La espectrometría de masas en tándem de alta resolución identifica un patrón particular de gangliósidos en la enfermedad renal diabética temprana de pacientes con diabetes mellitus tipo 2
Dec 08, 2023
Abstracto:
Considerando la valiosa información que aportan los glicoesfingolípidos comomarcadores molecularesy los limitados datos disponibles para su detección y caracterización en pacientes que padecenEnfermedad renal diabética tipo 2(DKD), desarrollamos e implementamos un método superior basado en espectrometría de masas (MS) de alta resolución (HR) y MS en tándem (MS/MS) para la determinación de gangliósidos en la orina dePacientes con ERC. Este estudio se centró en: (i) probar la viabilidad y el desempeño de HR MS y MS/MS en el mapeo ysecuenciación de gangliósidos renales en DM tipo 2pacientes; (ii) determinación de los cambios en elgangliósido urinario de DKDpacientes endiferentes etapas de la enfermedad-normo-, micro- y macroalbuminuria-en un ensayo comparativo con controles sanos. Debido a la alta resolución y precisión de la masa, el examen comparativo de MS reveló que el estado de sialilación de los componentes gangliósidos; su modificación por O-acetilo, CH3COO-, O-fucosilo y O-GalNAc; así como la composición de la ceramida representan posibles marcadores para la detección temprana de la DKD, la evaluación de la progresión de la enfermedad y el tratamiento de seguimiento. Además, la investigación estructural realizada por MS/MS demostró que GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) y GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) los isómeros están asociados con la macroalbuminuria, lo que merece una mayor investigación en relación con su papel en la EDR.
Palabras clave: nanoelectrospray; espectrometría de masas en tándem de alta resolución; poner en pantalla; análisis de fragmentación; enfermedad renal diabética; biomarcadores de gangliósidos
1. Introducción
La diabetes mellitus (DM) tipo 2 sigue siendo un desafío terapéutico con una prevalencia global en constante aumento, a pesar de los avances científicos en el campo. Asociada con daños macrovasculares y microvasculares devastadores a largo plazo, la DM tipo 2 conduce a una mayor mortalidad. La enfermedad renal diabética (ERT) es la causa más común de enfermedad renal terminal (ESRD) en países desarrollados y en desarrollo [1,2]. Por tanto, la detección temprana de la ERD y el tratamiento óptimo de la DM tipo 2 son cruciales para reducir las complicaciones, la morbilidad y la mortalidad. Actualmente, el diagnóstico y la progresión de la DKD se basan en la medición de la albuminuria y la reducción constante de la tasa de filtración glomerular (eGFR), ambos parámetros muestran una predicción modesta del estado renal futuro. La historia natural de la DKD incluye varias etapas clínicas, incluidas las siguientes: hiperfiltración glomerular temprana, aparición de microalbuminuria o macroalbuminuria, disminución de la tasa de filtración glomerular y ESRD. Sin embargo, investigaciones recientes consideran que la albuminuria es un marcador de deterioro de la condición [3].
En la última década se ha mostrado especial interés en el concepto subtelocéntrico, según el cual el túbulo proximal y el compartimento tubulointersticial podrían tener un papel esencial en el inicio y progresión de la ERD [4-6]. En este contexto, el desarrollo de biomarcadores glucómicos pronósticos y predictivos está ganando cada vez más atención y se ha convertido en el foco de muchos grupos de investigación a lo largo de los años [7-11].
Los gangliósidos representan una clase particular de glicoesfingolípidos con una estructura compleja identificada en todos los tejidos y fluidos corporales y particularmente abundante en el sistema nervioso central (SNC) [12]. Como constituyentes esenciales de las membranas de la bicapa de las células neuronales, los gangliósidos desempeñan un papel vital en el desarrollo, la maduración y el envejecimiento del cerebro, mediando la adhesión, activación, proliferación, motilidad y crecimiento celular. Los gangliósidos consisten en una ceramida de diferente composición con respecto a la base esfingoide, residuos de ácidos grasos enraizados en la capa externa de la membrana y una cadena de oligosacáridos sialilados que recubre la membrana y participan en interacciones específicas y esenciales con otras moléculas del entorno circundante. A través del recambio normal de la superficie celular, conocido como "desprendimiento de la superficie celular", los gangliósidos se liberan, en cierta medida, en el espacio intercelular.
