Identificación de EST sensibles al peróxido de hidrógeno involucrados en la biosíntesis de glucósidos feniletanoide en el cultivo celular de salsa cistanche

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

J. CHEN y otros

Abstracto
El peróxido de hidrógeno es un elicitor abiótico eficaz que puede inducir la biosíntesis de metabolitos secundarios en las plantas. Demostramos que en el cultivo de suspensión celular de una planta medicinal tolerante a la salCistanchesalsa, la producción de componentes bioactivosfeniletanoideGlucósidos(PeGs) aumentó después del tratamiento con H2O2. Identificar genes relacionados con PeGs(feniletanoideglucósidos)biosíntesis afectada por H2O2, construimos una biblioteca de hibridación sustractiva de supresión de genes sensibles a H2O2 utilizando unCistanchesalsalínea celular e identificó 105 etiquetas de secuencia expresada (EST) y 85 genes. La anotación funcional de la biblioteca EST y los análisis de ontología génica mostraron genes relacionados con diversas respuestas al estrés, biosíntesis de metabolitos secundarios y regulación transcripcional. Entre ellos, identificamos dos genes relacionados con los PeGs.(feniletanoideglucósidos)vía de biosíntesis (4-cumarato coenzima A ligasa y cinamato 4-hidroxilasa), y dos factores de transcripción de tipo WRKY. Las expresiones de genes seleccionados después del tratamiento con H2O2 fueron analizadas por RT-qPCR. Aumento temprano de la transcripción de PeG(feniletanoideglucósidos)Los genes de la vía de la biosíntesis después del tratamiento revelaron que los PeG inducidos por H2O2(feniletanoideglucósidos)biosíntesis a través de la regulación ascendente de sus genes clave.
Palabras clave adicionales: cinamato-4-hidroxilasa, 4-cumarato coenzima A ligasa, supresión hibridación sustractiva.Cistanchesalsa.feniletanoideGlucósidos.

Introducción

Cistanchesalsaes un parásito de plantas perennes en la raíz de Haloxylos ammodendrun, y crece en la zona desértica del oeste de China. Durante siglos,Cistanchela especie se ha utilizado como medicina herbal tradicional (Wang et al. 2012). Los componentes bioactivos sonfeniletanoideGlucósidos(PeGs) que tienen un efecto notable en la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS), la protección contra la radiación, la mejora de la inmunidad y el antienvejecimiento (Nan et al. 2013). Clavijas(feniletanoideglucósidos)biosíntesis enCistanchese inicia a partir de fenilalanina (Fig. 1 Suppl.) y el ácido cafeico sintetizado se glicosila aún más para formar varios PeGs(feniletanoideglucósidos)(Wang et al. 2012). Tres PeG principales(feniletanoideglucósidos), echinacoside, acteoside, y 2'-acetylacteoside, se consideran los componentes más activos enCistanche(Kobayashi et al. 1984). Con el fin de mejorar su contenido enCistancheCultivo celular, se han probado varios elicitores, incluidos quitosano, putrescina, Ag + y estrés osmótico (Ouyang et al. 2005a, b, Cheng et al. 2005, 2006, Liu et al. 2007, Liu y Cheng 2008). Sin embargo, los genes involucrados en PeGs(feniletanoideglucósidos)biosíntesis enCistanche, principalmente genes de la vía del metabolismo de la fenilalanina, rara vez se han identificado. Sólo un gen que codifica fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) fue identificado recientemente en Cistanche deserticola (Hu et al. 2011). Otros genes que codifican, por ejemplo, la cinamato-4-hidroxilasa (C4H), que podría catalizar la conversión de cinamato en ácido cumárico, y la 4-cumarato coenzima A ligasa (4CL), un gen esencial para las biosíntesis de lignina y flavanoides, no se han encontrado enCistanche.
Utilizamos el cultivo celular deCistanchesalsapara estudiar PeGs(feniletanoideglucósidos)biosíntesis y expresión de genes relacionados. También investigamos el efecto de un elicitor eficaz H2O2 sobre los PeG(feniletanoideglucósidos)biosíntesis. Además, para encontrar genes sensibles tempranos involucrados en PeGs(feniletanoideglucósidos)biosíntesis, llevamos a cabo la hibridación sustractiva de supresión (SSH) para construir una biblioteca de ADNc de genes sensibles al H2O2.

