Abstracto

Fondo:Existe una escasez de técnicas de imagen y procesamiento de imágenes para la discriminación y cuantificación precisas de la matriz extracelular dérmica (ECM), principalmente colágeno. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar y demostrar un enfoque holístico de imágenes y procesamiento de imágenes para visualizar y cuantificar la remodelación del colágeno a escala macro, micro y nanométrica utilizando imágenes histoquímicas, microscopía confocal de reflectancia (RCM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). , respectivamente.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y tiene la capacidad de eliminar las especies reactivas de oxígeno y prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres, y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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Material y métodos:Como prueba de concepto, se probó ex vivo un producto antienvejecimiento comercial conocido por inducir la neosíntesis y la reorganización del colágeno en biopsias de piel humana de dos mujeres ancianas.

Resultados:En relación con la piel no tratada, las fibras de colágeno (RCM) y las fibrillas (AFM) eran más largas y estaban alineadas después del tratamiento. El contenido de colágeno y elastina (imágenes histoquímicas y ELISA) mejoró estadísticamente después del tratamiento.

Conclusión:Con base en nuestros hallazgos, podemos concluir: (1) AFM, RCM e imágenes histoquímicas pueden discriminar con precisión el colágeno de otros componentes de ECM en la piel y (2) los métodos de procesamiento de imágenes pueden permitir la cuantificación y, por lo tanto, capturar pequeñas mejoras en la remodelación del colágeno después tratamiento (producto cosmético comercial con tecnología de organizador de colágeno como prueba de concepto). El enfoque holístico de imágenes informado tiene implicaciones clínicas directas para que los científicos y dermatólogos tomen decisiones rápidas, en tiempo real y precisas en la investigación y el diagnóstico de la piel.

PALABRAS CLAVE

antienvejecimiento, microscopía de fuerza atómica, reorganización del colágeno, remodelación dérmica, matriz extracelular, microscopía confocal de reflectancia (Vivascope)

1. INTRODUCCIÓN

La remodelación controlada de la matriz extracelular dérmica (MEC) es esencial para el desarrollo normal y la homeostasis de la piel y otros órganos. La remodelación de la ECM es el sello distintivo en la fisiopatología del envejecimiento de la piel,1 la cicatrización de heridas y algunas enfermedades mortales, incluidas, entre otras, el cáncer y la fibrosis.2 Existen numerosas opciones estéticas y médicas para tratar estas afecciones de la piel; sin embargo, los métodos de imagen son escasos para visualización en tiempo real de la remodelación de la MEC, principalmente colágeno, que es el componente estructural más abundante de la MEC dérmica. Aunque están en desarrollo, algunas de las nuevas técnicas de imágenes clínicas no invasivas en tiempo real para visualizar el colágeno y su organización son la microscopía multifotónica con segunda generación armónica (MPM-SHG),3 la microscopía confocal de reflectancia (RCM),4 la tomografía de coherencia óptica (OCT),5,6 Tomografía de coherencia óptica confocal de Lindfield (LC-OCT) basada en la combinación de modalidades de RCM y OCT,7 Resonancia magnética (MRI)8 e imágenes por ultrasonido.9 De estos, RCM, MPM y LC-OCT son instrumentos de imagen de la piel con certificación CE. Sin embargo, entre todas ellas, la técnica RCM (Vivascope® 1500 y 3000 de Lucid, Inc. USA) es la única técnica de diagnóstico de dermatología clínica aprobada por la FDA (510(k)# K080788), que también está cubierta por la mayoría de los seguros en el USA para diagnosticar lesiones cutáneas.10 Es una alternativa no invasiva y rentable a las técnicas clásicas de biopsia e histopatología para diagnosticar y controlar los cánceres de piel y su tratamiento.10 Entre los métodos de imagen preclínicos para visualizar la organización del colágeno, la microscopía de fuerza atómica ( AFM),11 microscopía electrónica,11,12 imágenes histoquímicas usando microscopía de fluorescencia,13 microscopía de luz polarizada,14 microscopía de escaneo láser confocal (CLSM),15,16 reflectancia confocal multimodal y microscopía de fluorescencia,17 y dispersión de rayos X de ángulo pequeño18 son bien conocido

