Determinación por HPLC de echinacósido en extracto acuoso de Cistanche Herba
Jul 21, 2025
Abstracto: Objetivo: Se estableció un método HPLC para la determinación de Echinacósido en el extracto acuoso de Cistanche deserticola. Métodos: El equinacósido se determinó mediante HPLC. La separación se realizó en una columna Inertsil ODSSP C18 con una fase móvil compuesta por acetonitrilo (A) y una solución de ácido fosfórico al 0,4% (B), mediante elución en gradiente. La longitud de onda de detección se fijó en 333 nm y la temperatura de la columna fue de 30 grados. El caudal fue de 1,0 ml·min-1 y el volumen de inyección fue de 10 µL. Resultados: La relación lineal del echinacósido dentro del rango de concentración de 44,93977-539,2764 ug·m fue buena (r=0.9998). Las recuperaciones fueron del 94,59% al 105,31% (RSD= 2.93%,n=9). El contenido de equinacósido en extractos acuosos de Cistanche herba fue de 15.527,7.347,12.267 mg·g-1
Conclusión: El método HPLC establecido con buena repetibilidad es preciso, simple y factible. Es adecuado para la determinación de echinacósido en el extracto acuoso de Cistanche deserticola.
Palabras clave: HPLC ; extracto acuoso de Cistanche deserticola; equinacósido; determinación del contenido
Cistanche deserticola es un tónico de uso común en la medicina tradicional china en la práctica clínica y tiene la reputación de "ginseng del desierto". La Cistanche deserticola incluida en la edición de 2015 de la Farmacopea China es el tallo seco, escamoso y carnoso de la planta Orobaceae Cistanche deserticola YC Ma o Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Tiene un carácter cálido, un sabor dulce y salado y pertenece a los meridianos del riñón y del intestino grueso. Tiene los efectos de tonificar el yang del riñón, beneficiar la esencia y la sangre, humedecer los intestinos y aliviar el estreñimiento [2].
ginseng del desierto
El "Shennong Materia Medica Classic" afirma que puede "nutrir el medio, nutrir los cinco órganos internos, fortalecer el yin y nutrir la esencia". Cistanche deserticola contiene principalmente glucósidos feniletanoides, iridoides y glucósidos, lignanos y glucósidos, polisacáridos, ésteres y alcaloides [3]. Los glucósidos de feniletanol son los principales componentes activos de Cistanche deserticola, entre los cuales la equinácea y la piscina son los componentes indicadores para la identificación y determinación del contenido de Cistanche deserticola en la farmacopea china.
El glucósido de feniletanol es el principal componente activo de Cistanche deserticola
Los estudios farmacológicos [4] indican que Cistanche deserticola tiene diversos efectos farmacológicos, como humedecer los intestinos y aliviar el estreñimiento, proteger el hígado, resistir la osteoporosis, antioxidante, antienvejecimiento y antifatiga. El extracto acuoso de Cistanche deserticola puede promover los genes de la proteína morfogenética ósea 2 de los osteoblastos en ratas, así como la fosfatasa ácida resistente al tartrato y la osteocalcina en el suero de ratones ovariectomizados, así como los genes Smad1 y Smad5 y los factores de crecimiento transformantes en la médula ósea. - - - - . La expresión de, etc., tiene un efecto anti-osteoporosis [5-6]. Los equinosidos pueden promover la proliferación de osteoblastos y promover la diferenciación de células madre mesenquimales de la médula ósea en osteoblastos in vitro [7-9].
Equinósido, el principal componente químico de Cistanche deserticola
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En los últimos años, ha habido muchos informes sobre la determinación del contenido de echinacósido y polisido en el extracto alcohólico de Cistanche deserticola y sus preparaciones compuestas [10-12], pero hay pocos informes sobre la determinación del contenido de componentes indicadores en el extracto acuoso de Cistanche deserticola. En este estudio, se utilizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para determinar el contenido de equinacósido en el extracto acuoso de Cistanche deserticola.
1. Materiales
1.1 Aparato
LC-20AT cromatografía líquida de alto rendimiento, SPD-20A detector, SIL-20A muestreador automático, caja de temperatura de columna CTO-10ASvp, estación de trabajo de cromatografía líquida LCsolution, Shimadzu Corporation de Japón; Balanza analítica electrónica MES125P-OCE-DU, Sartorius, Alemania; Bomba de vacío multiusos de agua circulante SHZ-D (III), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.
Sistema de circulación de enfriamiento del evaporador rotativo 1.2RC2BSO25, evaporador rotativo RV10DS96, IKA, Alemania; DK-S26 Baño de agua termostático eléctrico, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; Máquina de agua ultrapura serie UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.
