La gomisina N inhibe la melanogénesis mediante la regulación de las vías de señalización PI3K/Akt y MAPK/ERK en los melanocitos

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resumen: Gomisina N, uno de los compuestos de lignano encontrados en Schisandra Chinensis ha demostrado poseer actividades antioxidantes, antitumorales y antiinflamatorias en varios estudios. Aquí informamos, por primera vez, la eficacia antimelanogénica de Gomisin N en mamíferos. así como en embriones de pez cebra. Gomisin N redujo significativamente el contenido de melanina sin toxicidad celular. Aunque no fue capaz de modular la actividad catalítica del hongotirosinasaen vitro,Gomisina Nregulaba a la baja los niveles de expresión de proteínas clave que funcionan enmelanogénesis. Gomisin N downregulated melanocortin 1 receptor (MC1R), adenylyl cyclase 2, microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tirosinasa,tirosinasa-proteína relacionada-1(TRP-1) y proteína relacionada con la tirosinasa-2 (TRP-2). Además, las células Melan-A tratadas con Gomisin N mostraron niveles elevados de p-Akt y p-ERK, lo que implica que la activación de las vías PI3K/Akt y MAPK/ERK puede funcionar para inhibirmelanogénesis. También validamos que Gomisin N redujo la producción de melanina al reprimir la expresión de MITF,tirosinasa, TRP-1 y TRP-2en células de ratón y humanas, así como en el desarrollo de embriones de pez cebra. Colectivamente, concluimos queGomisina Ninhibe la síntesis de melanina al reprimir la expresión de MITF y enzimas melanogénicas, probablemente a través de la modulación de las vías PI3K/Akt y MAPK/ERK.

Palabras clave:Schisandra chinensis;Gomisina N; lignano;melanogénesis; blanqueamiento de la piel

cistanche tiene función blanqueadora de la piel

1. Introducción

La melanina es un pigmento que se encuentra en la mayoría de los órganos animales, como la piel, el cabello, los ojos, el oído interno, los huesos, el corazón y el cerebro [1,2].Melanogénesises un proceso complejo en el que intervienen múltiples vías de señalización. El receptor de melanocortina 1 (MC1R) es un regulador clave enmelanogénesis, señalando a través de sus ligandos, como la hormona estimulante de los melanocitos (MSH) y la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) [3]. La melanina de la piel es biosintetizada por los melanocitos en la epidermis y luego transferida a los queratinocitos, donde juegan un papel importante en la protección de la piel al absorber la radiación UV de la luz solar y eliminar los radicales libres reactivos [4,5]. La síntesis y transferencia de melanina en la piel y los folículos pilosos está regulada por la disponibilidad de sus precursores [6]. La L-tirosina y la L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), los principales sustratos de las enzimas melanogénicas, también funcionan como reguladores similares a las hormonas en la melanogénesis [7]. Por otro lado, la sobreproducción de melanina da como resultado problemas cutáneos no deseados, como pecas y melasma [8,9]. La melanogénesis puede afectar el comportamiento de los melanocitos normales y malignos al modular las propiedades elásticas de las células [10]. Aunque los receptores de serotonina y melatonina expresados ​​en las células cutáneas juegan un papel clave en el mantenimiento de la homeostasis celular, la producción excesiva de melanina a través de cambios hormonales descontrolados puede causar condiciones patológicas en la piel [11].

Por lo tanto, se han realizado grandes esfuerzos para dilucidar los mecanismos moleculares que controlan la melanogénesis como el paso principal para tratar los trastornos de la piel hiperpigmentaria. Además, varios tipos deblanqueamiento de la pielSe han identificado agentes que inhiben la síntesis de melanina a partir de extractos vegetales y no vegetales y se han utilizado comercialmente en cosmecéuticos [12,13]. Los agentes blanqueadores más utilizados incluyen hidroquinona, mequinol, arbutina, ácido kójico, ácido ascórbico y ácido retinoico [12,14]. Sin embargo, existen varias limitaciones de su uso en el tratamiento de síntomas agudos o crónicos de hiperpigmentación en seres humanos. Por ejemplo, la hidroquinona, aunque se ha utilizado durante mucho tiempo para la despigmentación desde la década de 1960, puede causar irritación de la piel y dermatitis de contacto [15,16]. También provoca daños en el ADN al aumentar la producción de especies reactivas de oxígeno y el desarrollo de ocronosis exógena en células de mamíferos [17,18]. Otros conocidostirosinasalos inhibidores como el ácido kójico y el ácido ascórbico no solo tienen poca penetración en la piel, estabilidad y eficacia blanqueadora, sino que también pueden causar citotoxicidad, dermatitis y eritema por el uso a largo plazo [19,20]. A este respecto, existe una necesidad creciente de desarrollar agentes blanqueadores más seguros y eficaces para tratar la hiperpigmentación de la piel humana. Las hierbas naturales utilizadas en la medicina tradicional pueden proporcionar fuentes alternativas para identificar nuevos agentes blanqueadores que controlen los pasos clave enmelanogénesiscon menos o ningún efecto secundario [21].