Una de las principales advertencias que restringen el uso de las técnicas de imágenes clínicas mencionadas anteriormente es que requiere una tediosa evaluación manual porque la experiencia y la experiencia en la materia para analizar con precisión las imágenes en blanco y negro de las estructuras de la piel es un requisito previo.19,20 Por lo tanto, se requieren más esfuerzos. necesarios en el campo del procesamiento de imágenes para desarrollar y validar algoritmos y software para automatizar el análisis,5 producir imágenes teñidas digitalmente fáciles de interpretar,16,17 y extraer información cuantitativa para monitorear la progresión de la enfermedad y la terapia, incluida la organización del colágeno en el contexto de nuestro research.3,6,12–14 Permitirá a los dermatólogos y no dermatólogos tomar decisiones más rápido y con más confianza, ya que las decisiones se tomarán a partir de un tamaño de muestra más grande de las imágenes aleatorias. Se han realizado algunos estudios fundamentales para mostrar el uso de RCM y MPM para comprender los cambios en la piel relacionados con la edad (incluida la organización del colágeno) en sujetos jóvenes frente a ancianos o fotoenvejecidos.21,22 Sin embargo, existe un esfuerzo limitado para ampliar el poder de estas técnicas de imagen para capturar la mejora en el tratamiento, lo que requiere un procesamiento de imágenes sofisticado para obtener información cuantitativa.3,13,16

Este estudio tuvo como objetivo desarrollar y demostrar un enfoque holístico de imágenes y procesamiento de imágenes para visualizar y cuantificar las mejoras en la remodelación dérmica (principalmente colágeno). Como prueba de concepto, se utilizó un producto cosmético antienvejecimiento comercial clínicamente probado con tecnología organizadora de colágeno para evaluar la viabilidad de utilizar el procesamiento de imágenes para cuantificar cambios menores en el colágeno antes y después del tratamiento.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Biopsias de piel y su tratamiento

Las biopsias de piel utilizadas en esta investigación fueron el material sobrante de la cirugía plástica abdominal obtenida de dos donantes después de su consentimiento (consentimiento retenido por las clínicas). El donante n.º 1 (62 años) y el donante n.º 2 (52 años) eran mujeres y piel tipo II de Fitzpatrick. Las biopsias se mantuvieron en condiciones de cultivo estándar y se trataron diariamente con el producto de prueba o el control (sin tratar o con placebo) durante 6 días y se recogieron el día 7 para obtener imágenes y ELISA. Las biopsias del donante n.° 1 se usaron para ELISA, RCM y AFM, mientras que las biopsias del donante n.° 2 se usaron para la obtención de imágenes histoquímicas.

2.2 Imágenes RCM y AFM

Las biopsias de piel del donante n.º 1 se recogieron el día 7 y se obtuvieron imágenes directamente sin cortes ni tinciones. Se utilizaron AFM (Bruker, Multimode 8 AFM) y RCM (Vivascope® 1500) para obtener imágenes de alta resolución a escala nano y micro de colágeno en la piel tratada con el producto de prueba y sin tratar como control. Para todos los experimentos, el AFM estaba equipado con un voladizo pequeño (PPP-FMR- 20, nanosensores): constante de resorte, k=0.5–9.5 N/m, frecuencia de resonancia, f {{13} }–115 kHz en el aire y se operó en el modo de tapping a temperatura ambiente. Las muestras de piel se montaron lateralmente en un disco magnético (1 mm × 1 mm) y se colocaron en el escenario. Las imágenes AFM se adquirieron a través de una vista lateral/lateral de las biopsias de piel para evitar el corte. Para las imágenes RCM, se adquirieron siete imágenes aleatorias de biopsias tratadas y no tratadas desde la parte superior (lado del estrato córneo) y la parte inferior (lado de la dermis) para adquirir imágenes de colágeno de alta calidad. Las imágenes RCM se procesaron y analizaron utilizando ConfoScan® para textura de colágeno para informar el índice de fragmentación medio. El índice de fragmentación se define por el área de objetos dividida por el número de objetos obtenidos después de procesar las imágenes sin procesar para textura de colágeno. La Figura S1 muestra el procesamiento de imágenes usando ConfoScan® para obtener valores cuantitativos en el índice de fragmentación de colágeno (CFI).

