Alta concentración de iopromida induce apoptosis y autofagia en células renales embrionarias humanas mediante la activación de una vía de estrés celular dependiente de ROS
Mar 24, 2022
Resumen.El uso de medios de contraste yodados puede alterarfunción renal. Sin embargo, ningún informe ha abordado la nefrotoxicidad de altas dosis de medios de contraste yodados en pacientes normales.riñóncélulas y sus mecanismos moleculares asociados. Materiales y métodos: la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo MTT. La muerte celular se evaluó examinando los cambios morfológicos y el ensayo TUNEL. La autofagia se detectó mediante tinción con naranja de acridina y tinción con lisotrazador. Se examinaron la producción de especies reactivas de oxígeno y la actividad de la quinasa AKT. Resultados: la loperamida indujo la muerte celular y desencadenó la apoptosis y la autofagia en las células HEK 293. La viabilidad celular se restableció significativamente en presencia de un inhibidor de pan-caspasa o un eliminador de ROS, N-acetil-L-cisteína. Se encontró que la actividad de la quinasa AKT se redujo en las células HEK 293 tratadas con iopromida. Conclusión: Las altas concentraciones de iopromida inducen daño celular, apoptosis y autofagia a través de la regulación negativa de las vías de estrés celular activadas por AKT y ROS en células HEK 293.
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Roentgen descubrió los rayos X a finales del siglo XIX, a lo que siguió la introducción de los medios de contraste que contienen yodo (ICCM) a principios del siglo XX, lo que abrió un nuevo campo de investigación en la ciencia médica ({{ 4}}). Los agentes de contraste que contienen yodo se administran en el cuerpo humano a través de las venas y se utilizan para exámenes de diagnóstico radiológico del sistema urinario, el corazón, el sistema cerebroespinal y los vasos sanguíneos en diversas partes del cuerpo. ICCM mejora el contraste entre el tejido normal y las lesiones, proporciona información sobre las características morfológicas de las lesiones y mejora la sensibilidad del examen y la precisión del diagnóstico. El efecto de mejora de la imagen del agente de contraste hace que muchos tejidos y lesiones celulares sean visibles (5-8). El principal mecanismo farmacológico es que las moléculas de yodo en el agente de contraste que contiene yodo absorben la energía de los rayos X, lo que hace que las moléculas de yodo ejerzan un efecto especial de protección contra los rayos X. Por lo tanto, aparece una imagen blanca de alta densidad en la radiografía.la película, lo que proporciona un realce del tejido que contiene sangre en las imágenes (3,5,9,10).
Los medios de contraste que contienen yodo se clasifican según su estructura química, osmolalidad y lugar de inyección. Según la estructura química, los agentes de contraste que contienen yodo se dividen en cuatro tipos: estructuras de monómero iónico, estructuras de dímero iónico, estructuras de monómero no iónico y estructuras de dímero no iónico. Con base en la osmolalidad, los agentes de contraste que contienen yodo se dividen en tres tipos: medios de contraste de alta osmolaridad (HOCM), medios de contraste de baja osmolaridad (LOCM) y medios de contraste iso-osmolares (IOCM). Según el sitio de inyección, los agentes de contraste que contienen yodo se dividen en dos tipos: medios de contraste intravasculares y subaracnoideos(1). Generalmente, los agentes de contraste que contienen yodo no iónico muestran una osmolalidad más baja que los agentes de contraste que contienen yodo iónico. Además, los agentes de contraste que contienen yodo no iónico son menos tóxicos y ejercen efectos alérgicos (11, 12). La inyección de ICCM en el espacio subaracnoideo debe presentar baja neurotoxicidad y baja osmolalidad(13,14).
