Graham-2023-El aprendizaje genera una transcripción única

Abstracto:
El aprendizaje puede inducir plasticidad neurofisiológica en la corteza auditiva en múltiples escalas de tiempo. Los cambios duraderos en la función cortical auditiva que persisten durante días, semanas o incluso toda la vida requieren la expresión genética inducida por el aprendizaje. De hecho, la transcripción de novo es el determinante molecular de si las experiencias transitorias se transforman en recuerdos a largo plazo con un impacto duradero en el comportamiento.

Con el continuo desarrollo de la ciencia y la tecnología, han aparecido muchos fenómenos mágicos de la vida en el curso de la vida humana, entre los cuales el más valioso para la investigación es la memoria. La memoria es una parte importante de la actividad neuronal avanzada humana, y también es el registro y acumulación de diversos eventos ocurridos desde la evolución humana. Entonces, ¿existe una relación entre la expresión genética y la memoria? La respuesta es sí.

En primer lugar, la influencia de los genes sobre la memoria es obvia. Puede regular la expresión de una variedad de moléculas y proteínas relacionadas con la memoria mediante polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y otros métodos. Esto puede afectar la eficiencia de la comunicación entre las neuronas, afectando así las características cognitivas, conceptuales, emocionales y de otro tipo de una persona, lo que indica la calidad de la memoria.

En segundo lugar, la memoria también puede tener cierto impacto en la expresión genética. En el proceso de nuestro aprendizaje, memoria y pensamiento, no sólo intervienen los cambios en la actividad neuronal del cerebro sino también la regulación e intervención de muchos genes y moléculas. La regulación de estos genes y moléculas registrará huellas correspondientes a los sentimientos y experiencias que existen en nuestra memoria a largo plazo y, finalmente, se almacenarán en los genes.

Finalmente, existe una interdependencia entre una actitud positiva y la capacidad de memoria a largo plazo. Un estado de ánimo feliz puede ayudarnos a concentrarnos más durante el proceso de aprendizaje y pensamiento, ayudando así a mejorar la capacidad de memoria. La memoria deliberada a largo plazo también puede promover la formación de nuevas conexiones y estructuras neuronales en el cerebro, lo que también es muy útil para el aprendizaje y la memoria futuros.

Por tanto, podemos concluir que existe una correlación entre la expresión genética y la memoria. Podemos promover y mejorar nuestra capacidad de memoria mediante la memoria deliberada, el optimismo y el pensamiento positivo, que también pueden ayudarnos a lograr una mejor salud física y mental. Sólo así podremos servir mejor a la sociedad y al desarrollo humano. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche deserticola es un material medicinal tradicional chino que tiene muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de la carne picada proviene de los diversos ingredientes activos que contiene, incluidos ácidos, polisacáridos, flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro de varias maneras.

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Sin embargo, se desconocen en gran medida los genes corticales auditivos que apoyan el aprendizaje auditivo, la memoria y el comportamiento adquirido específico del sonido. Este informe es el primero en identificar cambios en todo el genoma en la expresión genética inducida por el aprendizaje dentro de la corteza auditiva que se cree que subyacen a la formación de la memoria auditiva. Los análisis bioinformáticos de los perfiles de enriquecimiento genético a partir de la secuenciación de ARN identificaron vías biológicas que incluyen sinapsis colinérgicas e interacciones con receptores neuroactivos.

Los hallazgos caracterizan los cambios clave que subyacen a los cambios en la función cortical que apoyan la formación de la memoria auditiva a largo plazo en el cerebro adulto. Las moléculas y mecanismos identificados son objetivos terapéuticos potenciales para facilitar cambios a largo plazo y específicos del sonido en la función auditiva en la edad adulta y ahora son excelentes para futuras investigaciones dirigidas a genes.

Manuscrito:

Un concepto bien aceptado en el campo del aprendizaje y la memoria es que los recuerdos se almacenan donde se procesan (Nadel & Hardt, 2011). Los eventos biológicos conocidos como consolidación de la memoria pueden estabilizar representaciones neuronales transitorias evocadas por una experiencia sensorial (Lechner, Squire y Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Los mecanismos fundamentales y conservados evolutivamente que inician la consolidación de la memoria son la transcripción y la traducción, definidas como la expresión activa de genes y sus productos proteicos posteriores, respectivamente (Alberini & Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).