2.3 Imágenes histoquímicas

Para probar el efecto del producto anti-envejecimiento en el tratamiento de la piel fotoenvejecida (recuperación de colágeno y elastina foto-dañada), las biopsias del donante #2 fueron expuestas a una dosis simulada de UV (6 J/cm2 con 96 por ciento de UVA ). Las muestras y condiciones probadas en los experimentos fueron: (A) control negativo (sin tratar, sin UV y sin producto de prueba), (B) control positivo (piel expuesta a UV, pero sin producto de prueba) y (C) tratada ( piel expuesta a los rayos UV, seguido de un tratamiento diario con el producto de prueba). Las biopsias de piel se recogieron el día 7, se seccionaron, se tiñeron para colágeno (tinción de Picosirius) y elastina (inmunostinción) y se tomaron imágenes. Las imágenes se procesaron y analizaron utilizando un algoritmo de análisis de imágenes patentado para obtener información cuantitativa sobre el contenido de colágeno y elastina en la dermis papilar. Brevemente, el proceso analítico para obtener información cuantitativa sobre el contenido de colágeno y elastina incluye la conversión de imágenes RGB al espacio de color LAB, filtrando el fondo para obtener imágenes claras de colágeno y elastina, y luego normalizando el contenido de colágeno y elastina en la dermis papilar para la misma área o varios píxeles. Hubo seis biopsias o muestras de piel para cada condición y dos secciones o imágenes de cada muestra, lo que resultó en N=12 imágenes y puntos de datos para pruebas estadísticas. La Figura S2 muestra el esquema del enfoque de procesamiento de imágenes para obtener valores cuantitativos sobre el contenido de colágeno.

2.4 ELISA

Después de la recolección de tejido el día 7, se usó un punzón de 4 mm de diámetro para obtener biopsias más pequeñas y se seleccionaron dos biopsias con ~25 mg/biopsia. Las biopsias perforadas (50 mg de peso total) se mezclaron en un tampón de lisis que contenía un 0,1 % de Triton y un cóctel de inhibidores de proteasa, seguido de la homogeneización del tejido mediante un homogeneizador de procesamiento dual automatizado con características mecánicas y ultrasónicas para lisar completamente el tejido. tejido. El tejido lisado se centrifugó, el sobrenadante se recogió, se alicuotó en dos y se almacenó a -80 ºC hasta su uso. Además de la normalización en cuanto al peso (50 mg), las muestras también se normalizaron al contenido de proteína total en el sobrenadante. Se analizó el sobrenadante para Pro-Collagen 1, Elastin, Alpha-Smooth Muscle actin (A-SMA), Tenascin-X y Hyaluronic acid usando kits comerciales de ELISA. Las estadísticas se realizaron en N=6 puntos de datos (3 biopsias × 2 alícuotas).

3 RESULTADOS

Las imágenes histoquímicas (Figura 1) proporcionaron información macroscópica sobre la distribución y cantidad de colágeno y elastina. Se observó una clara disminución del color rojo de los haces de fibras de colágeno y elastina después del tratamiento de las biopsias de piel con UV.