Schisandra chinensis, también conocida como baya de sabor fino del norte, se encuentra naturalmente en el noreste de China, el extremo este de Rusia, Japón y Corea [22]. Esta planta se ha utilizado durante mucho tiempo para el tratamiento de la ceguera nocturna, quemaduras en la piel, inflamación aséptica y enfermedades del hígado en la medicina oriental tradicional [23,24]. Se ha demostrado que el extracto de fruta de S. chinensis y sus compuestos de lignano poseen varios efectos farmacológicos en líneas celulares murinas. Por ejemplo, Schisandra A y C tienen efectos antioxidantes, mientras que Schisandra B tiene actividades antifibróticas, antiinflamatorias, antioxidantes y antiapoptóticas [25]. Otro compuesto de lignanoGomisina N(Figura 1A) se ha informado que suprime la apoptosis inducida por estrés oxidativo al inhibir la liberación de citocromo C de las mitocondrias al citoplasma, la escisión de caspasa 3 y PARP, y la transición de permeabilidad mitocondrial inducida por Ca2 plus en cardiomiocitos de rata H9c2 [7,8]. Curiosamente, varios estudios que utilizan modelos de ratón y líneas celulares de piel humana han revelado el potencial terapéutico de S. chinensis para el tratamiento de trastornos de la piel. Lee et al. informó que el extracto de metanol de la fruta S. chinensis aliviaba los síntomas de la dermatitis de contacto al reducir la producción de citoquinas proinflamatorias como TNF- e IFN- cuando se aplicaba tópicamente [8,24]. Kang et al. mostró que el extracto de agua de Schisandra Fructus inhibió la activación de IκB, suprimiendo así la producción de TNF-, IL-6 y GM-CSF en la línea de mastocitos humanos HMC-1 [26]. Estos hallazgos nos llevaron a postular que los lignanos de S. chinensis podrían afectar las funciones de las células de la piel de manera más amplia. En este estudio, buscamos investigar los roles putativos deGomisina N, uno de los principales compuestos de lignano en S. chinensis, en la regulaciónmelanogénesis, evaluando así su potencial uso como agente cosmecéutico. Aquí informamos queGomisina Ninhibe la biosíntesis de melanina sin toxicidad celular en células humanas y de ratón, así como en embriones de pez cebra.

2. Resultados

2.1. Efectos de la gomisina N sobre la formación de melanina y la viabilidad celular

Para verificar los efectos de Gomisin N enmelanogénesis, tratamos melanocitos de ratón con diferentes concentraciones deGomisina Ndurante 72 h, y luego evaluó los cambios en el contenido de melanina. El tratamiento con Gomisin N redujo el contenido de melanina tanto en la línea celular de melanocitos normales Melan-A como en las células de melanoma B16F10 de una manera dependiente de la dosis sin toxicidad celular (Figura 1B, C). Observamos que Gomisin N inhibía la producción de melanina inducida por -MSH en células B16F10, lo que era comparable con los resultados obtenidos por el tratamiento con PTU [27] (Figura 1C). Evaluar si la reducción de melanina alGomisina Nel tratamiento se debe a la disminución de la actividad de la tirosinasa, realizamos un ensayo de tinción de L-DOPA en células de melanocitos epidérmicos humanos normales (NHEM). Como se muestra en la Figura 1E, las células NHEM tratadas con Gomisin N exhibieron niveles reducidos de L-DOPA en comparación con las células no tratadas. Sin embargo, el efecto inhibitorio de Gomisin N sobre la producción de melanina no fue significativo en las células MNT-1 de melanoma humano (Figura 1D) .

2.2. Efectos de la gomisina N sobre la actividad de la tirosinasa

Para examinar siGomisina Ninhibetirosinasaactividad in vitro, usamos tirosinasa de hongo y lisados ​​de células de melanoma B16. El ácido kójico, un conocido inhibidor de la tirosinasa, se utilizó como control positivo. Cuando se trató con tirosinasa de hongos, mientras que el ácido kójico redujo significativamente la actividad enzimática, Gomisin N no indujo ningún cambio en la conversión de L-DOPA en dopacromo (Figura 2A). Sin embargo, cuando se trató con células de melanoma B16, Gomisin N resultó en una disminución entirosinasaactividad del lisado celular de una manera dependiente de la dosis (Figura 2B). Además, cuando se trata junto con -MSH en células B16,Gomisina Nrevirtió el aumento en la formación de dopacromo estimulada por -MSH (Figura 3C). En particular, Gomisin N pareció ser más eficaz que el ácido kójico para inhibir laactividad de tirosinasade células B16 tras el estímulo -MSH. Estos hallazgos implican que el efecto inhibitorio de GomisinN sobre la producción de melanina observado en células de ratón y humanos (Figura 1) no se debe a su función de inhibir directamente la actividad catalítica de la tirosinasa. Sin embargo, todavía es posible que Gomisin N regule la expresión de tirosinasa u otras proteínas que juegan un papel clave enmelanogénesis.