Nuestra hipótesis es que el aprendizaje de la discriminación de sonidos induce la expresión genética de novo dentro de la corteza auditiva. Las representaciones muy específicas de señales sonoras pueden durar más que la fugacidad de la experiencia (segundos y minutos) al consolidarse en la memoria a largo plazo (de horas a días) que luego guía el comportamiento guiado por sonidos. Si bien se cree que los perfiles transcriptómicos regionales distintivos son responsables de la consolidación de la memoria (Katzman, et al., 2021), los eventos de transcripción inducidos por el aprendizaje que apoyan la formación de la memoria en el sistema auditivo central están muy subdescritos.

Por el contrario, la corteza auditiva ha sido excepcionalmente bien descrita en estudios sobre el aprendizaje auditivo y la memoria a nivel de cambios neurofisiológicos, particularmente en campos receptivos y mapas tonotópicos (Schreiner & Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011). Conectividad cortical y cortico-fuga (Souffi et al., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu et al., 2011; Xiong, Znamenskiy, & Zador, 2015), incluso en múltiples escalas de tiempo (Froemke & Martins , 2011; Froemke y Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David y Shamma, 2007; Tchernichovski y Margoliash, 2013). Además, los cambios neurofisiológicos están relacionados con el comportamiento, por ejemplo, para la acción dirigida por señales (Letzkus, Wolff y Lüthi, 2015), la atención (Fritz et al., 2007; Elhilali et al., 2007) y la memoria de señales sonoras (Bieszczad & Weinberger 2010; Grosso et al., 2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso, & Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

Décadas de evidencia sobre la plasticidad neurofisiológica inducida por el aprendizaje en la corteza auditiva han demostrado características conductuales compartidas de la memoria auditiva (Weinberger 2007a; 2007b), lo que la convierte en una de las principales regiones candidatas para la consolidación de la memoria auditiva. Al investigar bioinformáticamente la corteza auditiva, también aprovechamos una oportunidad imparcial para descubrir guardianes biológicos comunes o distintos de la neuroplasticidad que subyacen a la función auditiva adaptativa en todo el cerebro. Desde una perspectiva más amplia, el perfil transcriptómico regional puede conducir a una comprensión más completa de cómo la experiencia al servicio de la memoria modifica el sistema sensorial.

Los perfiles transcriptómicos inducidos por el aprendizaje identificados dentro de la corteza auditiva pueden validar, ampliar o conducir a nuevos modelos biológicos de procesos que apoyan o perjudican el procesamiento auditivo adaptativo. La consolidación de la memoria auditiva es probablemente producto de cambios dependientes de la experiencia en la expresión genética que afectan las funciones celulares dentro de la corteza auditiva, que a su vez promueven cambios duraderos en la capacidad de respuesta neurofisiológica evocada por el sonido que alteran los comportamientos inducidos por el sonido.

Para identificar transcripciones inducidas por el aprendizaje, se realizó un análisis de perfiles de expresión mediante secuenciación de ARN (RNAseq) en muestras de corteza auditiva anatómicamente definida (Bregma -3.10 mm, Interaural 6,90 mm; Paxinos & Watson, 2007 ) desde adultos con restricción de agua entrenados para presionar barra hasta tonos puros para recompensas de agua. Las respuestas a una frecuencia de tono puro objetivo (5,0 kHz; 65 dB SPL) dieron como resultado una recompensa, mientras que las respuestas a la frecuencia no objetivo (11,5 kHz; 65 dB SPL) no fueron recompensadas e iniciaron un período de tiempo muerto que extendió el tiempo hasta la siguiente prueba.

Esta tarea de discriminación de dos tonos (2TD) no es difícil desde el punto de vista perceptivo; las frecuencias acústicas están separadas por más de una octava y los roedores las distinguen fácilmente (Talwar y Gerstein, 1998). Más bien, el desafío conductual fue asociativo: el desempeño 2TD exige memoria para saber qué tono está asociado con la recompensa (frente a ninguna recompensa). Las ratas entrenadas (N=8) fueron sacrificadas después de tres sesiones diarias consecutivas de entrenamiento 2TD de 45-minutos y se compararon con un grupo de ratas sin sonido (N=4). Este es un momento temprano en el entrenamiento en el que los animales todavía están adquiriendo la tarea 2TD. La adquisición temprana de tareas tuvo como objetivo capturar eventos transcripcionales inducidos por el aprendizaje inicial que prepararon el escenario para aumentos posteriores en el rendimiento 2TD observado en el comportamiento durante semanas de entrenamiento.