Figura 1. Expresión génica relativa determinada por RT-qPCR después del tratamiento con H2O2. CsWRKY1 - Factor de transcripción WRKY (Contig07), CsC4H1 - cinamato 4-hidroxilasa (Contig09), Cs4CL1 - 4-cumarato: ligasa (Contig03), CsHSP1 - proteína de choque térmico 70 kDa (Contig 01) y CsSOD1 - superóxido dismutasa (Contig16). Las células se trataron con 80 μg dm-3 H2O2 en un medio líquido durante 2 h y las expresiones se compararon con un control tratado con agua. Medias +- SD de tres repeticiones biológicas; * - P< 0.05,="" **="" -="" p=""><>

Materiales y métodos

La línea celular CS2001 se estableció a partir de pétalos deCistanchesalsa(C.A. Mey.) Beck recolectó en la provincia de Neimenggu y subcultó. El método de cultivo fue similar a un protocolo publicado anteriormente (Liu et al. 2007). En general, un murashige sólido y Skoog (1962; MS) medio se utilizó para el subcultivo y un medio líquido para PeGs(feniletanoideglucósidos)biosíntesis (fue el medio MS modificado suplementado con 30 g de glucosa dm-3 y 2,0 mg de ácido indol-3-acético). Para el tratamiento con H2O2, 5,0 ± 0,2 g de células en un período de crecimiento rápido, generalmente de 20 a 30 d después de que se subcultivaron en el medio sólido, se inocularon en un medio líquido de 50 cm3 en un matraz Erlenmeyer de 250 cm3 y se cultivaron en la oscuridad con o sin diferentes concentraciones de H2O2. Los PeGs(feniletanoideglucósidos)El contenido después de la inducción de 10 d por H2O2 se analizó de acuerdo con un método publicado anteriormente (Liu et al. 2007) basado en cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa con elución de gradiente de metanol.

Las células 2 h después del tratamiento con H2O2 se recogieron del medio mediante papel de filtro utilizando un embudo de Büchner, y luego se congelaron en nitrógeno líquido y se molieron en polvo. Cada 2 g de polvo celular se lisaron utilizando una mezcla de 1 cm3 de 2-mercaptoetanol, 1 cm3 de 200 g de sarcosil dm-3 y 8 cm3 de un tampón GTC (isotiocianato de guanidinio 5 M, Tris-HCl de 62,5 mM, pH 8,0, 6,25 mM de EDTA, pH 8,0, 5 mM de tiourea y 10 mM de ditiotreitol). Las células se incubaron en hielo durante 15 min, luego se añadió 1/3 de volumen de CH3COOK de 8,5 M, pH 6,0, y las células se incubaron en hielo durante 15 min y luego se centrifugaron a 15 000 g durante 15 min. El sobrenadante se agregó a un volumen igual de isopropanol para precipitar el ARN total. El ARN total fue purificado aún más por un mini kit RNeasy (Qiagen, Hilden, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN mensajero se aisló del ARN total utilizando un kit midi de ARNm de Oligotex (Qiagen).