2.3. Efectos de Gomisin N en la inactivación de la vía de señalización MC1R

Intentamos dilucidar el mecanismo subyacente responsable del efecto inhibidor de GomisinN en la producción de melanina. Razonamos queGomisina Npodría regular las proteínas de señalización que están involucradas enmelanogénesisy por lo tanto inhiben la síntesis de melanina. El receptor de melanocortina 1 (MC1R) es un receptor acoplado a proteína G amelanocítica que funciona como un regulador clave en la síntesis de melanina. La activación de MC1R por su ligando -MSH o la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) conduce a un aumento de la adenilil ciclasa, que a su vez regula al alza los niveles de AMPc intracelular [2,3]. En consecuencia, el nivel transcripcional de MITF aumenta a través de la vía de la proteína quinasa-C (PKA)/proteína de unión a elementos de respuesta (CREB) [2,28]. Para evaluar el efecto regulador de Gomisin N en la ruta de señalización de MC1R, verificamos los niveles de expresión de MC1R y sus moléculas de señalización aguas abajo después de tratar las células Melan-A con Gomisin N. Observamos que Gomisin N reguló significativamente los niveles de proteína de MC1R y adenilil ciclasa 2 de una manera dependiente de la dosis (Figura 3A-C). Como se esperaba,Gomisina NLas células tratadas también exhibieron niveles reducidos de proteína de MITF y sus objetivos conocidos tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 (Figura 3A, D–G). Estos hallazgos sugieren que Gomisin N inhibe las enzimas productoras de melanina al inactivar MITF a través de la vía de señalización MC1R.

2.4. Efectos de la gomisina N sobre la fosforilación de Akt y ERK1/2 en células Melan-A

Se sabe que las vías PI3K/Akt y MAPK/ERK están implicadas en la melanogénesis mediante la regulación transcripcional o postranscripcional de MITF [29,30]. Para evaluar si GomisinN afecta estas vías de señalización, evaluamos el estado de fosforilación de Akt y ERK1/2 mediante un análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Figura 3H-J, el tratamiento de dosis alta (30 µM) deGomisina Nmejoró significativamente la fosforilación de Akt y ERK. Estos datos indican que el efecto inhibitorio de Gomisin N sobremelanogénesises probable que esté asociado con las vías P13K/Akt y MAPK/ERK.

2.5. Gomisin N inhibió la melanogénesis en embriones de pez cebra

A continuación, nos propusimos examinar si Gomisin N es eficaz para inhibirmelanogénesisen vivo. Con este fin, tratamos embriones de pez cebra con Gomisin N durante 72 h en concentraciones de 1, 10, 20 y 30 µM, y luego medimos los niveles de expresión de proteínas melanogénicas. Observamos que el tratamiento con Gomisin N inhibió la formación de melanina en el desarrollo de embriones de pez cebra.Gomisina NLos embriones tratados mostraron una reducción en el contenido de melanina de una manera dependiente de la concentración en comparación con el control no tratado (Figura 4). También encontramos que los niveles de proteína detirosinasa, MITF, TRP-1 y TRP-2 se redujeron con el tratamiento con Gomisin N (Figura 5). Estos resultados demuestran que Gomisin N inhibe la melanogénesis in vivo al regular el factor de transcripción MITF y sus dianas.tirosinasa, TRP-1 y TRP-2.

2.6. Gomisin N revirtió la melanogénesis inducida por rapamicina en humanos MNT-1

Aunque Gomisin N inhibió significativamentemelanogénesisen células Melan-A y B16, así como en embriones de pez cebra, no observamos su efecto en células de melanoma MNT-1 humano. Esperábamos que el efecto de Gomisin N pudiera ser detectable en células MNT-1 bajo la condición en la que la melanogénesis está regulada por un estímulo apropiado. Se ha demostrado que la rapamicina induce la melanogénesis al aumentar la actividad de la tirosinasa y los niveles de proteína de MITF, tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 [31], en parte a través de la activación de la autofagia [32]. Monitoreamos los niveles detirosinasa, MITF, TRP-1 y TRP-2 en células MNT-1 mediante análisis de transferencia Western, después del cotratamiento con Gomisin N andrapamicina. El tratamiento con rapamicina indujo significativamente los niveles de MITF, TRP-1 y TRP-2 pero no tuvo efecto sobretirosinasaniveles (Figura 6). Sin embargo, el tratamiento con Gomisin N revirtió significativamente los efectos de la rapamicina en MITF, TRP-1 y TRP-2 de una manera dependiente de la concentración. El efecto inverso deGomisina Ncontra rapamicina fue más prometedor a la concentración de 20 y 30 µM que a 10 µM. Estos resultados sugieren que Gomisin N inhibemelanogénesisen las células de melanoma MNT-1 humanas mediante la regulación del factor de transcripción MITF y sus dianas TRP-1 y TRP-2.