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Las reacciones adversas a medicamentos (RAM) de los agentes de contraste que contienen yodo incluyen reacciones alérgicas y químicas. Los principales síntomas de las reacciones alérgicas son fiebre, náuseas, vómitos, mareos, erupción cutánea, picazón, estornudos y congestión nasal(4,11,12). Pápulas, urticaria, escalofríos, opresión en el pecho, shock, paro cardiopulmonar y muerte pueden ocurrir en caso de reacciones alérgicas graves(8, 11,12). Las reacciones adversas y las tasas de mortalidad de los ICCM no iónicos intravasculares son aproximadamente de 2 a 7 por mil y de 2 a 9 por millón, respectivamente (15-23). Las reacciones químicas adversas conducen principalmente a la nefropatía inducida por contraste (NIC). CIN es el deterioro defunción renaly empeoramiento defunción renaldespués de la administración de agentes de contraste que contengan yodo. El mecanismo patológico puede incluir vasoconstricción,renalcambios en el flujo sanguíneo o toxicidad directa pararenalcélulas tubulares (15-27). En 2006, Lameire et al. señaló que la NIC ejerce efectos tóxicos directos sobrerenalcélulas tubulares o hipoxia en elrenalmédula (4,28). Las principales causas derenalhipoxia medular incluyen disminución del flujo sanguíneo, disminución del transporte de oxígeno y aumento del consumo de oxígeno. Estos factores pueden estar relacionados con un aumento de la presión osmótica, la viscosidad y la inducción de prostaglandina E2 por ICCM(4,28).Estudios previos han demostrado que los medios de contraste bajos o iso-osmolares en concentraciones superiores a 75 mg I/ml (seis veces más que la concentración de dosis normal) podrían inhibir la proliferación celular e inducir la muerte celular enriñónceldas (KRK52-E, LLC-PK1, HKCS,HK-2). Los tipos de muerte celular incluyen apoptosis y autofagia (29-35). Sin embargo, los mecanismos detallados siguen sin estar claros. En el presente estudio, investigamos los mecanismos moleculares, incluido el daño celular, la apoptosis y la autofagia, inducidos por la iopromida, que es una LOCM, en células HEK 293.
Palabras clave:iopromida; células de riñón embrionario humano 293; apoptosis; especies de oxígeno reactivas; riñón; renal
Materiales y métodos
Línea celular y cultivo. El embrionario humanoriñónLa línea celular (HEK) 293 se adquirió del Centro de Investigación y Recolección de Biorecursos (Hsinchu, Taiwán, ROC). Las células se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento a 37 °C en una incubadora con CO al 5 por ciento. Reactivos y productos químicos. La iopromida (Ultravist) se obtuvo del Dr. Yuh-Feng Tsai del Departamento de Radiología de Diagnóstico del Hospital Conmemorativo Shin Kong Wu Ho Su. Excepto donde se indique, los reactivos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).Morfología y viabilidad celular. Se cultivaron células HEK 293 (0.8×104 células/pocillo) en placas de 96 pocillos durante 24 h y se trataron con diferentes concentraciones (0, 25, 50, 100 y 200 mg/ml) de iopromida durante 24 o 48 h. Se examinó la morfología celular para evaluar la apoptosis o la autofagia utilizando un microscopio óptico con un aumento de 200x (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania). La viabilidad celular se evaluó utilizando el ensayo MTT (bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo) como se describió anteriormente (36). Brevemente, las células se mezclaron con MTT durante 4 h. La absorbancia a 570 nm se midió utilizando un lector de microplacas multimodo SpectraMax iD3 (Molecular Devices Ltd., San Jose, CA, EE. UU.). El porcentaje de viabilidad celular se calculó ajustando el grupo de control no tratado al 100 por ciento.
Ensayo de marcado de extremo de muesca de dUTP de desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL). Para detectar roturas de ADN, se utilizó un kit de detección de muerte celular in situ (Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sembraron células HEK 293 durante 24 h seguido de tratamiento con 50 mg/ml de iopromida durante otras 48 h. Las células se fijaron y tiñeron con sondas de fluoresceína. Las células positivas para TUNEL se analizaron usando un citómetro de imagen avanzado NucleoCounter NC-3000 (ChemoMetee A/S, Allerod, Dinamarca). La intensidad de fluorescencia relativa se calculó utilizando la relación entre la media de la intensidad de fluorescencia de la muestra y la de las células de control no tratadas. La intensidad de fluorescencia relativa se expresa como cambio de veces (37).Ensayos de actividad de caspasa 3/7 y caspasa 9. Para determinar las alteraciones en la actividad enzimática de la caspasa, se utilizaron el kit de ensayo FAM FLICA Caspases-3/7 y el kit de ensayo FAM FLICAw Caspases-9 (MyBioSource, San Diego, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sembraron células HEK 293 en 6-placas de pocillos a una densidad de 1 x 106 células/pocillo durante 24 h y se trataron con iopromida (50 mg/l/ml o 100 mg/l/ml) durante otras 48 h. Las muestras se evaluaron como se describe anteriormente (36, 37) y se analizaron con el citómetro de imagen avanzado NucleoCounter NC-3000r (ChemoMetec A/S).