La Tabla 1 muestra los valores cuantitativos del contenido de colágeno y elastina en tres condiciones de tratamiento. Estos valores nos permitieron medir las mejoras en el contenido de colágeno y elastina y hacer comparaciones estadísticas. La disminución en el contenido de colágeno (−23 % frente a los no tratados) y elastina (−30 % frente a los no tratados) después de la exposición a los rayos UV fue significativa (Figura 2). Después del tratamiento con el producto de prueba durante 6 días, las biopsias de piel expuestas a UV pudieron recuperar colágeno (más un 18 % frente al tratamiento con UV) y elastina (más un 46 % frente al tratamiento con UV). Aunque la organización del colágeno no es clara en las imágenes histoquímicas (porque el colágeno es más abundante y está más densamente empaquetado en la piel), se observa una alineación perpendicular característica de las fibras de elastina que corren hacia la epidermis en la piel nativa (Figura 1A) y dañada por los rayos UV después de tratamiento con producto de prueba (Figura 1C).

ELISA (Figura 3) compara los niveles de biomarcadores expresados ​​por biopsias de piel tratadas con el producto de prueba o placebo (que carece de un cóctel de ingredientes activos conocidos por la remodelación dérmica). En comparación con el placebo, hubo un aumento de 2 a 3 veces en los niveles de elastina y colágeno, en particular pro-colágeno tipo 1 (producto de prueba frente a placebo). Aunque no significativo, también se observó un aumento notable (P < 0.1) en ácido hialurónico y tenascina-X.

El RCM pudo revelar con éxito la organización de las fibras de colágeno (haz de fibrillas de colágeno) en la piel (Figura 4). Debido a sus características ópticas de placa confocal y de cuarto de onda, la técnica pudo discriminar con éxito el colágeno (agente de contraste endógeno fuerte con birrefringencia) de otras matrices sin seccionar ni teñir la piel. El colágeno fragmentado corto y su disposición amontonada (característica del colágeno dañado y mal organizado en la piel envejecida/foto-envejecida) se observan en la biopsia de piel no tratada. Después del tratamiento con el producto de prueba durante 6 días, la disposición de las fibras de colágeno en esta biopsia de piel femenina de 62-años (donante n.º 1) parece relativamente más organizada que las fibras de colágeno no tratadas con longitudes de más de 100 µm corridas paralelos entre sí. Aunque el contraste es pobre, podemos observar la forma y el tamaño de los fibroblastos (resaltados con flechas en la Figura 4), fibroblastos grandes y dispersos con formas regulares en la piel tratada frente a la piel no tratada. Las celdas redondas brillantes en la Figura 4C son de particular interés. Podrían ser mastocitos o células inflamatorias. No está claro si estas células inflamatorias son representativas de las condiciones normales de salud de la piel o si se expresaron en respuesta a una fuerza significativa aplicada sobre el cabezal del láser para tratar de lograr un mejor contacto entre el cabezal del láser y la piel para obtener imágenes de colágeno de alta calidad. fibras

La Tabla 2 muestra el índice de fragmentación medio determinado por el análisis ConfoScan® de siete imágenes aleatorias de piel tratada frente a piel no tratada. El índice de fragmentación del medio de colágeno del grupo tratado frente al no tratado fue 0.032 y 0,064, respectivamente. Una disminución en el índice de fragmentación indica una mejora en la organización del colágeno.

Para profundizar en la disposición del colágeno, se adquirieron imágenes AFM para visualizar la disposición del colágeno a nanoescala (Figura 5). Podemos ver fibrillas de colágeno individuales (que se agrupan para formar una fibra de colágeno) de un grosor nanométrico. Además, también podemos ver el patrón de bandas transversales característico de las fibrillas de colágeno (D ∼ 68 nm), que está alineado con la literatura,11 y valida que AFM pudo discriminar el colágeno de otras fibras de ECM. En consenso con RCM, también se observó una organización relativamente paralela de las fibrillas de colágeno bajo AFM para la piel tratada frente a la no tratada.