Por ejemplo, el rendimiento promedio estuvo por encima del azar, pero solo 66 ± 7,81 % después de 3 días, en comparación con mayor o igual al 90 % después de un entrenamiento prolongado (Shang, Bylipudi y Bieszczad, 2019). Para aprovechar la oportunidad de identificar la expresión de genes relevantes para una memoria asociativa específica de sonido exitosa, aprovechamos un inhibidor de HDAC que apunta a la regulación epigenética de la expresión genética dependiente de la actividad en el aprendizaje y la formación de la memoria (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et al., 2017; Malvaez, et al., 2012). Es importante destacar que una década de trabajo ha demostrado que la inhibición de HDAC puede facilitar la plasticidad neurofisiológica inducida por el aprendizaje en las respuestas corticales auditivas evocadas por sonidos (en relación con el vehículo) y mejorar las conductas discriminativas auditivas (Bieszczad et al., 2015; Phan et al., 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) incluidos los inhumanos (Gervain, et al., 2013).

La mitad de los animales entrenados fueron tratados con el inhibidor de HDAC, RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A8803; inyección subcu.) , mientras que a la otra mitad se les entrenó de manera idéntica pero se les administró solución de vehículo (N=4; volumen equivalente, inyección subcutánea; Fig. 1a). No hubo diferencias en el rendimiento de 2TD entre los grupos en el momento de la recolección del cerebro (RGFP966: 61±5,0% vs. Vehículo: 71±7,0%; t(5,9166)=-1.21, p=0.272 ; prueba t de Welch). Los cerebros se recolectaron rápidamente y se congelaron instantáneamente en un momento consistente con la concentración máxima del inhibidor en la corteza auditiva, una hora después de la inyección posterior a la sesión del inhibidor de HDAC o del vehículo (Bieszczad et al., 2015).

Los hallazgos aquí son los primeros en identificar un perfil transcriptómico de aprendizaje asociativo dentro de la corteza auditiva. El aprendizaje en la tarea de discriminación de dos tonos indujo cambios en los niveles de transcripción de cientos de genes (en comparación con los que no conocen el sonido) (Fig. 1b). Un algoritmo de agrupamiento jerárquico mostró que los genes están regulados hacia arriba o hacia abajo de manera única, lo que revela una red compleja de eventos de expresión génica cortical inducidos por el aprendizaje auditivo (Fig. 2a).

Los análisis de enriquecimiento (iPathwayGuideTM; método de análisis de impacto) identificaron la sinapsis colinérgica (genes expresados ​​diferencialmente (DEG)/todos los genes (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrección) como la vía biológica principal (Tabla 1). . Este resultado es consistente con investigaciones desde la década de 1990 que destacan la suficiencia de la señalización colinérgica en la corteza auditiva para la plasticidad neurofisiológica y el comportamiento auditivo relacionado (Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 1998). Los niveles de transcripción inducidos por el aprendizaje bajo la inhibición de HDAC se amplificaron en la misma dirección (mediante aumentos o disminuciones adicionales en los niveles de transcripción de genes únicos) (Fig. 2b) o se atenuaron en comparación con el aprendizaje solo (Fig. 2c). Una de las principales vías biológicas en estas condiciones fue la interacción ligando neuroactivo-receptor (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; Tabla 1), que involucró efectores cruciales para la activación neuronal.

Otra vía principal fue la interacción del receptor de la matriz extracelular (receptor ECM) (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; Tabla 1). Los componentes de la ECM son fundamentales para la plasticidad cortical y la consolidación de la memoria (Happel, et al., 2014; Banerjee, et al., 2017; El-Tabbal, et al., 2021; Sonntag, et al., 2015). Estas vías ofrecen alternativas potenciales, quizás complementarias, a la señalización colinérgica que pueden facilitar cambios duraderos dependientes de la experiencia en la función auditiva (Ji, Gao y Suga, 2001; Luo y Yan, 2013; Metherate, 2011). Otros genes cuya expresión cambió con el aprendizaje auditivo pero no con la inhibición de HDAC probablemente estaban relacionados con condiciones de procedimiento de la tarea, en lugar de con la memoria asociativa específica de un sonido. Por ejemplo, se identificó la vía de señalización de la apelina (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), que es importante en el cerebro para la regulación homeostática de la ingesta de agua (Hu, et al., 2021). Una comparación directa de los niveles de transcripción entre los dos grupos de ratas entrenadas (aprendiendo con o sin inhibición de HDAC) mostró muy pocos genes expresados ​​diferencialmente (DEG) de forma única.