3. Discusión

La función principal de la melanina es proteger las células de la piel contra la radiación UV [33–35]. La hiperpigmentación, el resultado de una sobreproducción de melanina en la piel, provoca problemas estéticos no deseados y se asocia con dermatitis y cáncer de piel. Varios informes han sugeridomelanogénesiscomo un objetivo importante para el tratamiento del melanoma metastásico [36,37]. Por lo tanto, existe una necesidad creciente de desarrollar agentes antimelanogénicos que regulen la melanogénesis sin toxicidad celular [38]. Hay varias vías involucradas en la melanogénesis de la piel [39,40]. Tras la unión del ligando, MC1R mejora la actividad de la adenilil ciclasa, que posteriormente aumenta los niveles intracelulares de AMPc [41,42]. Se ha informado ampliamente que la activación dependiente de AMPc de la vía PKA/CREB aumenta los niveles transcripcionales de MITF, lo que mejora la síntesis de melanina [43]. MITF funciona como un regulador maestro de las tres principales enzimas melanogénicas tirosinasa, TRP-1 y TRP-2en vertebrados [3,21,44]. Estas enzimas son proteínas transmembrana ubicadas en la membrana melanosomal de los melanocitos. La tirosinasa regula el paso limitante de la velocidad enmelanogénesismediante la conversión de L-tirosinasa en L-DOPA [23]. TRP-1 y TRP-2 también juegan un papel importante en la síntesis de melanina, aunque sus funciones no se comprenden completamente.

En este estudio, Gomisin N, un compuesto de lignano de S. chinensis, mostró actividad despigmentante sin toxicidad celular. Gomisin N inhibió la síntesis de melanina en líneas celulares de mamíferos cultivadas, así como en embriones de pez cebra. Gomisin N parecía ser más eficaz que el control positivo PTU en la inhibición de la producción de melanina en las células Melan-A (Figura 1B). Gomisin N redujo el contenido de melanina de manera dependiente de la concentración. En comparación con el grupo de control no tratado, 10 µM deGomisina Nredujo el contenido de melanina en aproximadamente un 40 por ciento, sin toxicidad celular. La actividad antimelanogénica de 10-µM Gomisin N fue comparable con la de 100-µM PTU en células Melan-A. De manera similar, Gomisin N pareció ser más potente que PTU en células B16F10 activadas con -MSH, donde los efectos de 5- y 10-µM Gomisin N fueron comparables con los de 10- y {{12 }} µM PTU, respectivamente (Figura 1C). Las células NHEM tratadas con Gomisin N exhibieron niveles reducidos de L-DOPA, lo que sugiere que GomisinN inhibetirosinasaactividad en células cultivadas (Figura 1E). Estos hallazgos nos llevaron a investigar más a fondo el mecanismo subyacente por el cual Gomisin N inhibe la melanogénesis.

Examinamos siGomisina Nmodula directamente la actividad catalítica detirosinasain vitro. A diferencia del ácido kójico, Gomisin N no mostró efectos inhibitorios sobre la actividad de la tirosinasa de hongos (Figura 2A). Sin embargo, la actividad de la tirosinasa celular en los lisados ​​de células de melanoma B16 se reguló significativamente por Gomisin N con y sin tratamiento con -MSH (Figura 2B,C). Se encontró que la inhibición de la actividad tirosinasa celular de Gomisin N tras el estímulo de -MSH era más significativa que la del control positivo Ácido kójico (Figura 2C).

Postulamos que la función anti-melanogénica de Gomisin N podría ocurrir a través de la regulación transcripcional o postranscripcional de la tirosinasa y las proteínas relacionadas con la tirosinasa (TRP). Para validar esto, medimos los niveles de expresión de las moléculas de señalización en la vía MC1R, un determinante importante para el cantidad y calidad de la producción de melanina en los melanocitos. Como era de esperar, observamos que Gomisin N redujo los niveles de MC1R y adenilil ciclasas 2 en las células Melan-A (Figura 3A-C). Es más,Gomisina Nreguló a la baja la expresión de MITF y sus proteínas diana, incluidas la tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 (Figura 3A,D–G). Estos resultados sugieren que los niveles reducidos del contenido de melanina tras el tratamiento con Gomisin N resultan de la desactivación de la vía MC1R.

Por otro lado, las vías PI3K/Akt y MAPK/ERK pueden fosforilar MITF y, por lo tanto, pueden modular su actividad postranscripcional [45]. Sin embargo, el efecto general de la activación de las vías PI3K/Akt y MAPK/ERK enmelanogénesises controvertido Tanto la vía PI3K/Akt como la MAPK/ERK se activan constitutivamente en los melanomas humanos debido a mutaciones acumuladas [46]. Se sabe que la despigmentación mediada por ceramida C2-en células Mel-Ab se produce a través de una reducción en los niveles de p-Akt [47]. Hay varios compuestos naturales que activan la melanogénesis al aumentar los niveles de p-ERK en las células de melanoma B16 [28]. Por el contrario, también hay evidencia de que los niveles elevados de p-ERK y p-Akt inhiben la síntesis de melanina [28,48]. La complejidad en la regulación de la melanogénesis puede explicarse parcialmente por el hecho de que la fosforilación mejora la actividad transcripcional de MITF, pero simultáneamente induce la degradación de MITF dependiente de proteosoma por ubiquición [26,49–51]. Nuestros datos mostraron que los niveles de p-Akt y p-ERK estaban regulados al alza en las células Melan-A tratadas con Gomisin N (Figura 3H-J). Esto implica que las vías PI3K/Akt y MAPK/ERK pueden contribuir a la inhibición de la producción de melanina.