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Tinción con naranja de acridina (AO). Se usó AO para examinar si se formaron orgánulos vesiculares ácidos (AVO) en iopromidacélulas tratadas. Brevemente, se sembraron células HEK 293 durante 24 h seguidas de tratamiento con iopromida (50 mg/ml) durante otras 48 h. Las muestras se prepararon como se describió anteriormente (37,38). La intensidad de la fluorescencia roja se midió y analizó usando un citómetro de imagen avanzado NucleoCounter* NC-3000 (ChemoMetec A/S). El color rojo brillante fluorescente representa la formación de vacuolas autofágicas ácidas. La intensidad de fluorescencia relativa se calculó usando la proporción de la media promedio de la intensidad de fluorescencia de la muestra con respecto a las células de control no tratadas. La intensidad de fluorescencia relativa se expresa como cambio de veces.
Tinción con rojo LysoTracker. Las células HEK 293 se trataron con 50 mgl/ml de iopromida durante 48 hy las muestras se prepararon como se describió anteriormente (37, 38). La intensidad de la fluorescencia se midió y analizó usando un citómetro de imagen avanzado NucleoCounter NC-3000 (ChemoMetec A/S). El rojo brillante fluorescente representa los orgánulos ácidos en las células. La intensidad de fluorescencia relativa se calculó utilizando la relación entre la media de la intensidad de fluorescencia de la muestra y la de las células de control no tratadas. La intensidad de fluorescencia relativa se expresa como cambio de veces.
Detección de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Para detectar el impacto de la iopromida en la producción de ROS, las células HEK 293 se trataron con 50 mgl/ml de iopromida durante 24 h. Las muestras se prepararon como se describió anteriormente (37.38). Brevemente, se agregaron 50 μM de CM-H5DCFDA (indicador general de estrés oxidativo) (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y las células se incubaron durante 30 minutos a 37 grados C. La intensidad de fluorescencia de las células se midió usando un NucleoCounter NC{{10 }}n citómetro de imagen avanzado (ChemoMetec A/S).
Ensayo de actividad de quinasa AKT in vitro. Para determinar las alteraciones en la actividad de la quinasa AKT, se utilizó un kit de ensayo de quinasa AKT (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sembraron células HEK 293 (2x106 células/placa) en placas de 10 cm durante 24 h y se trataron con 50 o 100 mg/ml de iopromida durante 24 h. Las células se recolectaron y manipularon como se describió anteriormente (39). Brevemente, se inmunoprecipitaron 200 mg de proteína de cada muestra con 2 mg de anticuerpo anti-AKT durante la noche. Los inmunoprecipitados de AKT se mezclaron con glucógeno sintasa quinasa-3/sustrato durante 30 minutos a 30 grados. Las muestras se aplicaron a SDS-PAGE al 10 por ciento y se determinó la intensidad relativa de fosfo-GSK-3a/ (Ser219) en comparación con el control no tratado. Análisis estadístico. Los datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes y se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Las diferencias estadísticas se evaluaron utilizando la prueba t de Student en comparación con el grupo de control no tratado. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p inferior a 0,05 (37).
