La hipotermia inducida por oxcarbazepina después de una isquemia transitoria del prosencéfalo ejerce una neuroprotección terapéutica a través del potencial receptor transitorio vanilloide tipo 1 y 4 en jerbos, parte 3

4. Materiales y métodos

4.1. Animales experimentales

Se utilizaron jerbos machos (número total=252) a la edad de 6 meses (peso corporal, 63 a 78 g). Los jerbos fueron criados en el Centro Experimental de Animales de la Universidad Nacional Kangwon (Chuncheon, Corea).

Los jerbos son animalitos muy lindos. Viven en zonas desérticas, son buenos cavando cuevas y tienen un fuerte instinto para almacenar y localizar alimentos. Entre estos pequeños, los jerbos machos tienen una memoria especialmente buena, lo que hace que la gente quiera saber sus secretos.

En primer lugar, cuando los jerbos machos buscan comida, utilizan una serie de señales, como puntos de referencia y terreno, para determinar la dirección. A través de la observación y la práctica a largo plazo, han establecido su propio "sistema de información geográfica". Por el contrario, las hembras de jerbo tienen peor memoria para estas señales, especialmente en un entorno en constante cambio.

En segundo lugar, los jerbos machos también muestran una fuerte memoria cuando luchan contra enemigos naturales. Según los científicos, cuando los jerbos se ven amenazados, rápidamente entran en la madriguera e intentan escapar. Pero cuando se enfrentan a la misma amenaza, los jerbos macho recordarán el modo de ataque de los enemigos naturales y los evitarán, aumentando sus posibilidades de supervivencia.

Finalmente, la memoria de los jerbos machos también reside en su comportamiento social entre ellos. Cada jerbo tiene su olor único. Cuando conozcan a otros jerbos, utilizarán su sentido del olfato para identificar la identidad y el estado de cada uno. Esta capacidad de memoria no sólo permite a los jerbos establecer una conexión social relativamente estable, sino que también es una garantía importante para su reproducción.

En resumen, la relación entre los jerbos machos y la memoria es inseparable. En el proceso de búsqueda de supervivencia y reproducción en la naturaleza, confían en su fuerte memoria para adaptarse constantemente al entorno y mejorarse. Como humanos, debemos aprender de estos pequeños y perfeccionar constantemente nuestra memoria para adaptarnos mejor a este mundo en constante cambio. Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria, y Cistanche puede mejorar significativamente la memoria porque también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento, que son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro obtenga suficiente nutrición y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Para este estudio, el protocolo experimental fue aprobado (n.º de aprobación KW-200113-1; fecha de aprobación, 18 de febrero de 2020) por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales.

El protocolo de investigación se adhirió a las pautas sugeridas en las "Leyes y políticas internacionales actuales" de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por The National Academies Press (8ª Ed., 2011).

4.2. Grupos experimentales, inducción de tFI y tratamientos HyT y OXC.

Para probar los efectos protectores de OXC contra la lesión isquémica después de tFI en jerbos, los jerbos se dividieron en seis grupos: (1) grupo simulado + vehículo (n=24); (2) grupo tFI + vehículo (n {{5 }}); (3) grupo simulado+HyT (n=24); (4) grupo tFI+HyT (n=60); (5) grupo simulado + OXC (200 mg/kg) (n=24); y (6) grupo tFI+OXC (n=60).

Se utilizaron siete y cinco jerbos en los tres grupos de tFI para el análisis de transferencia Western y el examen histológico, respectivamente, a los 30 min, 12 h, 1 día, 2 días y 4 días después de la operación de tFI, y en los tres grupos simulados, siete y cinco. Se utilizaron jerbos a los 30 minutos y 4 días después de la operación simulada para minimizar el número. En este experimento, se desarrolló tFI como se describió anteriormente [34].