Validamos aún más la actividad antimelanogénica de Gomisin N en el modelo in vivo de pez cebra. Los embriones de pez cebra tratados con Gomisin N mostraron una reducción significativa en la pigmentación de melanina (Figura 4). Además, Gomisin N disminuyó notablemente los niveles detirosinasa, MITF, TRP-1 y TRP-2 en el desarrollo de embriones de pez cebra. Estos hallazgos sugieren colectivamente queGomisina Ninduce la despigmentación al regular a la baja la expresión de MITF y enzimas melanogénicas in vivo. La actividad antimelanogénica de Gomisin N se confirmó aún más en células MNT-1 de melanoma humano estimuladas por rapamicina. Aunque Gomisin N resultó en solo pequeños cambios en el contenido de melanina en las células MNT-1 (Figura 1D), fue eficaz para revertir la regulación positiva inducida por la rapamicina de MITF, TRP-1 y TRP-2 en una manera dependiente de la concentración (Figura 6A,C-E). En conjunto, el efecto regulador deGomisina Nen MITF y enzimas melanogénicas se encontró reproduciblemente en células humanas y de ratón, así como en embriones de pez cebra.

En resumen, este trabajo sugiere que Gomisin N puede tener un alto potencial como novelablanqueamiento de la pielagente. La gomisina N parece inhibirmelanogénesisal reprimir la expresión de MITF a través de la vía MC1R, en lugar de modular directamente la actividad catalítica detirosinasay TRP. Aunque quedan por dilucidar los mecanismos detallados, es probable que la despigmentación inducida por la gomisina N esté asociada con la activación de las vías PI3K/Akt y MAPK/ERK (Figura 7).

4. Materiales y Métodos

4.1. Materiales

RPMI1640 se adquirió de Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, EE. UU.). El medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero bovino fetal (FBS) y la penicilina-estreptomicina (PS) se adquirieron de Hyclone (Carlsbad, CA, EE. UU.). El medio de crecimiento de melanocitos se adquirió de PromoCell (Heidelberg, Alemania). Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), ácido kójico, 1-fenil-2-tiourea (PTU), tirosinasa de hongos, 3,{{ 9}}dihidroxi-1-fenilalanina (L-DOPA), -MSH, sulfóxido de dimetilo (DMSO) y paraformaldehído se adquirieron de SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.).Gomisina NEl compuesto fue proporcionado por Chul Young Kim (Universidad de Hanyang, Ansan, Corea). La rapamicina se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).

4.2. Cultivo de células

La línea celular de melanoma de ratón B16F10 fue proporcionada por el Korean Cell Line Bank (Seúl, Corea). -si, Corea). Aeyeong Lee (Collage de Medicina en la Universidad de Dongguk, Goyang-si, Corea) proporcionó generosamente células de melanoma humano MNT-1. Los melanocitos epidérmicos humanos normales primarios (NHEM) se adquirieron de PromoCell (Heidelberg, Alemania). Las células Melan-A se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.) suplementado con FBS al 10 por ciento, PS al 1 por ciento y TPA 200 nM. Se usó DMEM complementado con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de PS para mantener las células Melan-A y las células NHEM. Todas las células se incubaron a 37 ◦C en una incubadora con CO2 al 5 por ciento.

4.3. Medición del contenido de melanina

Las células Melan-A se sembraron en una 24-placa de pocillos (1 × 105 células/pocillo), tratadas conGomisina N, y luego se incubaron durante 72 h. Después de 72 h, se midió el contenido de melanina como se describió anteriormente [53]. Brevemente, después de retirar los medios de cultivo, las células se lavaron tres veces con PBS. A continuación, se añadió solución de hidróxido de sodio (1 ml, 1 N) a cada pocillo para disolver la melanina. La absorbancia a 405 nm se midió utilizando un lector de microplacas. Este ensayo se repitió con células B16F10 (2 × 104 células/pocillo) y células MNT-1 siguiendo el mismo método.