Un umbral utilizado apreciablemente para identificar los DEG más probables (p =0.05) encontró que solo Adamts13, U6, Rexo4 y Cabin1 se expresaron diferencialmente (Fig. 2d). Por lo tanto, el efecto principal de la inhibición de HDAC parece ser modular la expresión de genes inducidos por el aprendizaje auditivo en condiciones normales, en lugar de reclutar genes únicos para preservar la memoria específica de los sonidos. En conjunto, estos hallazgos muestran que se producen cambios transcriptómicos a gran escala en la corteza auditiva en las primeras etapas del entrenamiento, cuando los animales adultos aprenden a discriminar relaciones asociativas entre señales sonoras. Junto con informes neurofisiológicos y conductuales establecidos sobre la inhibición de HDAC para promover la función auditiva, estos hallazgos respaldan la táctica de utilizar un inhibidor de HDAC para distinguir genes cuya expresión determina el éxito de la formación de la memoria auditiva.

Se seleccionaron varios genes de interés (GOI) de los análisis de enriquecimiento en vías biológicas para validar la secuenciación de todo el genoma con un enfoque dirigido a genes. Se recolectaron muestras de cohortes separadas que replicaron los dos grupos de animales entrenados y tratados al mismo tiempo. punto de tiempo de entrenamiento (es decir, una hora después de la tercera sesión de entrenamiento 2TD) para su uso en el análisis de expresión génica mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). No hubo diferencias en el rendimiento de 2TD en cohortes replicadas (RGFP9661: 61±5,0% frente a RGFP9662: 67±6,0%; t(8,441)=-0.834, p {{20}}.4274; y Vehículo1:71±6.0% frente a Vehículo2: 74±3.0%; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; prueba t de Welch).

El primer GOI fue Egr1, un "gen temprano inmediato" bien estudiado y dependiente de la actividad que se sabe que alcanza su punto máximo en las primeras horas de aprendizaje y es fundamental para la formación de la memoria (Duclot y Kabbaj, 2017). Era un gen inducido por toplearning con una expresión aumentada confirmada que también se amplificó con inhibición de HDAC en una cohorte separada de animales en el estudio dirigido a genes (Fig. 3). Lo mismo ocurrió con Per2, un gen implicado en la regulación de los ritmos circadianos y las vías serotoninérgicas en el cerebro (Bae, et al., 2001; Albrecht, et al., 2001; Cuesta, et al., 2009; Reh, et al. , 2020). Per2 es parte de la familia del "gen reloj" que se ha relacionado con la modulación de HDAC en otras regiones del cerebro (Kwapis, et al., 2018) y también puede tener un papel en la función auditiva (Reh et al., 2020). Por el contrario, algunos GOI identificados en todo el genoma solo se confirmaron parcialmente.

Chrna7 codifica una subunidad del receptor nicotínico dinámico de acetilcolina (nAChR) que se encontró que estaba regulado negativamente con el aprendizaje auditivo, lo que coincide con la evidencia neurofisiológica (Takesian, et al., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). Por lo tanto, esperábamos que el estudio dirigido a genes confirmara la regulación negativa de Chrna7 en todos los animales entrenados con 2TD, pero la regulación negativa solo fue evidente en los animales tratados con vehículos que aprendieron 2TD sin inhibición de HDAC. Los GOI seleccionados adicionales eran de la familia de receptores nucleares huérfanos Nr4a, Nr4a1 y Nr4a2, que son genes tempranos inmediatos que se consideran necesarios para propagar los efectos posteriores del objetivo selectivo HDAC de RGFP966 en otras regiones del cerebro (McQuown et al., 2011; Kwapis, et al. ., 2019).

De acuerdo con informes anteriores sobre diferencias regionales dependientes de la tarea en la expresión del gen familiar Nr4a (McNulty, et al., 2012), Nr4a1, pero no Nr4a2, estaba regulado positivamente en la corteza auditiva después del aprendizaje auditivo. Otros DEG, Htr1a o Adamts13, no fueron confirmados mediante un estudio dirigido a genes, probablemente debido a diferencias en variantes de transcripción conocidas no detectadas por nuestras sondas dirigidas a genes diseñadas a medida, o debido a un error de tipo I, o a diferencias sutiles de comportamiento entre cohortes de animales entrenados que no fue detectado en las medidas de desempeño 2TD. También investigamos Lynx1, un gen con una larga historia de función para reabrir la plasticidad similar al "período crítico" en la corteza sensorial (Morishita et al., 2010), probablemente por su acción sobre la modulación colinérgica y serotoninérgica (Takesian, et al. , 2018). Sin embargo, de acuerdo con informes anteriores de todo el genoma que fallaron en su detección (Kalish, et al., 2020), no se detectó en nuestro conjunto de datos de RNAseq ni en un estudio dirigido a genes.