1.2 Materiales y reactivos medicinales
Material medicinal Meat Rong, adquirido en Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., número de lote: 18010011806001, 181001. Los tallos secos, escamosos y carnosos de la planta Leobaceae Cistanche deserticola identificados por el herbolario jefe chino Tu Xingming del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Guangzhou se almacenan en la Sala de Inspección de Medicamentos del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Chino Tradicional de Guangzhou Medicina; Sustancia de referencia de equinosidos, contenido del 89,7%, Instituto de Control de Alimentos y Medicamentos de China, número de lote: 111670-201706; El acetonitrilo es cromatográficamente puro (Merck, Alemania); El metanol y el ácido fosfórico son analíticamente puros (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); El agua es agua ultrapura.
2. Métodos y Resultados
2.1 Preparación de extracto acuoso de Cistanche deserticola
Tome el polvo de cistanche, agregue 10 veces la cantidad de agua destilada, caliente y refluya para extraer dos veces, cada vez durante 1 hora. Filtrar, combinar el filtrado y utilizar un rotavapor para concentrar el filtrado hasta un contenido de fármaco bruto de 0,100 g·mL-1. Almacenar a 4 grados en espera. 2.2 Condiciones cromatográficas e idoneidad del sistema Columna cromatográfica: columna InertsilODS SPC18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μ m); Fase móvil: acetonitrilo (A) - 0.4 % solución de ácido fosfórico (B), elución en gradiente: 0 ~ 5 min, 17 % A; 5~25min, 20%A; 25~30 min, 17%A; Longitud de onda de detección: 333 nm; Temperatura de la columna: 30 grados; Caudal: 1,0 ml · min-1; Volumen de inyección: 10 μ L. En esta condición cromatográfica, la resolución entre los picos de equinácea y los componentes adyacentes es superior a 1,5, y el número teórico de columnas no debe ser inferior a 4000 para los picos de equinácea. El cromatograma se muestra en la Figura 1.
Figura 1 Cromatogramas de HPLC de echinacósido (A) y extracto acuoso de Cistanche herba (B)
2.3 Preparación de la solución
2.3.1 Solución de referencia
Pese una cantidad adecuada de sustancia de referencia de echinacetina, pésela con precisión, colóquela en un matraz volumétrico de 10 ml, agregue metanol para disolver y haga que contenga 898,794 echinacetina por mililitro μ G de la solución de referencia, almacenada a 4 grados para el modo de espera.
Equinósido de Cistanche deserticola
2.3.2 Solución de prueba
Medir con precisión 2,0 mL de extracto acuoso de Cistanche deserticola, evaporar al baño maría, disolver en metanol, llevar a volumen constante en un matraz aforado de 10 mL y agitar bien. 0.22 μm de filtración por membrana microporosa, es decir.
2.4 Investigación de una relación lineal
Mida con precisión 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 2,50 y 3,00 ml de la solución de referencia según 2.3.1 y colóquelos en un matraz volumétrico de 5 ml, agregue metanol hasta un volumen constante y agite bien para obtener concentraciones de gradiente de 44,9397, 89,8794, 179,7588. 359.5176, 449.3970 y 539.2764 μ G · mL-1 de la solución de referencia, 0,22 μ M Filtración por membrana microporosa. Realice la determinación de acuerdo con las condiciones cromatográficas en 2.2 y registre el área del pico. Usando la concentración másica de la sustancia de referencia como abscisa (X, μ G · mL-1), el área del pico es la ordenada (Y) y se obtiene la ecuación de regresión lineal: Y=13185.0X-32273.0, r=0.9998. Los resultados mostraron que la equinácea osciló entre 44,9397 y 539,2764 μ. La relación lineal dentro del rango de concentración de g·mL-1 es buena.
2.5 Prueba de precisión
Tome 539,2764 μG · mL-1 de solución de referencia, inyecte la muestra continuamente 6 veces de acuerdo con las condiciones cromatográficas en 2.2 y registre el área del pico. Resultados: La RSD del área del pico de equinácea fue del 1,81%, lo que indica una buena precisión del instrumento.
2.6 Prueba de estabilidad
Mida con precisión 2,0 ml de extracto acuoso de Cistanche deserticola, evapore hasta sequedad en un baño de agua, disuelva en metanol, lleve a un volumen constante en un matraz volumétrico de 10 ml, agite bien, filtre 0,22 μ con una membrana microporosa, inyecte muestras para su determinación a las 0, 2, 4, 8, 12 y 24 horas de acuerdo con las condiciones cromatográficas en 2.2 y registre el área del pico. Resultados: La RSD del área del pico de equinácea fue del 1,16 %, lo que indica que la solución de prueba tenía buena estabilidad dentro de las 24 horas.
