Identificación de ACOT13 y PTGER2 como nuevos genes candidatos de poliquistosis renal autosómica dominante a través de la secuenciación del exoma completo
Mar 20, 2022
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na du1, Dan Dong3, Luyao sol1, Lihe Che1, Xiaohua Li1, Yong Liu2*†y BinWang1*†
Resumen
Fondo:Poliquístico autosómico dominanteriñón(ADPKD) es la enfermedad monogénica más común.riñóntrastorno. La mitad de los pacientes progresarían lentamente a enfermedad renal terminal. Sin embargo, aún falta el objetivo potencial para el tratamiento de la ADPKD.
Métodos:cuatroADPKDEn este estudio se incluyeron pacientes y dos familiares sanos. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron y analizaron mediante la secuenciación del exoma completo (WES). Las mutaciones autosómicas en pacientes con ADPKD se mantuvieron como sitios candidatos. El enriquecimiento de Gene Ontology (GO), la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) y la red de interacción proteína-proteína (PPI) se realizaron mediante el paquete Cluster Roller R. Se descargó un conjunto de datos que contenía 18 pacientes con ADPKD y tres muestras normales de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) y se analizó con el paquete limma R.
Métodos:cuatroADPKDEn este estudio se incluyeron pacientes y dos familiares sanos. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron y analizaron mediante la secuenciación del exoma completo (WES). Las mutaciones autosómicas en pacientes con ADPKD se mantuvieron como sitios candidatos. El enriquecimiento de Gene Ontology (GO), la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) y la red de interacción proteína-proteína (PPI) se realizaron mediante el paquete Cluster Roller R. Se descargó un conjunto de datos que contenía 18 pacientes con ADPKD y tres muestras normales de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) y se analizó con el paquete limma R.
Conclusiones:A través de una combinación de WES, expresión génica y análisis de red PPI, identificamos ACOT13 y PTGER2 como posiblesADPKD-genes relacionados.
Palabras clave:Secuenciación del exoma completo, Mutaciones genéticas, Poliquísticariñónenfermedad, ACOT13, PTGER2
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Introducción
poliquisticoriñón(PKD) es un grupo de trastornos monogénicos y es la causa común de enfermedad renal en etapa terminal. La mayoría de los pacientes adultos se ven afectados por la forma autosómica dominante (ADPKD), mientras que la poliquística autosómica recesivariñón(ARPKD) es una forma más rara que generalmente se presenta de forma perinatal o en la primera infancia [1]. Las mutaciones en PKD1 y PKD2, que codifican las proteínas policistina 1 y 2 (PC1 y PC2), son las causas más comunes de ADPKD. PC2, un canal catiónico, es un miembro de la familia de canales iónicos de potencial receptor transitorio (TRP) [2]. Se informó que los defectos en PKD2 desencadenan cambios en el metabolismo energético mitocondrial [3]. los roles del complejo PC1 y PC1PC2 son poco conocidos [4]. Aunque la PKD se hereda de forma monogénica, es heterogénea en fenotipo, gen y alelo [1], y el 7 % de losADPKDlas familias no están resueltas genéticamente [5]. Además, los mecanismos moleculares que subyacen a larenaldisfunciónresultantes de mutaciones en los genes PKD y las funciones fisiológicas de las proteínas de policistina tampoco están claras [6].
Las proteínas 1 y 2 (PC1 y PC2) son las causas más comunes de ADPKD. PC2, un canal catiónico, es un miembro de la familia de canales iónicos de potencial receptor transitorio (TRP) [2]. Se informó que los defectos en PKD2 desencadenan cambios en el metabolismo energético mitocondrial [3]. los roles del complejo PC1 y PC1PC2 son poco conocidos [4]. Aunque la PKD se hereda de forma monogénica, es heterogénea en fenotipo, gen y alelo [1], y el 7 % de las familias de ADPKD no están resueltas genéticamente [5]. Además, los mecanismos moleculares que subyacen a la disfunción renal resultante de las mutaciones en los genes de la PKD y las funciones fisiológicas de las proteínas de policistina aún no están claros [6].