En resumen, los jerbos fueron anestesiados con isoflurano al 2,5% (en 32% de oxígeno y 68% de óxido nitroso). Bajo anestesia, ambas arterias carótidas comunes se aislaron de la vaina carotídea y se ocluyeron con clips de aneurisma (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Tuttlingen, Alemania). ) durante cinco minutos.

La perfecta parada del suministro de sangre al cerebro se confirmó mediante la observación del flujo sanguíneo arterial en ambas arterias retinianas (ramas de las arterias carótidas internas) utilizando un oftalmoscopio (HEINE K180®) de Heine Optotechnik (Herrsching, Alemania).

La temperatura corporal antes y durante la cirugía en todos los grupos se controló en normotermia (37 ± 0.2 ◦C) utilizando una manta termométrica. Después de cinco minutos de oclusión, se retiraron los clips.

En este estudio, se realizó una operación simulada sometiéndolos a la misma cirugía tFI sin la oclusión de las arterias carótidas comunes. Se controló HyT en los dos grupos simulado+HyT y tFI+HyT (similar al cambio en la temperatura corporal en el grupo tFI+ grupo OXC) enfriando todo el cuerpo con una bolsa de hielo durante seis horas.

La temperatura corporal de los dos grupos simulados + OXC y tFI + OXC se registró durante seis horas después de la inyección intraperitoneal inmediata de 200 mg/kg de OXC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) después de la operación con tFI.

La dosis de OXC se seleccionó basándose en un estudio anterior que informaba que 200 mg/kg de OXC protegían eficazmente contra la muerte celular en el cerebro después del [36]. Para registrar el cambio de temperatura corporal, se midió la temperatura corporal en el recto cada una hora después de tFI, durante un período de 6 h, a temperatura ambiente (alrededor de 22 ◦C).

Los jerbos recibieron un tiempo de recuperación de cuatro días después de tFI porque las células piramidales ubicadas en la región CA1 del hipocampo comienzan a morir cuatro días después de tFI [30,34,62].

4.3. Prueba de AME

La prueba SMA se realizó para examinar los cambios en la hiperactividad en todos los grupos. En resumen, como se describió anteriormente [63], la prueba de AME se realizó el día 1 después de tFI, ya que la actividad locomotora alcanza el punto más alto el día 1 después de la lesión isquémica después de tFI.

Los jerbos de todos los grupos recibieron adaptación ambiental durante dos horas y fueron colocados en una jaula de campo abierto (ancho, 44 ​​cm; largo, 44 ​​cm; altura, 30) obtenida de Ugo Basile SRL (Gemonio, Italia), en la que dos horizontales paralelas Se instalaron rayos infrarrojos de 4 × 8 desde el suelo, durante una hora. La SMA se registró utilizando un sistema de actividad Photobeam-Home Cage de San Diego Instruments (San Diego, CA, EE. UU.).

El movimiento (trayectoria y distancia total recorrida) se detectó mediante la interrupción del conjunto de haces infrarrojos producidos por las fotocélulas.

La SMA se monitorizó continuamente durante una hora y los datos se recogieron utilizando un analizador AMB de IPC Electronics (Cumbria, Reino Unido).

La recolección de datos se inició 15 minutos después de la habituación en la jaula de campo abierto. Finalmente, los resultados obtenidos se evaluaron como la distancia (metros) de movimiento en el período de prueba (una hora).

4.4. Pruebas de funciones cognitivas

4.4.1. RAMT

Para comparar la memoria espacial en todos los grupos, la RAMT se llevó a cabo según estudios precedentes [38,44]. Para esta prueba se utilizó un laberinto de brazos 8- radial de Stoelting Co (Wood Dale, IL, EE. UU.).

El instrumento del laberinto constaba de una plataforma central y ocho brazos (cada brazo tenía un ancho de 5 cm; un alto de 9 cm; un largo de 35 cm). Los jerbos fueron entrenados una vez al día durante tres días antes del.