4. DISCUSIÓN

En esta investigación, exploramos el potencial de utilizar tres técnicas de imagen para visualizar cambios en el colágeno en biopsias de piel humana tratadas con un producto antienvejecimiento comercial que contiene algunos péptidos sintéticos de referencia conocidos por inducir la remodelación del colágeno. Las técnicas de imagen histoquímica y de imagen RCM se combinaron con el procesamiento de imágenes para obtener información semicuantitativa sobre el contenido de colágeno y la fragmentación como índice para puntuar la mejora en el colágeno después del tratamiento con el producto antienvejecimiento.

Curiosamente, nuestro estudio mostró una correlación muy fuerte entre las imágenes histoquímicas y ELISA para informar un aumento significativo en los niveles de colágeno y elastina después del tratamiento con el producto de prueba. El procolágeno tipo 1 es el marcador del colágeno recién sintetizado, y su sobreexpresión por parte de los fibroblastos en respuesta a Matrixyl® (Sederma/Croda) es un mecanismo bien caracterizado para el efecto antienvejecimiento.23,24 También hubo un aumento significativo en la expresión de A-SMA, un marcador exclusivo de los miofibroblastos, que son células de fibroblastos especialmente diferenciadas. El papel de A-SMA en la contracción y remodelación de la ECM mediada por fibroblastos es bien conocido,25 y se informa una correlación directa entre la expresión de A-SMA y la actividad de contracción de fibroblastos.26 Un aumento en el ácido hialurónico, aunque no significativo, podría ser principalmente atribuido a la presencia de ácido hialurónico como ingrediente hidratante en el producto antienvejecimiento. El TNSX es una proteína ECM novedosa que se localiza entre o en la superficie de las fibrillas de colágeno en la dermis de la piel27 y se informa que TNSX induce fibrilogénesis de colágeno dependiente de la dosis,28,29 aunque existe controversia sobre si TNSX se une específicamente al tipo pro-colágeno. 1 u otras biomoléculas de colágeno y ECM.28,29 Se informa un aumento dependiente de la dosis en TNSX en respuesta a SKINectura™ (Lucas Meyer Cosmetics), un ingrediente activo en el producto de prueba antienvejecimiento (Solicitud de patente internacional # PCT /IB2017/056370). Por lo tanto, se puede suponer que Matrixyl® (Sederma/Croda) y SKINectura™ (Lucas Meyer Cosmetics) en el producto de prueba trabajan juntos para facilitar la síntesis y alineación del colágeno recién sintetizado, procolágeno tipo 1. Una disminución significativa en el colágeno y la elastina después del tratamiento UV (modelo de piel fotodañada), seguido de su reparación después del tratamiento con un producto antienvejecimiento (los niveles vuelven a la piel nativa no expuesta a los rayos UV) indica la capacidad de la imagen histoquímica (microscopía polarizada) y la técnica de procesamiento de imágenes para medir pequeños cambios en el contenido de los componentes de ECM (Figuras 1 y 2). Se hicieron esfuerzos diligentes para tratar de obtener imágenes de la organización del colágeno y la elastina (después del etiquetado de inmunofluorescencia) utilizando el sistema de imágenes de fluorescencia Thunder Leica recién adquirido. Sin embargo, la resolución no fue lo suficientemente alta y, por lo tanto, no se pudo concluir nada confiable sobre la organización. Las imágenes CLSM basadas en fluorescencia ofrecen una resolución más alta que las imágenes de fluorescencia de campo amplio convencionales para permitir una visualización clara de la organización del colágeno y la elastina. Las imágenes de fluorescencia de campo amplio convencionales están limitadas por el predominio de la fluorescencia secundaria y el grosor de las muestras, que no son una preocupación para CLSM.