Debido a que se sabe que la expresión, distribución y estructura de los gangliósidos son específicas del tipo de célula y tejido y varían durante el desarrollo, la maduración, el envejecimiento y, sobre todo, en estados patológicos del tejido [12], los gangliósidos se consideran entre los más valiosos. marcadores de diagnóstico y posibles agentes terapéuticos.
Se han aplicado varios métodos que utilizan fragmentos de biopsia de suero o riñón para la identificación de gangliósidos renales en pacientes con DM tipo 2, como la inmunotinción en capa fina [7,8], la cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) [9], la espectrofotometría [10 ] y espectrometría de masas (MS) [11].
En vista de la valiosa información que pueden proporcionar los gangliósidos como marcadores moleculares del tejido neuronal [12] y los datos limitados disponibles hasta el momento en la detección y caracterización de glicoesfingolípidos en la orina de pacientes con ERD, desarrollamos e implementamos un método superior basado en MS de alta resolución (HR) con nanoelectrospray (nanoESI) para la determinación de gangliósidos en la orina de pacientes con DM. Esta opción para HR MS se guió por las ventajas que ofrece este método en el análisis de mezclas complejas de gangliósidos extraídos de orina humana. El elevado poder de resolución del instrumento: (i) permite la detección de iones de valores m/z cercanos, que de otro modo no podrían discriminarse en una muestra multicomponente heterogénea que contiene especies de diversas longitudes y arquitecturas de la cadena de glicano y composiciones diferentes de la ceramida; (ii) básicamente elimina la necesidad de separar la mezcla mediante métodos cromatográficos líquidos o electroforéticos antes del análisis de MS; (iii) proporciona una alta precisión de masa, lo que aumenta en gran medida la confiabilidad de la identificación estructural; y (iv) ofrece no solo una mejor comprensión de la complejidad del gangliosidoma asociado a DM, sino también datos sobre las especies con potencial papel de biomarcador basado en la alta confianza en la determinación de masa tanto para iones moleculares como fragmentados.
Este estudio piloto, con el objetivo de caracterizar los gangliósidos urinarios con funciones de biomarcadores en ladiagnóstico precoz de DKD, se centró en: (a) probar la viabilidad y el rendimiento de HR MS y MS en tándem (MS/MS) mediante disociación inducida por colisión de alta energía (HCD) en el mapeo de gangliósidos renales en pacientes con DM tipo 2; (b) determinación de los cambios en la expresión de mezclas de gangliósidos nativos de muestras de orina de pacientes con DM tipo 2 en un ensayo comparativo con controles sanos y caracterización de los biomarcadores descubiertos. Para este propósito, optimizamos una plataforma bioanalítica moderna basada en nanoESI HR MS en un instrumento Orbitrap sintonizado para operar en modo de iones negativos tanto en detección de MS como en fragmentación de MS/MS para un análisis estructural detallado.
2. Resultados y Discusiones
2.1. Detección comparativa de las muestras mediante nanoESI HR MS
Las muestras de gangliósidos A1, A2, A3 y C se infundieron mediante nanoESI una tras otra en un Orbitrap MS y se examinaron en modo de iones negativos en condiciones instrumentales idénticas. En cada caso, la señal de corriente iónica total (TIC) se adquirió durante 2 minutos, generando espectros a partir de la acumulación de 100 escaneos. Debido a la alta sensibilidad del método, incluso en las condiciones de tiempo restrictivas empleadas, los espectros de masas adquiridos presentaban una alta relación señal-ruido y un rico patrón de iones moleculares.
La evaluación de los datos cartográficos generados en las mismas condiciones reveló diferencias significativas en el número y tipo de componentes gangliósidos expresados en las muestras A1, A3 y C, mientras que no se observaron diferencias entre las muestras A1 y A2. Estos resultados se resumen en la Tabla 1, que enumera comparativamente las estructuras identificadas en las mezclas nativas A1, A3 y C, junto con los valores experimentales de m/zexp de las señales detectadas y los valores teóricos de m/ztheor correspondientes a las estructuras propuestas.