Aquí, realizamos la WES utilizando las muestras de sangre de cuatro pacientes con ADPKD y dos familiares sanos para analizar la variación de sus genes. Además, se obtuvo un conjunto de datos de expresión génica que contenía 18 pacientes con ADPKD y tres muestras normales de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO). A través de análisis integrados de mutación génica, expresión génica, enriquecimiento de la función génica e interacción proteína-proteína (PPI), identificamos dos genes (ACOT13 y PTGER2) que estaban potencialmente asociados con la patogénesis de ADPKD.
materiales y métodos
Información clínica
Este estudio fue aprobado por el comité de ética local (número de aprobación: 2019-307). Un paciente con PQRAD fue tratado en nuestro hospital y cinco miembros de esta familia fueron incluidos en este estudio. Este paciente tenía antecedentes de poliquistosisriñón enfermedad, poliquistosis hepática y cálculos renales durante 13 años (Archivo adicional 1: Tabla S1). El pedigrí de esta familia se muestra en la Fig. 1A. Te N_2 fue este probando. Te N_4, N_5 y N_6 eran todos pacientes con ADPKD (negros), mientras que N_3 y N_1 eran personas sanas (blancos) . En total, hubo cuatro pacientes con ADPKD y dos controles sanos en nuestro estudio. Los síntomas clínicos de este probando incluían fiebre, dolor de espalda y hematuria. El examen de tomografía computarizada (TC) de N_2 reveló múltiples quistes en el hígado y riñón poliquístico bilateral. Algunas lesiones eran quistes complejos, con cambios en el exudado perirrenal derecho de contornos borrosos y aumento de densidad (fig. 1B).
Secuenciación del exoma completo
El ADN del genoma se extrajo de muestras de sangre periférica con un kit de extracción de ADN (Tiangen Biotech, Beijing, China) y los exomas se capturaron con el kit Agilent SureSelect Human All Exon V6 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) de acuerdo con las instrucciones. de los equipos La secuenciación del exoma completo se realizó con los instrumentos Illumina Novaseq6000 con lecturas de secuenciación de 150-pb de extremos emparejados. Las lecturas de secuenciación sin procesar se preprocesaron para eliminar las bases de baja calidad y las lecturas utilizando un preprocesador FASTQ ultrarrápido todo en uno rápido [11], y se adoptaron los parámetros predeterminados. Las lecturas de secuencia se alinearon con el genoma humano (Build-UCSC hg19) utilizando el software BWA (Burrow–Wheeler Aligner, http://bio-bwa.sourceforge.net/). Se identificaron diez polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) e inserción/deleción (Indel) con el software SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/). Usando el software ANNOVAR (http://annovar.openbioinformat ics.org/en/latest/user-guide/download/), se realizó una anotación funcional para el SNP e Indel identificados para investigar sus ubicaciones genómicas e información de variación (Archivo adicional 2 : Tabla S2).
Detección de candidatos SNP/Indel para ADPKD
Primero eliminamos las mutaciones con frecuencias superiores al 1 por ciento en al menos una de las cuatro bases de datos (1000g_all, esp6500si_all, gnomAD_ALL y gnomAD_ EAS). Se retuvieron diez mutaciones en posiciones exónicas o de corte y empalme (10 pb corriente arriba y corriente abajo del exón). Pequeños fragmentos (<10 bp)="" non-frameshifting="" indel="" mutations="" in="" the="" repeat="" region="" were="" also="" removed.="" in="" addition,="" mutations="" that="" met="" one="" of="" the="" following="" conditions="" were="" retained:="" (a)="" te="" sites="" that="" were="" considered="" as="" harmful="" by="" at="" least="" half="" of="" the="" four="" software="" sift="" [12],="" polyphen="" [13],="" mutationtaster="" [14],="" and="" cadd="" [15]="" basing="" on="" the="" scores;="" (b)="" mutations="" that="" were="" predicted="" to="" affect="" the="" splicing="" by="" dbscsnv="" [16].="" ten,="" the="" genetic="" mutations="" that="" were="" classified="" into="" pathogenic="" and="" likely="" pathogenic="" ones="" according="" to="" the="" criteria="" and="" guidelines="" for="" grading="" clinical="" significance="" of="" single-gene="" mutations="" of="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" and="" genomics="" (acmg,="" https://www.acmg.net/)="" were="" selected="" as="" candidate="" sites.="" for="" the="" screening="" of="" dominant="" genetic="" pattern,="" on="" the="" basis="" of="" mutation="" site="" filtering,="" the="" sites="" showing="" autosomal="" mutations="" in="" adpkd="" patients,="" which,="" however,="" could="" not="" be="" detected="" in="" normal="" controls="" were="" retained="" as="" candidate="">