4.4. Análisis de Western Blot

Las células Melan-A se sembraron en placas de 100 mm (1 × 106 células/placa) y se trataron con 1, 5 o 10 µMGomisina Ndurante tres días a 37 ◦C. Las células se lavaron con PBS y luego se recolectaron con un raspador. Las células separadas se pusieron en 1 ml de PBS y se centrifugaron a 7500 rpm durante 5 min. Después de retirar la solución superior, los sedimentos celulares se lisaron con tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 80, SDS al 0,1 por ciento, NaCl 150 mM, NP al 1 por ciento-40, azida sódica al 0,02 %, desoxicolato sódico al 0,5 %, PMSF 100 µg/mL, aprotinina 1 g/mL) durante 24 h a 4 ◦C. Las proteínas totales se extrajeron utilizando una ultracentrífuga a 12,000 rpm durante 30 min a 4◦C. El contenido de proteína se midió utilizando el ensayo de Bradford. Las proteínas (30 µg) se separaron usando un gel de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 por ciento (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de antrocelulosa. La membrana se bloqueó durante 1 h con leche descremada al 5 % en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST), y luego se incubó durante 12 h a 4 ◦C con anticuerpos primarios dirigidos a -tubulina (Santa Cruz, CA, EE. UU. ), MITF (señalización celular, Danvers, MA, EE. UU.), tirosinasa (señalización celular), ERK (señalización celular), fosfo-ERK (señalización celular), AKT (señalización celular), fosfo-AKT (señalización celular),MC1R ( Santa Cruz), adenilil ciclasas 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) y TRP-2 (Santa Cruz). Después de eliminar los anticuerpos primarios, las membranas se lavaron tres veces con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios. anticuerpos (IgG-HRP anti-cabra de conejo; HRP anti-conejo de ratón, Santa Cruz) durante 1 h. Las membranas se trataron con reactivo de quimioluminiscencia mejorado utilizando el sistema de imágenes ChemiDoc XRS plus (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). El análisis densitométrico de las bandas se realizó con el software Image MasterTM 2D Elite (versión 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.).

4.5. Ensayo de actividad de tirosinasa

Estimar el efecto inhibitorio de Gomisin N sobre hongostirosinasaactividad, la tirosinasa se incubó con 1, 5 o 10 µMGomisina No el control positivo Ácido kójico. Cada muestra se disolvió en metanol. Se diluyeron L-DOPA (8,3 mM) y tirosinasa de hongo (125 U) en tampón fosfato 80 mM (pH 6,8). Se mezclaron 40 µL de cada muestra y 120 µL de L-DOPA en una placa de pocillos 96-, seguido de la adición de 40 µL de tirosinasa de hongo diluida. A continuación, las placas se incubaron durante 15 min y se midió la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de microplacas.

tirosinasala actividad en lisados ​​de células de melanoma B16 se midió con o sin tratamiento con -MSH, como se describió previamente por Ohguchi et al. [54], con ligeras modificaciones. El lisado celular se preparó como se describe anteriormente en la parte del análisis de Western Blot. Las proteínas totales en el sobrenadante se midieron mediante el ensayo de Bradford utilizando albúmina de suero bovino como estándar [55]. Se diluyó una cantidad igual de proteínas y se usó para el ensayo de actividad de tirosinasa.

inhibir la actividad de la tirosinasa

4.6. Tinción de L-DOPA en células NHEM

Las células NHEM se sembraron en una {{0}}placa de pocillos y se incubaron durante 72 h con Gomisin N. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 40 min, seguido de un tratamiento con Triton X al 0,1 %. {6}} durante 2 min. Se añadió L-DOPA (0,1 por ciento) a cada pocillo, seguido de incubación durante 2 h. Después de eliminar la solución, las células se lavaron dos veces con PBS. Las imágenes fueron fotografiadas al microscopio.

4.7. Experimentos con pez cebra

Los embriones de pez cebra se obtuvieron del Banco de recursos de pez cebra (Daegu, Corea). Los embriones fueron tratados con Gomisin N durante 72 h. El efecto despigmentante deGomisina Nen embriones de pez cebra se observó bajo el microscopio estereoscópico. Para el análisis de transferencia Western, los embriones tratados con Gomisin N se lisaron usando un tampón de lisis, a partir del cual se prepararon las proteínas totales como se mencionó anteriormente.

5. Conclusiones

Nuestro resultado apoya la opinión de que Gomisin N tiene un alto potencial para su uso como alimento funcional yblanqueamiento de la pielagente.Gomisina Nes uno de los principales compuestos de lignano en S. chinensis. En hechos. Chinensis es una medicina herbaria utilizada para la cura de muchas enfermedades humanas. Sin embargo, son necesarios más estudios epidemiológicos para demostrar la seguridad de Gomisin N en la piel. En consecuencia, los estudios in vivo y los ensayos clínicos podrán demostrar más claramente la eficacia de GomisinN. En conclusión, este estudio sugiere queGomisina Npuede ser un potencial agente hipopigmentario y naturalblanqueamiento de la pielcandidato para la industria cosmética.