Es decir, se colocó alimento en pellets obtenido de DBL Co (Chungbuk, Corea) en la parte final de cada brazo y cada jerbo se colocó en la plataforma central. A partir de entonces, el jerbo buscó el alimento.

Después de la operación simulada o tFI, la prueba real se llevó a cabo una vez al día durante cuatro días, comenzando un día después de la operación.

Para el análisis se evaluó el número de errores, ocurriendo un error cada vez que el jerbo ingresaba a un brazo que ya había sido visitado anteriormente. La prueba finalizó cuando el jerbo consumió el alimento.

4.4.2. PALMADITA

Para comparar la memoria a corto plazo entre los grupos, el PAT se realizó de acuerdo con los métodos informados previamente [64,65] con algunas modificaciones. En resumen, los jerbos fueron probados utilizando el sistema de evitación Gemini (GEM 392) de San Diego Instruments (SanDiego, CA, EE. UU.), que consta de dos compartimentos (claro y oscuro) que se comunican entre sí a través de una puerta deslizante vertical.

Las sesiones experimentales se realizaron en dos fases: una sesión de entrenamiento y una sesión de prueba real realizada un día antes y cuatro días después de la operación tFI o simulada.

La prueba real se realizó 20 minutos después de la sesión de entrenamiento midiendo el tiempo de latencia (segundos) durante la estancia en la habitación oscura. Es decir, en la sesión de entrenamiento, se permitió al jerbo explorar los dos compartimentos libremente durante un minuto mientras se abría la puerta. .

A partir de entonces, cuando el jerbo entró en el compartimento oscuro, se cerró la puerta y se le dio al jerbo una descarga eléctrica en el pie (0.5 mA) desde una rejilla de acero colocada en el suelo durante cinco segundos.

En la sesión de prueba real, el día 4 después de tFI, se colocó el jerbo en el compartimento de luz y se registró el tiempo de latencia en el compartimento de luz antes de entrar en el compartimento oscuro.

4.5. Análisis de transferencia Western para TRPV1 y TRPV4

Para examinar los niveles de expresión de TRPV1 y TRPV4 en el CA1 del hipocampo del jerbo, se realizó la técnica de transferencia Western de acuerdo con los métodos descritos previamente [66,67].

Brevemente, de acuerdo con el cronograma designado (30 min, 12 h, 1 día, 2 días y 4 días después de la operación simulada o tFI), a los jerbos (n=5 para cada grupo) se les administró anestesia para la eutanasia mediante inyección intraperitoneal con 200 mg/kg de pentobarbital sódico (JW Pharm.Co., Ltd., Seúl, Corea).

A partir de entonces, sus cerebros se recogieron y se homogeneizaron con solución salina tamponada con fosfato 50 mM (PBS, pH 7,4) que contenía 0.1 mM de etilenglicol-bis (aminoetiléter)-N, N, N{{ 11}}, ácido N0-tetraacético (EGTA) (pH 8.0), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 10 mM (pH 8,0), Nonidet P{{17) al 0,2 % }}, pirofosfato de sodio 15 mM, -glicerofosfato 100 mM, ortovanadato de sodio 2 mM, NaF 50 mM, NaCl 150 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM y ditiotreitol (DTT) 1 mM.

A continuación, se centrifugaron las muestras y se tomaron los sobrenadantes para determinar los niveles de proteína utilizando un kit de ensayo Micro BCA de Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EE. UU.) con albúmina de suero bovino de Pierce Chemical Co (Rockford, IL, EE. UU.).

Se hirvieron alícuotas que incluían 20 µg de proteína total en tampón de carga, Tris 150 mM (pH 6,8) que contenía dodecilsulfato de sodio (SDS) al 6%, DTT 3 mM, azul de bromofenol al 0,3% y glicerol al 30%.

Las muestras se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 10% (PAGE). A continuación, los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de Pall Co (East Hills, NY, EE. UU.) a 350 mA y 4 ◦C durante 90 min.