Enriquecimiento funcional y análisis PPI
Los datos del perfil de expresión de ARNm de GSE7869 [18] se descargaron de la base de datos GEO (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo), que se detectó en base a Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array . El conjunto de datos GSE7869 contenía 18 muestras de ADPKD y tres muestras normales. Los datos del perfil de expresión de ARNm se analizaron utilizando el paquete de funciones limma en R [19]. Los genes expresados diferencialmente (DEG) se seleccionaron utilizando los umbrales de valor absoluto de expresión diferencial (|Log2FC|) > 0.5 y valor P <>
análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R v3.5.2. El valor P < 0.05="" se="" consideró="" estadísticamente="" significativo="" en="" todos="" los="" análisis="">
Results
Mutatienal laDakota del NorteCarolina del Surape
El número total de SNP en las seis muestras se concentró entre 100,000 y 150,000, y se ubicaron principalmente en la región del intrón, la región del exón y la región intergénica (Fig. 2A). El número total de Indels en las seis muestras se concentró entre 15,000 y 20,000, y estos Indels se distribuyeron principalmente en la región intrónica e intergénica (Fig. 2B). A continuación, exploramos el panorama de las mutaciones que estaban ubicadas en la región de codificación. En consecuencia, los SNP de seis muestras en la región de codificación incluían principalmente mutaciones anónimas, sin sentido y stop-loss, cuyo número acumulado fue de casi 21,000 (Fig. 2C). Los Indels de seis muestras en la región de codificación consistieron principalmente en eliminación_sin desplazamiento de marco e inserción_sin desplazamiento de marco (Fig. 2D)
Posibles mutaciones y genes para ADPKD
Se seleccionaron seis genes mutantes, incluidos AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 y ADAM21, utilizando el patrón genético dominante. Estaban mutados heterocigotamente en muestras de ADPKD pero no mutados en muestras normales. No se ha informado que la mayoría de estos genes estén relacionados con la aparición de ADPKD. Mientras tanto, también se seleccionaron 19 genes según la nocividad de la mutación, incluidos MUTYH, USH2A, HBS1L, GLI3, SBDS, SND1, ABCA2, RPS6KA4, FLVCR1, ATIC, SCN11A, ATP6V1A, GLRA1, PRMT8, PKD1, INSL3, SUPT5H, NCF4 y GPR143. Para estudiar la relación entre esas mutaciones genéticas y la ADPKD, primero analizamos los efectos de las mutaciones genéticas en las proteínas. En consecuencia, todos esos genes tenían al menos una mutación que podría afectar la codificación de la proteína, lo que indica los roles potenciales de esas mutaciones (Tabla 1).
Vías KEGG significativamente enriquecidas y términos GO de posibles genes relacionados con ADPKD
Los resultados de los análisis de enriquecimiento GO y KEGG de los 25 genes potenciales asociados con ADPKD se muestran en la Fig. 3A (Proceso biológico), Fig. 3B (Componente celular), Fig. 3C (Función molecular) y Fig. 3D (KEGG) . El análisis GO mostró que estos 25 genes estaban significativamente enriquecidos en los procesos biológicos (BP) del proceso celular de un solo organismo y la respuesta al estímulo, los componentes celulares (CC) de la membrana plasmática y la periferia celular, y la función molecular (MF) de la unión de aniones. Además, el análisis de la vía KEGG reveló que estos 25 genes estaban enriquecidos principalmente en las vías de señalización del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y en las vías del cáncer.
ACOT13 y PTGER2 podrían ser genes candidatos asociados con ADPKD
El análisis de la red PPI se realizó para explorar la asociación entre los 25 genes potenciales relacionados con la PQRAD. Como se muestra en la Fig. 3E, la mayoría de esos genes eran independientes en la red. ACOT13 tuvo interacción directa con SBDS y ATIC; Se predijo que PTGER2, ADCY4 e INSL3 interactuarían entre sí (Fig. 3E). Además, ACOT13, PTGER2 y ADCY4 eran genes que solo mutaban en pacientes con ADPKD. , según los datos de expresión descargados de la base de datos GEO, comparamos los niveles de expresión de ACOT13, PTGER2 y ADCY4 entre los pacientes con ADPKD y los controles normales. En comparación con los controles normales, el nivel de expresión de ACOT13 fue significativamente menor en pacientes con ADPKD (Fig. 4A), mientras que PTGER2 presentó un nivel de expresión más alto en pacientes con ADPKD (Fig. 4B). ADCY4 no mostró una diferencia de expresión significativa entre los pacientes con ADPKD y las muestras normales (Fig. 4C). Combinando la información, especulamos que ACOT13 y PTGER2 podrían ser genes candidatos asociados con ADPKD.