Cistanche mejora el blanqueamiento

Referencias

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barret, K.; Blount, M.; Carretero, N.; Heath, A. El impacto de la melanina epidérmica en las mediciones objetivas del color de la piel humana. Res. de células de pigmento 2002, 15, 119–126. [Referencia cruzada] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Vías de señalización en la melanogénesis. En t. J.Mol. ciencia 2016, 17, 1144. [Referencia cruzada] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentación de melanina en la piel de los mamíferos y su regulación hormonal. Fisiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [Referencia cruzada] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. El papel de la melanina como protector contra los radicales libres en la piel y su papel como indicador de radicales libres en el cabello. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Espectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [Referencia cruzada] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT El contenido de melanina en las metástasis de melanoma afecta el resultado de la radioterapia. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [Referencia cruzada] [PubMed]

6. Slominski, A.; Worstman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Pigmentación del folículo piloso.J. investigando Dermatol. 2005, 124, 13–21. [Referencia cruzada] [PubMed]

7. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirosina y L-dihidroxifenilalanina como reguladores similares a hormonas de las funciones de los melanocitos. Res. de melanoma de células pigmentarias. 2012, 25, 14–27. [Referencia cruzada] [PubMed]

8. Lee, AY Avances recientes en la patogénesis del melasma. Res. de melanoma de células pigmentarias. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speekkaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. La biología de los síndromes de hiperpigmentación. Res. de melanoma de células pigmentarias. 2014, 27, 512–524. [Referencia cruzada] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT El papel del pigmento de melanina en el melanoma. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [Referencia cruzada] [PubMed]11. Slominski, A.; Worstman, J.; Tobin, DJ El sistema cutáneo serotoninérgico/melatoninérgico: asegurando un lugar bajo el sol. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [Referencia cruzada] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmecéuticos para la hiperpigmentación: ¿Qué hay disponible? J. CutaneousAesthet. Cirugía 2013, 6, 4–11. [Referencia cruzada] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.; Passeron, T.; Choi, W.; et al. Regulación de la pigmentación de la piel humana y respuestas a la radiación ultravioleta. Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [Referencia cruzada] [PubMed]

14. Davis, EC; Callender, VD Hiperpigmentación posinflamatoria: una revisión de la epidemiología, las características clínicas y las opciones de tratamiento en la piel de color. J. Clin. esteta Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, CR Una visión general de los efectos moduladores del ácido oleico en la salud y la enfermedad. Mini. Rev.Med. química 2013, 13, 201–210. [Referencia cruzada] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, SA; Cho, C.; Hong, MC; espinilla, MK; Bae, H. Encuesta y mecanismo de agentes despigmentantes y aclarantes de la piel. fitotera. Res. 2006, 20, 921–934. [Referencia cruzada] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Genotoxicidad inducida por hidroquinona y daño oxidativo del ADN en células HepG2. química Biol. Obrar recíprocamente. 2008, 173, 1–8. [Referencia cruzada] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hidroquinona: Contaminación ambiental, toxicidad y respuestas microbianas. BioMed Res. En t. 2013, 2013, 542168. [Referencia cruzada] [PubMed]

19. Draelos, ZD Preparaciones para aclarar la piel y la controversia de la hidroquinona. Dermatol. El r. 2007, 20,308–313. [Referencia cruzada] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Parque, BH; Park, JW El aceite de onagra saponificado reduce la melanogénesis en las células de melanoma B16 y reduce la pigmentación de la piel inducida por los rayos UV en los seres humanos. Lípidos 2010, 45, 401–407. [Referencia cruzada] [PubMed]

21. Cordell, Georgia; Colvard, MD Productos naturales y medicina tradicional: cambio de paradigma. J.Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [Referencia cruzada] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Farmacología de Schisandra Chinensis Bail: una descripción general de la investigación y los usos rusos en medicina. J. Etnofarmaco. 2008, 118, 183–212. [Referencia cruzada] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. Efectos beneficiosos de Schisandrin B sobre la función cardíaca en modelos de ratones con infarto de miocardio. PLoS UNO 2013, 8,e79418. [Referencia cruzada] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, SA; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ Efectos de SchisandraChinensis Turcz. fruta en la dermatitis de contacto inducida por dinitrofluorobenceno en ratones. mol. Medicina. Informe 2015,12, 2135–2139. [Referencia cruzada] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Asique.; Jeon, JH Los efectos protectores del extracto de fruta de Schisandra Chinensis y sus lignanos contra las enfermedades cardiovasculares: una revisión de los mecanismos moleculares. Fitoterapia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, SA; Choi, JH; Choi, HJ; Parque, PS; Cho, SH; Lee, GH; Entonces, HY; Choo, YK;Kweon, OH; et al. Efectos del extracto acuoso de Schisandra Fructus sobre la liberación de citocinas de una línea de mastocitos humanos. J.Med. Comida 2006, 9, 480–486. [Referencia cruzada] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. Inhibición de la producción de micronúcleos inducida por L-tirosina por feniltiourea en células de melanoma humano. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [Referencia cruzada]

28. Kim, HJ; Kim, ES; Dong y.; Lee, ES; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, POR Efecto inductor de melanogénesis de la cirsimaritina a través de aumentos en el factor de transcripción asociado a la microftalmía y la expresión de tirosinasa. En t. J. Mol. ciencia 2015, 16, 8772–8788. [Referencia cruzada] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbé, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmedia la activación dependiente de cAMP de quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) en melanocitos. EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [Referencia cruzada] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. AMP cíclico un mensajero clave en la regulación de la pigmentación de la piel. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [Referencia cruzada] [PubMed]