Para bloquear la tinción no específica, las membranas se incubaron en leche desgrasada al 5% durante 60 minutos a temperatura ambiente. A partir de entonces, se les hizo inmunorreaccionar con cada anticuerpo primario: anti-TRPV1 de conejo (diluido 1:1000) (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-TRPV4 de conejo (diluido 1:1000) (Abcam) y anti-- - de conejo. actina (diluida 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) a 4 ◦C durante 7 h.

Posteriormente, se hicieron reaccionar con IgG anti-conejo de burro conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (diluida 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.) a temperatura ambiente durante 1 h.

Finalmente, se utilizó un kit de quimioluminiscencia a base de aluminol de Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EE. UU.) para mejorar la visualización.

Como se describió anteriormente [68], las inmunotransferencias de TRPV1 y TRPV4 se analizaron utilizando el software Scion Image de Scion Crop (Frederick, MD, EE. UU.). Se escanearon las bandas y se realizó un análisis densitométrico. Los niveles de proteína se normalizaron frente al nivel correspondiente de actina.

4.6. Preparación de secciones histológicas.

Para los exámenes inmunohistoquímicos e histopatológicos, se sacrificaron jerbos (n=7 para cada grupo) según el programa designado (30 min, 12 h, 1 día, 2 días y 4 días después de tFI o operación simulada).

Como se describió anteriormente [34], los jerbos fueron anestesiados profundamente con pentobarbital sódico (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Seúl, Corea). Bajo anestesia, los jerbos se lavaron transcardialmente con solución salina tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) y se fijaron con paraformaldehído al 4% (en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4).

Posteriormente, se obtuvieron sus cerebros y se fijaron posteriormente utilizando el mismo fijador durante seis horas. A continuación, se cortaron los tejidos cerebrales (25 µm de espesor de planos coronales) en acriostato (Leica, Wetzlar, Alemania).

4.7. Tinción histoquímica mediante CV

Para examinar el daño morfológico y neuronal en el hipocampo de cada grupo, se realizó tinción con violeta de cresilo (CV) como describimos anteriormente [69]. En resumen, se disolvió acetato de violeta de cresilo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) al 1,0% (p/v) en agua destilada y ácido acético glacial (0.28 %) a esta solución. Las secciones se tiñeron y se montaron con bálsamo canadiense (Kanto, Tokio, Japón).

4.8. Tinción FJ B

Se realizó tinción con FJ B para examinar la degeneración neuronal (muerte o pérdida). Según el procedimiento publicado [34], las secciones de cerebro preparadas se empaparon en hidróxido de sodio al 1 %, se transfirieron inmediatamente a 0.0permanganato de potasio al 6 % y se hicieron reaccionar rápidamente con Fluoro-Jade B al 0,0004 % (Histochem , Jefferson, AR, EE.UU.).

Las secciones se lavaron brevemente y se colocaron en un calentador de portaobjetos (aproximadamente 50 ◦ C) para reaccionar con FJ B. Para evaluar el efecto terapéutico de OXC contra tFI, se contó el número de células FJ B+ en la región CA1 de acuerdo con un método publicado en [ 70].

Brevemente, se capturaron imágenes digitales de células FJ B+ de cinco secciones por jerbo utilizando un microscopio epifluorescente (Carl Zeiss) (Oberkochen, Alemania) a una longitud de onda de 450 a 490 nm. Las células se contaron en 250 µm2, que incluía el SP, en el centro de la región CA1 utilizando un sistema de análisis de imágenes (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, EE. UU.).

4.9. Inmunohistoquímica

Para investigar los cambios en la inmunorreactividad de NeuN, TRPV1 y TRPV4 en la región CA1, se realizó una inmunohistoquímica general. En resumen, según un método publicado [34], las secciones de cerebro preparadas se incubaron con anticuerpos primarios: anti-NeuN de ratón (diluido, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, EE. UU.), anti-TRPV1 de ratón (diluido, 1:500) (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y anti-TRPV4 de conejo (diluido, 1:500) (Abcam, Cambridge, Reino Unido).