Discusión
La ADPKD es causada por una mutación en uno de dos genes-78 por ciento de los casos son causados por una mutación en PKD1 en el cromosoma 16 y el 15 por ciento de los casos son causados por una mutación en PKD2 en el cromosoma 4 [20]. Las enfermedades renales quísticas también se han denominado ciliopatías. Las proteínas PC1 y PC2, codificadas por PKD1 y PKD2, están ubicadas en los cilios primarios y actúan como sensores de flujo en el riñón [21]. En este estudio, la mutación dañina en PKD1, así como otros 18 genes dañinos conocidos, se detectaron en las muestras de pacientes con ADPKD. Además, se examinaron seis mutantes, incluidos AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 y ADAM21, utilizando el patrón genético dominante y la mayoría de ellos no se habían reconocido previamente como genes patógenos relacionados con la PQRAD.
Las proteínas patógenas de la ADPKD son las principales responsables de transmitir información desde el entorno externo a las células [22]. Analizamos las funciones potenciales de los 25 genes identificados mediante análisis de enriquecimiento GO y KEGG. Los resultados mostraron que los BP del proceso celular de un solo organismo, la respuesta al estímulo, así como los CC de la membrana plasmática y la periferia celular se enriquecieron significativamente. Además, las células ADPKD pueden cambiar su modo de producción de energía de la fosforilación oxidativa a otras vías, y estas alteraciones en el metabolismo celular han surgido como un sello distintivo de ADPKD [6]. Las alteraciones en la modulación de la producción y utilización de energía en la ADPKD dependen de varias vías de señalización celular internas, como la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), la señalización de calcio en las membranas asociadas a las mitocondrias, el objetivo de mamífero del complejo 1 de rapamicina (mTORC1), cAMP y el transporte de iones mediado por el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) [23, 24]. Aquí, la vía de señalización de cAMP se identificó como la significativamente enriquecida en estas muestras de ADPKD. Estos resultados respaldan la confiabilidad de las mutaciones que examinamos. Mientras tanto, a pesar de que la información funcional fue revelada en parte por el análisis de enriquecimiento, más detalles de los 25 genes identificados merecían una mayor exploración en ADPKD en el futuro.
El PPI y los análisis de expresión diferencial indicaron que, en comparación con las personas normales, ACOT13 y PTGER2 estaban mutados y expresados diferencialmente en pacientes con ADPKD, y podrían ser genes potenciales asociados con ADPKD. La proteína ACOT13 es miembro de las enzimas acil-CoA tioesterasas (Acts), que catalizan la reacción de hidrólisis de moléculas de acil-CoA graso en ácidos grasos libres más CoASH. ACOT13 está enriquecido en tejidos oxidativos y está asociado con las mitocondrias [25]. Lin et al. informó que PC1 afectó la morfología y función de las mitocondrias, lo que podría desempeñar un papel clave en la regulación de la función mitocondrial y el metabolismo celular [26]. Hasta donde sabemos, no ha habido informes sobre la relación entre ACOT13 y ADPKD. La expresión de PTGER2 afecta el comportamiento biológico de varios tipos de tumores malignos [27–29], lo que debería estar relacionado con el enriquecimiento de las vías en el cáncer en el análisis KEGG. Por lo demás, ya se ha estudiado el papel de la prostaglandina E (2) (PGE2) en la cistogénesis en modelos genéticamente no ortólogos de ADPKD. Liu et al. encontraron que la PGE2 podría activar las vías de señalización aberrantes en los epitelios deficientes en PC-1- y mediar en la proliferación y secreción de cloruro en el epitelio renal quístico de la PQRAD [30]. Elberg et al. han indicado el papel de PTGER2 en la mediación del efecto de PGE2 en la inducción de la formación del quiste a través de análisis combinados bioquímicos, farmacológicos y funcionales en ADPKD [31]. Esto confirma aún más la fiabilidad de nuestro enfoque sobre la detección de genes patógenos en ADPKD, que puede ser aplicable en otras enfermedades. También respalda indirectamente la confiabilidad de ACOT13 como un gen potencial relacionado con ADPKD. Sin embargo, la función biológica subyacente de ACOT13 en ADPKD aún justifica más estudios.
Conclusiones
En este estudio, identificamos dos posibles genes relacionados con la PQRAD, incluidos ACOT13 y PTGER2, mediante el análisis de los resultados de WES de cuatro pacientes con PQRAD y dos familiares sanos combinados con los datos de expresión génica de la base de datos GEO. Nuestros resultados pueden ser útiles para estudios adicionales sobre las causas patológicas subyacentes de la PQRAD. Sin embargo, debido al pequeño número de pacientes en nuestro estudio, sigue existiendo cierta incertidumbre sobre el papel potencial de ACOT13 y PTGER2, lo que aún justifica más estudios.
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