diferencialmente es DPYSL2, también conocida como proteína mediadora de la respuesta a la colapsina-2 (CRMP-2), que se enriquece en la parte distal de los axones en crecimiento en las neuronas primarias del hipocampo y es crucial para la diferenciación de los axones. y crecimiento neuronal12,13. Además, CRMP-2 promueve el ensamblaje de microtúbulos y media la señalización de Ras para mejorar la formación de múltiples axones y la polaridad neuronal14,15. En este estudio, el nivel de expresión proteica de CRMP-2 aumentó 2,28 veces en el grupo GC en comparación con el grupo VD, lo que sugiere un papel importante para CRMP-2 en los posibles mecanismos de reparación de la formación de redes neuronales y mantenimiento de la polaridad neuronal en VD.

Además, en el presente estudio encontramos una mayor P-tau en el grupo modelo VD, pero una menor expresión de P-tau después del tratamiento con GC. La proteína tau juega un papel clave en la morfogénesis de las neuronas. En determinadas situaciones patológicas, la proteína P-tau puede generar agregados aberrantes tóxicos para las neuronas, al afectar la función mitocondrial15. Estudios previos sugieren que GC puede mejorar el metabolismo energético mitocondrial con función antioxidante16,17,18. Curiosamente, la fosforilación de CRMP-2 también se ha caracterizado como un constituyente de los ovillos neurofibrilares en la EA.

Conclusiones

CRMP2 es comúnmente fosforilado por la proteína quinasa dependiente de ciclina-5 (Cdk5) y la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3) en el cerebro de los pacientes con EA, las mismas quinasas que fosforilan la proteína tau para generar NFT19,20. Se necesitan más estudios para examinar si GC regula el nivel de expresión de P-tau y CRMP2 en VD mediante la regulación de la actividad de Cdk5 y GSK321,22,23. En resumen, nuestros datos sugieren que GC juega un papel fundamental para proteger las neuronas del hipocampo de VD, al disminuir la fosforilación de P-tau y aumentar el nivel de expresión de CRMP-2. La manipulación farmacológica de GC ofrece una nueva oportunidad para el desarrollo de terapia contra VD.

Expresiones de gratitud

Este estudio fue apoyado por la Fundación Especial para Académicos de Taishan y el Fondo Nacional de Ciencias Naturales (30960520).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existen conflictos de interés.

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