Aunque sigue siendo un desafío determinar si las discrepancias pueden explicarse por una variabilidad biológica o individual real entre animales, o debido a una variabilidad técnica con baja abundancia o transcripciones de expresión específicas de tipo celular, informamos resultados excepcionalmente consistentes para algunos GOI. Como la expresión inducida por el aprendizaje de Chrna7, Egr1 y Per2 es consistente entre los enfoques dirigidos a genes y en todo el genoma, y ​​entre diferentes cohortes de animales entrenados, es lógico que estos genes puedan ser de los actores más fundamentales para cambios duraderos en función auditiva y memoria y ahora son primordiales para futuras investigaciones.

Considerados en conjunto, los hallazgos revelan un panorama transcripcional dinámico en la corteza auditiva adulta que podría respaldar la función auditiva emergente en la neurofisiología y el comportamiento. Dada la creciente evidencia de controles epigenéticos sobre la función del sistema sensorial (cf, Shang & Bieszczad, 2022), es emocionante considerar cómo los mecanismos epigenéticos desempeñan un papel en el equilibrio de la estabilidad con la plasticidad dependiente de la experiencia de los circuitos corticales auditivos. Por ejemplo, el conjunto de datos actual de todo el genoma también identificó una reducción inducida por el aprendizaje en la expresión de la histona desacetilasa represiva, Hdac9, que estaba ausente con la inhibición de HDAC.

Es tentador comparar el efecto de la expresión reducida de HDAC9 con el efecto de inhibir farmacológicamente las HDAC para promover la transcripción inducida por el aprendizaje. Otra clase importante de reguladores epigenéticos altera el ADN en lugar de las histonas. Algunos ejemplos son Tet1 y Gadd45b, que afectan la metilación del ADN (Bayraktar & Kreutz, 2018) y se encontró que estaban regulados hacia abajo y hacia arriba con el aprendizaje, respectivamente, bajo la inhibición de HDAC. Además, apareció una clase de microARN como la principal vía biológica inducida por el aprendizaje con inhibición de HDAC (ver Tabla 1), que han ganado terreno en el campo como reguladores epigenéticos clave del control transcripcional neuronal (Saab y Mansuy, 2014). También son probables interacciones moleculares de orden superior entre los actores epigenéticos y los productos proteicos de los genes expresados. Por ejemplo, el Egr1 regulado positivamente identificado puede reclutar Tet1 para eliminar marcas de metilación represivas y activar genes posteriores (Sun, et al., 2019). Se necesitarán más estudios moleculares para analizar la importancia de las interacciones entre los reguladores epigenéticos del sistema auditivo durante el aprendizaje. Además, este informe presenta una oportunidad inmediata para establecer vínculos entre genes corticales auditivos seleccionados y sus efectores posteriores.

Cerrar la brecha entre estos genes y moléculas y su influencia en los eventos neurofisiológicos evocados por el sonido es esencial para comprender cómo el sistema auditivo adulto se adapta con la experiencia para alterar el comportamiento. De hecho, la traducción de transcripciones de novo es necesaria para cambios a largo plazo en la función conductual porque producen cambios duraderos en la función celular. Por ejemplo, los efectores objetivo clave de los procesos transcripcionales inducidos por el aprendizaje pueden alterar la disponibilidad de canales o receptores (Metherate, Intskirveli y Kawai, 2012; Brown y Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao y Tzounopoulos, 2023) dentro de los circuitos que determinan el sonido. Umbral evocado, capacidad de respuesta y arquitectura del campo receptivo en el sistema auditivo. Es razonable suponer que diferentes tareas auditivas reclutarían redes genéticas únicas para vías biológicas relevantes para funciones celulares particulares que apoyarían el aprendizaje de la característica de sonido o estructura de tarea relevante para la tarea.

En general, este informe sirve como punto de partida para hacer que los conjuntos de datos de RNAseq de la corteza auditiva, adulta y de aprendizaje estén disponibles (consulte el Repositorio de datos). Ahora es bienvenido un esfuerzo por reducir la brecha de conocimiento exacerbada por la grave falta de estudios que se centren en los procesos genéticos moleculares en la corteza auditiva adulta. Alentamos el estudio más allá de las limitaciones espacio-temporales de la secuenciación masiva de ARN, cuya sensibilidad también está limitada técnicamente por la profundidad de lectura (Li & Wang, 2021), especialmente porque las tecnologías ómicas modernas están evolucionando y mejorando rápidamente.