La alta resolución y precisión de masa de la plataforma MS empleada mejoraron la discriminación e identificación basada en mediciones de masa precisas de no menos de 37 componentes distintos de gangliósidos y fucogangliósidos en orina en las tres muestras. Las especies descubiertas pertenecen a 15 clases diferentes, incluidas las modificaciones de la cadena principal de glucanos (Tabla 2), y se les asignó una excelente precisión de masa promedio de 4 ppm.
Una evaluación detallada de las estructuras en la Tabla 1 reveló que de todas las muestras, la mezcla A3, que corresponde a macroalbuminuria (por lo tanto, a una etapa avanzada de DKD), contiene el mayor número de compuestos gangliósidos distintos, es decir, 19, seguida de muestra C, con 12 especies distintas, y muestra A1, con 10.
En comparación con las muestras A1 y C, A3 también: (i) abarca el mayor número de especies con la cadena de O-glicano más larga perteneciente a la clase G1 y la diversidad más destacada de composiciones de ceramidas; (ii) presenta el mayor número de clases de gangliósidos expresadas en clases -12 versus solo 6 en la muestra A1 y 6 en la muestra C, respectivamente; (iii) contiene el mayor número de gangliósidos, que exhiben un núcleo de sacárido alterado por O-acetilo no carbohidrato, así como modificaciones biológicamente relevantes de O-fucosilo y O-GalNAc de carbohidratos; (iv) es el único extracto urinario que contiene estructuras gangliósidas modificadas por la unión de O-GalNAc, concretamente GalNAc-GS1(t18:1/18:0), detectada como una molécula cuádruple desprotonada y sodiada a m/z 1176,8266 , y GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), como una molécula doblemente desprotonada en m/z 1310.1271. Como se puede ver en las Figuras 1a a c, que muestran la proporción de las clases de gangliósidos expresadas en las tres muestras, y en el histograma comparativo que se muestra en la Figura 2, el extracto de A3 muestra un estado de sialilación particular, dominado por polisialocompuestos. Excepto por la gangliotetraosa monosialilada GM1(d18:1/16:1) detectada como [M-2H+ ] 2− a m/z 756,9078 y la GM3 monosialilada(d18:0/24: 0) detectada como una molécula doblemente desprotonada en m/z 645,3956, las otras 17 especies contienen más de un residuo Neu5Ac en su resto glicano. Además, debido a que se descubrieron no menos de siete trisialo GT1, cuatro pentasialo GQ1 e incluso un GS1 heptasialilado, obviamente, además del aumento en el número y la diversidad de estructuras, la longitud de los núcleos de glucano y sus modificaciones periféricas, la alta sialilación general El contenido representa otra característica específica de la macroalbuminuria.
Tabla 1. Se identificaron especies de gangliósidos en muestras A1, A3 y C mediante detección (-) nanoESI Orbitrap MS. d: base esfingoide dihidroxilada; t: base esfingoide trihidroxilada.
Del ensayo comparativo A1 frente a C también surge una observación clínicamente relevante. Mientras que en la muestra de control, C, el grado de sialilación más alto de los gangliósidos detectados es cuatro, identificados mediante dos gangliotetraosas tetrasialiladas GQ1 que se diferencian en la composición de su aglicona lipídica, en la muestra A1, el grado de sialilación más alto es cuatro. Junto a los gangliósidos di, tri y tetrasialilados, la mezcla A1 contiene una pentasialo gangliotetraosa GP1 (d18:1/18:0), detectada como ion [M-4H+] 4− en m/z 676,5569, al que se le asignó la excelente precisión de masa de 2,95 ppm. Tales datos relacionados con el estado de sialilación de las muestras investigadas muestran que el grado de sialilación de los gangliósidos renales sigue el rasgo C < A1 < A2=A3, observación que enfatiza la precocidad de estas modificaciones, incluso en la etapa de normoalbuminuria de Pacientes con DM tipo 2. El grado de sialilación aumenta con la progresión de la enfermedad, lo que lo convierte en un parámetro molecular a considerar no sólo para la detección precoz de la ERD sino también para la evaluación deProgresión de la enfermedad renal crónicayefectividad del tratamiento.