Pudimos visualizar la organización del colágeno usando RCM (Figura 4). RCM es una mejor opción que CLSM porque (1) RCM no usa ninguna etiqueta o tinción (a diferencia de CLSM de fluorescencia que requiere etiquetado de inmunofluorescencia) eliminando cualquier posibilidad de incertidumbre o falta de especificidad debido a las etiquetas, y (2) RCM es un ampliamente utilizó la técnica de imagen clínica dérmica para el colágeno. Una mejora en la textura de la fibra de colágeno, fibras largas y finas después del tratamiento con un producto antienvejecimiento (frente a fibras de colágeno fragmentadas densas y cortas en la piel no tratada) indica su modo de acción a nivel estructural. La resolución de RCM fue lo suficientemente alta como para capturar incluso células de fibroblastos, la fábrica de síntesis de colágeno de la piel. Las fibras de colágeno envueltas alrededor de los fibroblastos podrían ser las fibras de colágeno recién sintetizadas, ya que tienen un diámetro más delgado que las fibras de colágeno circundantes y sus haces (Figura 4). Según el análisis ConfoScan® de imágenes RCM aleatorias, podemos concluir que la piel no tratada tiene un índice mucho más alto de colágeno fragmentado en comparación con la piel tratada. Aunque en las imágenes de RCM podemos ver la alineación paralela de las fibras de colágeno después del tratamiento con el producto de prueba, no se puede concluir a menos que se calcule la relación isotropía/anisotropía, que estaba más allá del alcance de esta investigación. Sin embargo, la resolución ultraalta de AFM a nivel de nanoescala revela evidencia de alineación de colágeno a nivel de fibrillas individuales. Según la correlación positiva entre las imágenes RCM y AFM en la alineación paralela de las fibras de colágeno (sin tratar frente a tratadas), existe una gran posibilidad de que el producto antienvejecimiento tenga la propiedad de reorganización del colágeno declarada. Para futuras investigaciones, el estudio debe realizarse para monitorear el mismo punto (fibras de colágeno) a lo largo del tiempo (estudio longitudinal) antes y después del tratamiento con el producto de prueba para investigar si es la alineación del colágeno existente o las fibras de colágeno recién sintetizadas las que están más alineado. Sin embargo, un estudio longitudinal de este tipo requerirá la integración de instrumentos RCM y AFM para la capacidad de obtención de imágenes de tejido en vivo y la obtención de imágenes de lapso de tiempo para capturar cambios en tiempo real en la remodelación del colágeno.

5. CONCLUSIONES

Según los hallazgos de nuestra investigación de este estudio de prueba de concepto, podemos concluir que las técnicas de imágenes histoquímicas, AFM y RCM son capaces de monitorear los cambios en la organización del colágeno a escala nano, micro y macro, respectivamente. Las imágenes AFM y RCM muestran evidencia de alineación de colágeno a escala nano y micro después del tratamiento con el producto de prueba. El análisis de imágenes histoquímicas y RCM aleatorias utilizando enfoques de procesamiento de imágenes patentados indica además que la piel después del tratamiento con el producto de prueba tiene una fragmentación de colágeno más baja y una densificación de colágeno más alta en comparación con la piel no tratada. Aunque se ha realizado algún esfuerzo para desarrollar y validar algoritmos de procesamiento de imágenes3,5,6,12–14,16,17, se requiere más investigación en esta dirección para lograr decisiones de diagnóstico e investigación clínica y preclínica basadas en datos. Nuestro enfoque holístico de aplicar técnicas de imágenes de alta resolución y alto contenido en combinación con algoritmos y software de procesamiento de imágenes potentes y robustos es un paso en esta dirección.

Aunque el alcance de esta investigación se limitó a investigar la organización del colágeno en respuesta a un producto de prueba antienvejecimiento en una biopsia de piel humana ex vivo, estas técnicas de imagen tienen implicaciones para el seguimiento y la cuantificación de la remodelación de la ECM, que es el sello distintivo del desarrollo normal. cicatrización de heridas, así como un marcador clave en la fisiopatología de afecciones potencialmente mortales como la fibrosis y el cáncer que surgen de la remodelación descontrolada de la MEC.2

CONFLICTOS DE INTERÉS

Los autores declaran que ningún conflicto de intereses podría percibirse como perjudicial para la imparcialidad de la investigación informada.

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