Si bien la investigación en la corteza auditiva ha logrado algunos avances iniciales en genética molecular que han identificado cascadas moleculares esenciales (Schicknick, et al., 2008), perfiles IEG permisivos (Mello, Velho y Pinaud, 2006; de Hoz, et al., 2018 ; Peter, et al., 2011) e incluso la cromatindinámica (Peter, et al., 2021), existe un precedente en la periferia auditiva donde la transcripcióndinámica se estudia maravillosamente (Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et al., 2020; Ebeid, et al., 2017). Las herramientas moleculares existentes, como la secuenciación de ARN unicelular (RNA-Seq) y la hibridación fluorescente in situ de moléculas pequeñas (smFISH), serán útiles para proporcionar información sobre la variación entre células dependiente de la experiencia y las interacciones moleculares dentro de las células y circuitos corticales auditivos. A diferencia de RNAseq en masa, estos métodos honran la profunda diversidad celular y la organización de orden superior en la corteza auditiva, como su microcircuito específico de capa y su topografía lemniscal.
Los enfoques inteligentes para etiquetar y secuenciar transcripciones de células corticales auditivas recientemente activas (Cho, Huang y Gray, 2016) pueden aumentar la sensibilidad lo suficiente como para obtener de manera sólida los conjuntos de genes funcionalmente más relevantes de los tipos de células y poblaciones más funcionalmente relevantes. Se podrían utilizar enfoques similares también subcorticalmente para capturar y contrastar perfiles transcriptómicos regionales dependientes de la actividad en la corteza que honran la increíble integración de la función cortical con la subcortical del sistema auditivo bajo diferentes condiciones de escucha o demandas de comportamiento. Caracterizar completamente las distinciones celulares y regionales en los mecanismos genéticos y moleculares que subyacen al aprendizaje auditivo en el cerebro adulto es fundamental para desarrollar terapias de precisión selectivas de sitio y dirigidas a moléculas que permitan cambios funcionales sólidos y persistentes para respaldar capacidades auditivas y auditivas específicas a lo largo de la vida.

Métodos

Sujetos: Se utilizaron un total de 24 ratas Sprague-Dawley macho adultas (250 – 300 g al llegar; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) en experimentos moleculares y de comportamiento. Todos los animales se alojaron individualmente en una sala de colonia con temperatura controlada (24 ˚C) en un ciclo de luz/oscuridad de 12- horas. Los sujetos tuvieron acceso ad libitum a comida y agua antes del entrenamiento conductual. Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Rutgers, la Universidad Estatal de Nueva Jersey (Protocolo No.:999900026 (KMB)).

Aparato conductual y estímulos sonoros: todas las sesiones conductuales se llevaron a cabo en dos cámaras de acondicionamiento instrumental idénticas (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) dentro de una caja con atenuación de sonido. Las sesiones de entrenamiento diarias se equilibraron para garantizar una exposición igual a ambas cámaras. Cada cámara (12" W x 10" D x 12" H; piso de malla de alambre estaba equipada con una palanca de respuesta (H21-03R), luz de la casa (H11-01R), un altavoz (H{ {8}}R) y un sistema de suministro de agua (H14-05R). Durante las fases de entrenamiento, los animales podían presionar la palanca de respuesta ("barpress"), lo que activaba la presentación de un vaso de agua (~0,02 cc). en el puerto de recompensa (1,25"W x 1,625"H). Se utilizó un interruptor manual (H21-01) durante la sesión inicial para dar forma a la respuesta del animal al presionar la barra para activar presentaciones de la taza de agua que permitieron el acceso al recompensa de agua Las respuestas de comportamiento se registraron utilizando el software Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) para el análisis fuera de línea.