2.7 Prueba de repetibilidad
Mida con precisión 6 porciones de 2,0 ml de extracto acuoso de Cistanche deserticola, prepare 6 porciones de la solución de prueba en paralelo según el método descrito en 2.3.2, inyecte muestras para su determinación según las condiciones cromatográficas descritas en 2.2 y registre el área del pico. Resultados: La RSD de la concentración másica de equinácea fue del 1,28%, lo que indica que el método tenía buena repetibilidad.
Experimento de Cistanche deserticola
2.8 Prueba de recuperación de adición de muestras
Medir con precisión 9 porciones de 1,0 mL de extracto acuoso de Cistanche deserticola, agregar 0,8, 1,0 y 1,2 mL de solución de referencia (101,552 mg·mL - 1), evaporar al baño maría, disolver en metanol y llevar a volumen en un matraz aforado de mL; Agite bien, 0,22 μ Filtre con una membrana de filtro microporosa para preparar una solución de prueba de concentración alta, media y baja. Prepare 3 partes de cada concentración en paralelo, mida de acuerdo con las condiciones cromatográficas en 2.2, registre el área del pico y calcule la recuperación de la adición de muestra. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
2.9 Determinación del contenido de la muestra.
Mida con precisión 3 porciones de 2,0 ml de extracto acuoso de Cistanche deserticola, evapore hasta sequedad en un baño de agua, disuelva en metanol, lleve a un volumen constante en un matraz volumétrico de 10 ml, agite bien, filtre 0,22 μ con una membrana microporosa, mida de acuerdo con las condiciones cromatográficas en 2.2, registre el área del pico y calcule el contenido de equinácea. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 1: Resultados de las pruebas de recuperación de echinacósido.
Tabla 2 Resultados de la determinación del contenido de equinacósido en extracto acuoso de Cistanche herba
3. Discusión
3.1 Método de preparación del artículo de prueba.
El extracto acuoso de Cistanche deserticola contiene diversos componentes químicos como glicósidos de feniletanol y polisacáridos, que provocan ciertas interferencias con los componentes a ensayar. Este estudio investigó dos concentraciones diferentes de solventes, 50% metanol y metanol. Los resultados mostraron que el efecto de separación de los picos en el cromatograma del producto de prueba usando 50% de metanol como solvente fue pobre entre la equinácea y los componentes adyacentes. Al utilizar metanol como disolvente, la resolución del pico de glucósido de equinácea es buena y no hay interferencia de otros picos de impurezas. Por lo tanto, se seleccionó metanol como disolvente para la solución de prueba. Utilizando metanol como disolvente, el extracto acuoso de Cistanche deserticola se evaporó hasta sequedad en un baño de agua. Se utilizaron dos métodos de tratamiento: disolución de metanol, agitación a volumen constante y disolución ultrasónica de metanol (10 min). Los resultados mostraron que no había diferencias significativas entre los dos métodos. Se eligió este método para preparar la solución de prueba debido a la simple operación de disolución de metanol y agitación a volumen constante.
Cistanche de hierba china
3.2 Selección de fase móvil
En este estudio, se hizo referencia a la fase móvil (metanol-ácido fórmico al 0,1%) utilizada para la determinación del contenido de Cistanche deserticola en la Farmacopea China (Volumen I) (2015). Los resultados mostraron que el pico de glucósido de equinácea se amplió y hubo un fenómeno de vanguardia, que puede estar relacionado con la débil capacidad de elución de la fase móvil; Con referencia a la literatura relevante [12-13], se usó acetonitrilo-ácido acético al 0,5% como fase móvil, pero la forma del pico de la equinácea era deficiente y hubo un fenómeno de cola. Teniendo en cuenta el valor de pH de la fase móvil, finalmente se utilizó acetonitrilo-ácido fosfórico al 0,4% como fase móvil. Como resultado, el número teórico de picos de equinácea en la placa fue superior a 4000 y la resolución entre los picos de equinácea y los componentes adyacentes fue superior a 1,5. La forma del pico era simétrica, sin interferencia de los picos de impurezas, y la línea base era estable. Por lo tanto, en este estudio, se utilizó acetonitrilo-0,4% - 0.4% de ácido fosfórico como fase móvil cromatográfica para la determinación del contenido de equinácea. En este estudio, se utilizó el método HPLC para determinar la Equinácea en el extracto acuoso de Cistanche deserticola.
Extracto de cistanche en polvo
El método es simple, preciso y reproducible. Es adecuado para la determinación de equinácea en el extracto acuoso de cistanche deserticola y puede usarse como método de control de calidad para el extracto acuoso de cistanche deserticola. Este estudio sólo determinó el contenido de equinácea en el extracto acuoso de Cistanche deserticola. En el futuro, se prevé determinar el contenido de equinácea en la decocción compuesta de Cistanche deserticola para explorar el impacto de diversos factores sobre el contenido de equinácea, proporcionando una referencia para el control de calidad de la decocción que contiene Cistanche deserticola.