Resultados
proporcionar una proliferación de células HEK 293 significativamente inhibida. (Figura 1B). La viabilidad celular se midió usando el ensayo MTT. Las concentraciones inhibitorias semimáximas (ICso) fueron 187±3,45 mgl/ml y 53,10±1,87 mgl/ml a las 24 y 48 h de tratamiento con iopromida, respectivamente (Figura 1). Nuestros resultados revelaron que la iopromida inhibe la proliferación celular. Además, se observaron alteraciones morfológicas en las células HEK 293 cuando las células se trataron con iopromida a concentraciones superiores a 50 mgl/ml durante 48 h (Figura 2A). Algunas células se encogieron y adquirieron una forma redonda, lo que indica que las células podrían haber sufrido apoptosis. Mientras tanto, algunas células mostraron vacuolas, lo que implicaba que las células pueden haber sufrido autofagia (Figura 2B).
promesa induce la muerte celular. Para investigar si la iopromida inducía la muerte celular, detectamos roturas de ADN en células HEK 293 tratadas con iopromida mediante el ensayo TUNEL. La intensidad de fluorescencia relativa de TUNEL aumentó en las células HEK 293 tratadas con iopromida, lo que sugiere la presencia de una gran cantidad de células apoptóticas (Figura 3A y B). Las caspasas son mediadores cruciales de la apoptosis. Durante la apoptosis, las caspasas se activan e inician una cascada de actividades catalíticas. Las actividades enzimáticas de caspasa se determinaron en células HEK 293 tratadas con 50 o 100 mgl/ml de iopromida durante 48 h usando los kits de ensayo de caspasa. Las actividades enzimáticas de caspasa-9 y caspasa-3/ fueron elevadas (Figura 4A y B), lo que indica que la iopromida indujo la muerte celular. Además, el inhibidor de la pancaspasa (Z-VAD-FMK) bloqueó la muerte de las células HEK 293 tratadas con iopromida (Figura 5). Estos datos revelaron que la iopromida induce la apoptosis.
la lopromida desencadena la autofagia para proteger a las células de la apoptosis. La autofagia actúa como una "espada de doble filo" y destruye los orgánulos dañados o envejecidos en respuesta a factores estresantes externos, incluido el estrés oxidativo o la acumulación de agregados de proteínas. Recientemente, también se ha demostrado que la autofagia está involucrada en la muerte celular inducida por estrés. Para abordar el papel de la autofagia en la muerte de células HEK 293 inducida por iopromida, examinamos la formación de vesículas autofágicas utilizando ensayos de tinción AO y LysoTracker Red. Se observaron vacuolas autofágicas en células HEK 293 tratadas con 50 mgl/ml de iopromida (Figura 6A). La iopromida (50 mgl/ml) aumentó la intensidad de fluorescencia de los orgánulos vesiculares ácidos (AVO) y disminuyó
Intensidad de fluorescencia AO en células HEK 293 (Figura 6B y C). Además, LysoTracker Red se utilizó para identificar compartimentos subcelulares ácidos en células vivas. El número de lisosomas ácidos y la intensidad de la fluorescencia aumentaron en las células tratadas con iopromida (Figura 7). Los datos indicaron que se produjo autofagia en las células tratadas con iopromida.
Para aclarar la relación entre la autofagia y la apoptosis, las células HEK 293 se trataron previamente con los inhibidores de autofagia 3-metiladenina (3-MA) o bafilomicina A1 (Baf). Posteriormente, las células se trataron con iopromida (50 mg/ml) durante otras 48 h. La viabilidad celular se evaluó utilizando el ensayo MTT. La viabilidad celular disminuyó aún más al 30 % con el tratamiento con iopromida y 3-Ma frente al 53 % en el grupo de tratamiento con iopromida sola (Figura 8A). Mientras tanto, la viabilidad celular disminuyó aún más al 18 % con el tratamiento con iopromida y Baf frente al 53 % en el grupo de tratamiento con iopromida sola (Figura 8B). Estos resultados sugirieron que la apoptosis de HEK 293 inducida por iopromida está mediada a través de la inducción de autofagia.