Todos los estímulos auditivos se generaron utilizando Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) y el software RPvdsEx, y se presentaron a través del altavoz montado en la pared de la cámara operante. El ruido blanco (durante el entrenamiento de procedimientos; Fig. 1a) se presentó durante 7 o 9 s de duración (75 dB SPL). Los tonos puros (durante el entrenamiento de discriminación de dos tonos; Fig. 1a) siempre se presentaron durante 8 s (70 dB SPL). Los niveles de sonido se calibraron diariamente utilizando un sonómetro digital (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Entrenamiento conductual e inhibición farmacológica de HDAC3: Después de un día de aclimatación al vivero, las ratas fueron manipuladas diariamente durante un mínimo de 3 días. Antes de comenzar el entrenamiento conductual, las ratas fueron sometidas a un programa de agua restringida hasta que alcanzaron el 85% del peso no restringido de los animales de control de la misma edad. Luego, a las ratas con restricción de agua se les dio forma dentro de cámaras atenuadas por sonido para presionarlas y obtener recompensas de agua (Fig. 1a). La configuración del press de barra y el posterior entrenamiento sonoro se realizaron como se describió anteriormente (Shang, Bylipudi y Bieszczad, 2019). Brevemente, a todos los animales se les dio forma para hacer press de barra durante 5 días y luego se los entrenó en una tarea de procedimiento para aprender a presionar con barra con sonido, lo que en esta fase fue un estímulo de ruido gaussiano de banda ancha (1-12. Ruido blanco filtrado de paso de banda de 5 kHz; 75 dB SPL), para obtener una recompensa de agua. Todos los animales aprendieron con éxito a asociar este sonido con una recompensa antes de continuar con la siguiente fase del entrenamiento. El entrenamiento de procedimientos mostró una variabilidad individual en cuanto a la rapidez con la que los animales podían aprender la tarea hasta alcanzar altos niveles de rendimiento. No obstante, todos los animales pudieron alcanzar un nivel de rendimiento mayor o igual al 90% durante dos días consecutivos (media=92.85%, sem =0.01%) después de un promedio de 12,67 días ( SD=2.85 días). El rendimiento se calculó utilizando el 100%.

La siguiente fase del entrenamiento fue la tarea de discriminación de dos tonos (2TD) (Fig. 1a), en la que se entrenó a ratas para discriminar entre dos frecuencias de sonido espectralmente distintas. Pulsar la barra en el tono S+ (5,0 kHz; 70 dB SPL) daría como resultado la presentación de una recompensa de agua, mientras que presionar la barra en el tono Stone (11,5 kHz; 70 dB SPL) daría como resultado una señal de error (casa intermitente). luz) y un "time-out" (6 s adicionales de espera hasta el inicio de la siguiente prueba). Los ensayos S+ y S-S fueron aleatorizados y duraron 8 s. Los intervalos entre pruebas (ITI) fueron en promedio de 15 s (rango: 5-25 s, aleatorizado). Las pulsaciones de barra durante un ITI silencioso fueron intrascendentes (sin tiempo de espera, sin señal de error ni recompensa de agua). Las sesiones diarias duraron 45 minutos. Todos los animales realizaron la tarea 2TD durante un total de tres días consecutivos. Un observador entrenado emparejó a las ratas de modo que a los animales con tasas similares de adquisición de la tarea de procedimiento se les asignaron diferentes condiciones de tratamiento en la fase 2TD. Las parejas con rendimiento similar recibieron inyecciones sistémicas del inhibidor farmacológico HDAC3 de clase I RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg; sc; N=12) o solución de vehículo (N=9) inmediatamente después de cada Sesión 2TD. El rendimiento de la tarea 2TD se calculó como se describió anteriormente: 100% (Shang, Bylipudi y Bieszczad, 20).

).Recolección de tejido y aislamiento de ARN: Una hora después de que los animales recibieron su tercera y última inyección de RGFP966 después de la tercera sesión de 2TD, los cerebros se diseccionaron rápidamente y se congelaron instantáneamente en un vaso de precipitados de 2-metilbutano colocado sobre hielo seco. Los cerebros congelados instantáneamente se almacenaron a -80˚ C hasta su procesamiento futuro. Para preparar los cerebros para la crioseccion, los cerebros se encerraron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y se almacenaron a -20˚ C durante 12-24 horas para garantizar que el tejido cerebral alcanzara los -20˚ C para el corte. A continuación, los cerebros encerrados en OCT se cortarían horizontalmente en un criostato (Leica CM 3050S) con un espesor de 250 µm. Utilizando un micropunzón de tejido redondo de 1 mm, se tomaron muestras de 2 mm3 de tejido cortical auditivo de cada hemisferio (combinados en una muestra para un total de 4 mm3 por región del cerebro) para la extracción de ARN. La localización de la corteza auditiva se identificó utilizando The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (6.ª edición) de Paxinos y Watson como referencia (aproximadamente A/P=-3.6 a -5.8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4.2 a -5.8 mm; y utilizando el hipocampo como punto de referencia