31. Ja, YS; Cho, HY; Lim, TY; Parque, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Inducción de la melanogénesis por rapamicina en células de melanoma humano MNT-1. Ana. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [Referencia cruzada][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Parque, JE; Jo, SY; Explosión, SH; Chang, EJ; Chang, SE La cadena 3 de proteína ligera asociada a microtúbulos está involucrada en la melanogénesis a través de la regulación de la expresión de MITF en los melanocitos. ciencia Report.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Audición, VJ, Jr. Trastornos genéticos de la pigmentación. Adv. Tararear. Gineta. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Golpe, VB; Chen, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. -la hormona estimulante de melanocitos suprime el estrés oxidativo a través de una vía de señalización mediada por ap53-en melanocitos humanos. mol. Cáncer Res. 2012, 10, 778–786. [Referencia cruzada] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomas de un vistazo. J. ciencia celular. 2008, 121,3995–3999. [Referencia cruzada] [PubMed]

36. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT La melanogénesis afecta la supervivencia general y libre de enfermedad en pacientes con melanoma en estadio III y IV. Tararear. Patol. 2013, 44, 2071–2074. [Referencia cruzada] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetovic, Z.; arroyos, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.;Seagroves, TN El papel de la melanogénesis en la regulación del comportamiento del melanoma: la melanogénesis conduce a la estimulación de la expresión de HIF-1 y las vías concomitantes dependientes de HIF. Arco. Bioquímica Biografía. 2014, 563,79–93. [Referencia cruzada] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; espinilla, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Efecto inhibidor de la melanogénesis del extracto de Gastrodia elata en células de melanoma HM3KO. J. Cosmet. ciencia 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Precio, RE; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP quinasa vincula el factor de transcripción Microftalmía con la señalización de c-Kit en los melanocitos. Naturaleza 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Precio, ER; tintineo, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, señalización específica del linaje en melanocitos. La estimulación de C-kit recluta p300/CBP para la microftalmía.J. Biol. química 1998, 273, 17983–17986. [Referencia cruzada] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbé, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Producto de Microphthalmiagene como transductor de señal en la diferenciación de melanocitos inducida por AMPc. J. Cell Biol. 1998, 142.827–835. [Referencia cruzada] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.; Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Dimerización de cremallera de leucina restringida y especificidad del reconocimiento de ADN del regulador maestro de melanocitos MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [Referencia cruzada] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE De los genes a las drogas: Estrategias dirigidas para el melanoma. Nat. Rev. Cancer2012, 12, 349–361. [Referencia cruzada] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Efectos inhibitorios del resveratrol sobre la síntesis de melanina en la pigmentación inducida por ultravioleta B en piel de cobayo. Biomol. El r. 2014, 22, 35–40. [Referencia cruzada] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Inhibición de la melanogénesis por ácido gálico: posible participación de las vías de señalización PI3K/Akt, MEK/ERK y Wnt/ -catenina en células B16F10. En t. J. Mol. ciencia 2013, 14, 20443–20458. [Referencia cruzada] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MI; Thang, Dakota del Norte; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. Señalización de RAS/RAF/MEK/ERK y PI3K/PTEN/AKT en la progresión y terapia del melanoma maligno. Dermatol. Res. Practica 2012, 2012, 354191. [Referencia cruzada] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Luna, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramide inhibe la proliferación celular a través de la inactivación de AKT/PKB y disminuye la síntesis de melanina en las células Mel-Ab. Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [Referencia cruzada] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, Sr.; Kwon, HJ; Lee, CH Regulación a la baja de la síntesis de melanina por tener A y su aplicación al modelo de rayos in vivo. J. Investig. Dermatol. 2008, 128, 1227–1235. [Referencia cruzada] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF en melanoma: mecanismos detrás de su expresión y actividad. Célula Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [Referencia cruzada] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC La esfingosina-1-fosfato disminuye la síntesis de melanina a través de la activación sostenida de ERK y la posterior degradación de MITF. J. ciencia celular. 2003, 116, 1699–1706. [Referencia cruzada] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischoff, O.; Campisi, J.; Sí, ET; Medrano, EE Regulación de los niveles de proteína MITF del factor de transcripción asociado a microftalmía por asociación con la enzima conjugadora de ubiquitina hUBC9. Exp. Resolución celular 2000, 255, 135–143. [Referencia cruzada] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR Una línea de melanocitos de ratón no tumorigénicos, singénicos con el melanoma B16 y que requieren un promotor tumoral para su crecimiento. En t. J. Cáncer 1987, 39, 414–418. [Referencia cruzada][PubMed]

53. Meira, Virginia Occidental; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR La melanogénesis inhibe la respiración en las células de melanoma B16-F10 mientras que aumenta el contenido de células mitocondriales. Exp. Resolución celular 2017, 350, 62–72. [Referencia cruzada][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol como inhibidor de la potentirosinasa del género Gnetum. Biosci. Biotecnología. Bioquímica 2003, 67, 663–665. [Referencia cruzada] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Inhibición de la actividad de tirosinasa y pigmentación de melanina por 2-hidroxitirosol. Acta Pharm. Sínica B 2014, 4, 141–145. [Referencia cruzada] [PubMed]