la loperamida provocó la producción de ROS y suprimió la vía de señalización de AKT. Un estudio anterior demostró que la producción de ROS fue inducida por medios de contraste yodados (40). De hecho, el tratamiento de células HEK 293 con 50 mg/ml de iopromida dio como resultado un aumento del 165 por ciento en la producción de ROS (Figura 9A y B). La N-acetil-L-cisteína (NAC), un eliminador de ROS, bloqueó la producción de ROS y restableció el crecimiento celular (Figura 9C). La producción de ROS está relacionada con el estrés oxidativo, lo que conduce a la inactivación de la vía de señalización de AKTe inducción de apoptosis(37). Para examinar si la actividad de la quinasa AKT se suprime en células HEK 293 tratadas con iopromida (50 mgl/ml), medimos la actividad de la quinasa AKT. Se encontró que la actividad de la quinasa de AKT estaba reducida en las células tratadas con iopromida, lo que implicaba que la señalización de AKT estaba bloqueada (Figura 10A).
Discusión
La aplicación intravascular de medios de contraste de baja osmolaridad (LOCM) o medios de contraste iso-osmolares (IOCM) causa nefropatía grave ylesión renal(2,41,42). También se sabe que la LOCM induce reacciones alérgicas. La frecuencia de reacciones adversas a medicamentos (ADR), reacción alérgica severa de letalidad a LOCM es 0.2-0.7 por ciento, 1 a 4/100,000 y 2-9 /1000,000, respectivamente(43). En nuestra revisión anterior, mostramos que el IOCM induce nefropatía y lesión renal mediante el aumento del estrés oxidativo, la intensificación de la vasoconstricción renal y la inducción del daño de las células tubulares (43). La isquemia renal en la médula, la producción de ROS, la reducción de la producción de óxido nítrico y la inducción de lesión del epitelio tubular y del endotelio vascular son factores de riesgo de lesión en células y tejidos(44,45). En el presente estudio, investigamos los efectos citotóxicos de la iopromida sobre la apoptosis y la autofagia en células HEK 293 normales. Nuestros resultados demostraron que la iopromida aumenta significativamente la apoptosis y la autofagia en las células HEK 293 a través de la inducción de una vía dependiente de ROS.
Cuando una célula recibe estímulos extracelulares dañinos, se induce la apoptosis o autofagia como una respuesta activa rápida a la lesión. Muchos estudios han sugerido que los medios de contraste yodados (ICM) ejercen efectos citotóxicos yrenalmuerte de células epiteliales tubulares por autofagia y/o apoptosis (46-49). Peer et al. demostraron que la iopromida, el ioxaglato y el ioxatalamato inducen la apoptosis enrenalcélulas mesangiales, tubulares, epiteliales, endoteliales y hepáticas(50). Tan et al. demostraron que en las células NRK-52E, la viabilidad celular disminuyó hasta un 70 por ciento con el tratamiento con 150 mgI/ml de iopromida en comparación con el grupo de control(51). Luis et al. demostraron que el tratamiento con 120 mgl/ml de iopromida durante 2 h indujo la fragmentación del ADN en células tubulares renales proximales humanas (HK-2) (52). Nuestros resultados demostraron que la iopromida redujo la viabilidad de las células HEK 293 de forma dependiente del tiempo y la concentración. manera (Figura 1). La iopromida indujo alteraciones morfológicas, fragmentación del ADN, apoptosis y autofagia en células HEK 293 (Figura 2). La iopromida indujo actividades de caspasa-3/-7 y caspasa-9 a concentraciones de 50 y 100 mgI/ml en células HEK 293 (Figura 4A y B). Además, los resultados de viabilidad celular revelaron que la citotoxicidad inducida por iopromida en células HEK 293 se inhibió significativamente mediante la adición de un inhibidor de pancaspasa (Figura 5). Estos resultados indicaron que la iopromida induce daño en el ADN y actividades de caspasa 9 y caspasa 3/-7 mediadas por muerte celular apoptótica.