El ARN total de cada muestra se aisló utilizando el mini kit de ARN PureLinkTM (ThermoFisher) siguiendo el protocolo del fabricante. Luego, las muestras de ARN se purificaron con el kit RNA Clean andConcentratorTM -25 (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), las bibliotecas de secuenciación se generaron utilizando el kit de preparación de biblioteca de ARNm trenzado Illumina TruSeq® de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante. Se agruparon las bibliotecas y se realizó la secuenciación en un Illumina NovaSeq 6000 ejecutando química SBS de extremos emparejados de 100 pb. Las lecturas se procesaron con el proceso informático de código abierto 'bcbio-nextgen.py' desarrollado principalmente en Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4) que se ejecuta en Argon HPCresource en la Universidad de Iowa. Este proceso incluye enfoques de "mejores prácticas" para el control de la calidad de la lectura, la alineación de la lectura y la cuantificación. La canalización 'bcbio-nextgen.py' se ejecutó en modo "RNA-seq" con la clave 'rn6' como la compilación del genoma seleccionada (haciendo referencia interna al ensamblaje Ensembl y la compilación genética 'Rnor_6.0'). La tubería alineó lecturas en el genoma Rnor_6.0 usando el alineador hisat2 ultrarrápido con reconocimiento de empalme (2.2.1) y simultáneamente lecturas cuantificadas en el transcriptoma usando el alineador 'salmón' (1.4.0). Se utilizó Qualimap (2.2.2), una herramienta computacional que examina los archivos de alineación BAM hisat2, para examinar los datos leídos para el control de calidad. Las puntuaciones de calidad de las secuencias pasaron las comprobaciones básicas y las tasas de duplicación de secuencias estuvieron dentro de los parámetros aceptables. Todas las muestras pasaron el control de calidad para la alineación de lectura con las regiones exónicas. Las cuantificaciones de transcripciones derivadas de salmón (TPM o "transcripciones por millón") se importaron y se resumieron en recuentos estimados a nivel genético utilizando tximport (1.12.3) en Rstudio, como se describe en el mejor. practica la viñeta DESeq2 (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Los genes con menos de 5 recuentos estimados en todas las muestras se filtraron previamente a partir del análisis posterior, según el procedimiento recomendado. El análisis de expresión genética diferencial se realizó con DESeq2 (v.1.24.0) en recuentos estimados a nivel de genes. Un FDR del 5% y X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Validación de datos de RNA-seq con qRT-PCR: los datos de RNA-seq se validaron mediante qRT-PCR en ARNm extraído de distintas cohortes de ratas. Se eligieron cinco transcripciones de una lista de nuevos DEG que se encontraron enriquecidos en cada región al inicio. Tres de los genes se basaron en hipótesis basadas en literatura conductual y fisiológica cortical auditiva, mientras que otros tres genes fueron genes novedosos identificados a partir de análisis de nivel genético y DEG en una comparación entre grupos de fármacos y vehículos. Todas las secuencias de cebadores se seleccionaron de literatura previa sobre tejido cerebral en ratas (secuencias proporcionadas en la siguiente tabla) o se diseñaron utilizando NCBI Primer Blast y se validaron para la especificidad del objetivo mediante la evaluación de las curvas de fusión y la secuenciación del producto del amplicón de PCR. Los análisis qRT-PCR se realizaron en un QuantStudio 3 (Applied Biosystems) con SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Para cada muestra, se amplificaron 500 ng de ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc iScriptTM (Bio-Rad).

Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer al Dr. Andrea Shang, Sean Tsaur y Sooraz Bylipudi por su ayuda en los procedimientos y análisis conductuales; a la Dra. Mimi L. Phan por su ayuda con los protocolos de extracción de ARN y recolección de muestras; Dr. Troy A. Roepke, Ali Yasrebi y ChristopherO'Brien por su ayuda con el análisis de purificación de muestras de ARN; y Alisa Ray por asistencia técnica. Nos gustaría agradecer a todo el personal actual y anterior de CLEF Lab por su ayuda y apoyo.

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional de Sordera y Trastornos de la Comunicación [R01-DC014753 a KMB]; la Escuela de Artes y Ciencias de la Universidad de Rutgers; la Fundación Aresty de la Universidad de Rutgers, con pequeñas subvenciones para investigaciones de pregrado; y el programa Proyecto SUPER en la Universidad de Rutgers con pequeñas subvenciones para investigación de pregrado.

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Reference:1950477648n@gmail.com