Posteriormente, estas secciones incubadas se incubaron en los correspondientes anticuerpos secundarios (diluidos, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EE. UU.) y se desarrollaron utilizando Vectastain ABC (diluido, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). , EE.UU). Finalmente, estas secciones inmunorreaccionadas tuvieron color después de la visualización con 3,3'-diaminobencidina.

Los números de células NeuN+ se contaron de la siguiente manera. Se capturaron imágenes digitales de células NeuN+ de cinco secciones por jerbo utilizando un microscopio óptico (AxioM1) (Carl Zeiss, Alemania).

Las células se contaron de la misma manera que el recuento de células FJ B+. Para evaluar la densidad de las estructuras TRPV1+ y TRPV4+, se utilizaron las áreas correspondientes en la región CA1 en cinco secciones por animal. Se capturaron imágenes de las estructuras TRPV1+ y TRPV4+ utilizando un microscopio óptico AxioM1 (Carl Zeiss) (Alemania).

Las densidades de las estructuras TRPV{{0}} y TRPV4+ se evaluaron como la densidad óptica relativa (ROD). Para ello, las imágenes se transformaron al nivel de gris medio. El ROD se presentó como porcentaje utilizando Adobe Photoshop (versión 8.0) y el software NIH Image J (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.).

4.10. Análisis estadístico

Presentamos los datos como medias ± error estándar de la media (SEM). Todos los análisis estadísticos se realizaron con la ayuda de GraphPad Prism (versión 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, EE. UU.). Las diferencias en las medias entre los grupos experimentales se analizaron estadísticamente mediante análisis de varianza de dos factores (ANOVA) con una prueba de comparación múltiple de Bonferroni post hoc para dilucidar las diferencias relacionadas con tFI entre todos los grupos. La significación estadística se consideró en p < 0. 05.

Contribuciones de los autores: Conceptualización: M.-HW y T.-KL; Metodología, J.-CL y DWK; Software, H.-IK y MCS; Validación, JHA, IJK y JHP; Investigación, J.-CL, H.-IK y M.CS; Curación de datos, JHC, IJK y JHP; Redacción: preparación del borrador original, H.-IK y J.-CL; Redacción, revisión y edición, M.-HW; Supervisión, S.-SL; Administración de Proyectos, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL y T.-KL Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiamiento: Este trabajo fue apoyado por Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities for Research (FOUR, 4220200913807) financiado por la Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Corea, y por el Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Declaración de la Junta de Revisión Institucional: Los jerbos fueron criados en el Centro Experimental de Animales de la Universidad Nacional de Kangwon (Chuncheon, Corea). Para este estudio, el protocolo experimental fue aprobado (n.º de aprobación, KW-200113-1; fecha de aprobación, 18 de febrero de 2020) por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

El protocolo de investigación se adhirió a los lineamientos sugeridos en las "Leyes y Políticas Internacionales Actuales" de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por The National Academies Press (8ª Ed., 2011).

Declaración de Consentimiento Informado: No aplicable.

Declaración de disponibilidad de datos: Los datos presentados en este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

Agradecimientos: Los autores agradecen a Hyun Sook Kim y Seung Uk Lee por su ayuda técnica en este estudio.

Conflictos de intereses: Los autores han declarado que no existe ningún conflicto de intereses financieros.

Abreviaturas

CA1: subcampo Cornu Ammonis 1; SNC, sistema nervioso central; CV, violeta de cresilo; DG, giro dentado; FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, hipotermia; NeuN, núcleos neuronales; OXC, oxcarbazepina; PAT, prueba de evitación pasiva; ROD, densidad óptica relativa; AME, actividad motora espontánea; SO, estrato oriens; SP, estrato piramidal; SR, estrato radiado; tFI, isquemia transitoria del prosencéfalo; TRPV1, receptor vanilloide potencial transitorio tipo 1.

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