Recientemente, Lei Rong et.al. sugirieron que la autofagia juega un papel protector en las lesiones inducidas por iohexol y iodixanol en humanos.renalcélulas HK-2 epiteliales tubulares (47). Sin embargo, no quedó claro si la autofagia está asociada con la lesión de las células HEK 293 normales inducida por iopromida. Para examinar el efecto de la iopromida en la autofagia, utilizamos el ensayo de tinción AO. AO es una sonda fluorescente verde lisosomotrópica que se protona y queda atrapada dentro de orgánulos vesiculares ácidos (AVO). La autofagia se caracteriza por un aumento en la formación de AVO. Por lo tanto, los AVO se pueden cuantificar mediante imágenes o citometría de flujo después de teñir las células con AO(41,53-55). Como se muestra en las Figuras 6A y B, la iopromida aumentó la intensidad de la fluorescencia de los AVO y disminuyó la intensidad de la fluorescencia del AO celular (Figura 6C) en las células HEK 293. Nuestros resultados indicaron que la autofagia inducida por iopromida, según lo evaluado mediante el ensayo de tinción AO. También demostramos que la iopromida aumentó la intensidad de fluorescencia de LysoTracker Red, lo que sugiere que la iopromida indujo la actividad del lisosoma durante el proceso de autofagia (Figura 7). Estudios previos han demostrado que la autofagia juega un papel protector en la inducción de cisplatino.renallesión de células epiteliales tubulares (56-58). Para examinar más a fondo el papel de la autofagia en la muerte celular inducida por iopromida, se trataron células HEK 293 con los inhibidores de autofagia 3-metiladenina (3-MA) o bafilomicina A1 (Baf. Tratamiento combinado (iopromida con {{ 6}}MA o Baf) disminuyó significativamente la viabilidad celular en comparación con la iopromida sola (Figura 8), lo que sugiere que la autofagia desempeña un papel protector en la lesión celular HEK 293 inducida por la iopromida.
La ICM ingresa a las células e induce cambios en la función mitocondrial, lo que resulta en una mayor generación de ROS y muerte celular apoptótica (59). Tana Xuexian et al. también demostró un aumento significativo en la producción de ROS en células NRK-52E tratadas con iopromida(60). Se ha demostrado que los agentes antioxidantes, incluidos el bicarbonato de sodio, la NAC, el ácido ascórbico (vitamina C), las estatinas y los inhibidores de la fosfodiesterasa tipo 5 tienen efectos inducidos por la ICM (61-65). En un estudio in vivo, se demostró que la NAC es más eficaz que la hiperhidratación sola para prevenir la hiperhidratación aguda inducida por el contraste.insuficiencia renal(63). En el presente estudio, demostramos que la iopromida inducía la producción de ROS en células HEK 293 (Figura 9A y B). Se encontró que la viabilidad celular aumentó significativamente en el grupo de iopromida más NAC en comparación con el grupo de iopromida sola (Figura 9C).Las alteraciones en la actividad de AKT son esenciales para la supervivencia celular y se ha demostrado que regulan fuertemente la apoptosis y la autofagia en presencia de ICM (66-68). Aquí, investigamos el efecto de la iopromida en la regulación de AKT en células HEK 293. Los resultados revelaron una marcada reducción en la actividad de la quinasa AKT en las células tratadas con iopromida en comparación con las células de control. Nuestros resultados sugieren que la inhibición de la actividad de AKT se correlaciona con la apoptosis y la autofagia inducidas por iopromida, que pueden controlarse
a través de la vía de señalización de AKT. Nuestros resultados sugieren que la iopromida induce la producción de ROS, lo que inhibe la actividad y la señalización de la quinasa AKT. La vía de señalización de AKT se correlaciona positivamente con la supervivencia celular y se asocia negativamente con la muerte celular y la autofagia.En este estudio, demostramos que la autofagia protegía a las células de la apoptosis. El daño celular y la citotoxicidad de las células HEK se iniciaron por apoptosis inducida por iopromida (Figura 10B). En conclusión, demostramos que la iopromida inhibía significativamente la viabilidad de las células HEK 293 e inducía la apoptosis y la autofagia en comparación con el grupo de control in vitro. Además, las altas concentraciones de iopromida inducen daño celular, apoptosis y autofagia a través del estrés celular dependiente de ROS y la inhibición de la vía de señalización de AKT en células HEK 293 normales.