Tabla 2. Vista tabulada de las clases de gangliósidos en orina identificadas junto con su expresión diferencial en muestras A1, A3 y C. Símbolos: x=la clase fue detectada; -=la clase no fue detectada.
Una inspección detallada de la constitución de las agliconas revela que, excepto por las marcadas diferencias en la composición de la cadena de glucanos, los gangliósidos expresados en las tres muestras también exhiben diferencias en la estructura de sus ceramidas. Las alteraciones más evidentes de la parte lipídica están relacionadas con el proceso menos común de trihidroxilación de bases esfingoideas, que ocurre en las mezclas de gangliósidos A1 y A3, y la longitud inusual de las cadenas de ácidos grasos, presentes únicamente en A3. Se encontró que cada una de las muestras A1 y A3 contenía dos especies con bases esfingoideas trihidroxiladas de la ceramida. Por lo tanto, GT1(t18:0/18:0) y GT1(t18:0/20:0) se descubrieron en la muestra A1, mientras que los más En la muestra A3 se encontraron estructuras complejas trihidroxiladas GT1 (t18:1/24:3) y Fuc-GT3 (t18:1/18:3).
Sorprendentemente, la muestra A3 también muestra evidencia de especies que contienen ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA). Un VLCFA se considera una estructura lipídica poco común que abarca de 23 a 27 átomos de carbono en la cadena de ácidos grasos. En la muestra A3 se detectaron cuatro especies inusuales de VLCFA que portaban 24 átomos de carbono en la cadena de ácidos grasos: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0), y Fuc-GT1(d18:0/24:0), de los cuales una estructura también presenta la poco común trihidroxilación de bases esfingoideas y tres dobles enlaces en la cadena de ácidos grasos, mientras que dos estructuras presentan uniones al núcleo de glicano de O-Ac y al grupo fucosilo, respectivamente.
Estas características de las porciones de ceramida en las muestras A1 y A3, que no se encontraron en la muestra de control; las similitudes entre el A1 y el A2; y las marcadas diferencias detectadas en el A3 sugieren que, junto a la composición de carbohidratos y el estado de sialilación, la estructura de la fracción lipídica en los gangliósidos renales es otro posible marcador de DKD temprana. Además, las modificaciones en la composición de las ceramidas parecen depender de los estadios de albuminuria; Las ceramidas complejas, que exhiben trihidroxilación de la base esfingoidea y VLCFA, parecen estar relacionadas con las etapas avanzadas de albuminuria. Considerando que el número poco común de tres dobles enlaces en la cadena de ácidos grasos se encontró solo en la muestra A3 a través de dos especies diferentes, Fuc-GT3(t18:1/18:3) y GT1(t18:1/24:3), aparentemente, el mecanismo de formación de dobles enlaces también está relacionado con la progresión de la ERD.
Los efectos negativos ejercidos por la acumulación de lípidos dentro del riñón, tanto a nivel glomerular como tubular, son específicos de cada célula. Además, la lipotoxicidad se asocia con varios tipos de lípidos, entre los cuales los gangliósidos desempeñan un papel central [13].
El contenido renal de gangliósidos, entre otras clases de lípidos, aumentó en los podocitos, así como en las células del túbulo proximal, en un modelo de ratón DN [14]. Los túbulos proximales pueden estar expuestos a altos niveles de lípidos urinarios, incluidos los gangliósidos, debido al aumento del contenido de ácidos grasos por molécula de albúmina en las primeras etapas de la enfermedad renal crónica [15]. Las consecuencias directas de la acumulación de lípidos dentro de los segmentos de la nefrona están relacionadas con modificaciones estructurales y funcionales, que conducen a un procesamiento deficiente de la albúmina en las primeras etapas del curso de la DM tipo 2.
La gran mayoría de los estudios que se centran en la caracterización de los gangliósidos renales se basan en modelos experimentales de nefropatía diabética. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio traslacional en humanos desde la investigación básica hasta la aplicabilidad clínica para informar sobre un patrón particular de gangliósidos urinarios en pacientes con DM tipo 2. La importancia práctica de nuestro estudio radica en la demostración de una asociación del grado de sialilación de los gangliósidos urinarios y la estructura de sus ceramidas con la DKD temprana, clasificada según el nivel de albuminuria.
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