feniletanoideGlucósidosenCistancheSalsa

Se generó una biblioteca SSH a partir de muestras de células de control y 30 % de H2O2 obtenidas 2 h después de la elicitación utilizando un kit de sustracción de ADNc seleccionado por PCR (Clontech, Mountain View, EE. UU.). Para la construcción de bibliotecas, los productos se purificaron por separado utilizando un kit de purificación de gel (Qiagen) y se clonaron en un vector pGEM utilizando un kit de clonación TA (Tiangen, Beijing, China). Los plásmidos de clones independientes se aislaron y secuenciaron utilizando un cebador T7. Todas las secuencias de etiqueta de secuencia expresada (EST) de la biblioteca (con las secuencias vectoriales eliminadas) se utilizaron para el ensamblaje de contig con CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3). Los EST se agruparon en contigs y singletons; se utilizaron para la búsqueda de homología utilizando el programa BLASTx en NCBI (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Las secuencias se anotaron, analizaron y clasificaron de acuerdo con los términos de ontología génica (GO) utilizando Blast2GO (http://www. blast2go.com).
La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) se realizó según Bustin et al. (2009). Las muestras de ADNc se sintetizaron utilizando un kit de reactivos PrimeScript RT (Takara, Dalian, China) a partir de 0,5 μg de ARN total. RT-qPCR se llevó a cabo utilizando kits SYBR Premix Ex Taq II y ROX plus (Takara) en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, USA) con tres réplicas técnicas. Los cebadores se diseñaron utilizando el software en línea Primer3 de acuerdo con las instrucciones suministradas por Takara; Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1 Suppl. Las expresiones génicas se normalizaron a ARN 18S, cuya expresión fue estable en todas las muestras.

Los resultados fueron analizados utilizando R versión 3.1.1, la significación de las diferencias fue verificada por la prueba t de Student.

Resultados

El peróxido de hidrógeno indujo la biosíntesis de los tres PeG principales(feniletanoideglucósidos)enCistanchesalsacélulas de suspensión (Tabla 1) pero sin efecto evidente sobre el crecimiento celular (Fig. S2). El contenido de equinacósido aumentó ya después del tratamiento con 10 μg dm-3 H2O2 (P< 0.05),="" a="" higher="" increase="" was="" recorded="" after="" the="" 20="" μg="" dm-3="" h2o2="" treatment="" (p="">< 0.01),="" and="" the="" highest="" increase="" was="" after="" the="" 40,="" 80,="" and="" 160="" μg="" dm-3="" h2o2="" treatments.="" similar="" results="" are="" shown="" for="" acteoside,="" but="" its="" content="" peaked="" after="" the="" 80="" μg="" dm-3="" h2o2="" treatment.="" the="" biosynthesis="" of="" 2'-acetylacteoside="" was="" less="" sensitive="" to="" h2o2="" treatment;="" a="" significant="" increase="" of="" its="" content="" (p="">< 0.05)="" was="" at="" h2o2="" concentrations="" over="" 40="" μg="" dm-3.="" after="" the="" 80="" μg="" dm-3="" h2o2="" treatment,="" the="" amount="" of="" all="" the="" three="" main="" pegs="">(feniletanoideglucósidos)aumento significativo (P< 0.01)="" over="" the="" control.="" therefore,="" this="" concentration="" was="" used="" in="" further="">
Para generar una biblioteca enriquecida para genes de respuesta temprana que están regulados por H2O2, utilizamos ADNc deCistanchesalsacélulas de suspensión tratadas con 80 μg dm-3 H2O2 durante 2 h. La secuenciación de paso único 129 clones recombinantes en la biblioteca SSH produjo 105 EST limpios después de la exclusión de la secuencia vectorial. Estos EST transparentes fueron utilizados para el ensamblaje por CAP3, y se generaron 18 contigs y 67 singletons (Tabla 2). Así, se aislaron 85 genes en esta biblioteca. La longitud media de los 105 EST limpios fue de 527 pb, lo que es adecuado para una clasificación funcional basada en la similitud de secuencia.

feniletanoideGlucósidosenCistancheSalsa

Los 85 genes obtenidos en la biblioteca fueron recuperados por BLASTx contra la base de datos de proteínas no redundantes genBank para la similitud de secuencia (valor E ≤ 0,001). Veintiún genes no mostraron éxitos en la base de datos, podrían ser específicos deCistanchesalsa. Los resultados con BLASThits se importaron al software Blast2GO para realizar más análisis de enriquecimiento de la vía GO y KEGG. De los 64 genes con blast hits, 50 fueron anotados de acuerdo con la descripción de genes homólogos de otras especies. Los genes anotados fueron nombrados de acuerdo con la descripción de los golpes BLAST. El análisis GO (Fig. 3 Suppl.) muestra que entre estos 50 genes, había 14 genes implicados en las respuestas a los estímulos, y más de 30 genes relacionados con los procesos metabólicos (Tablas 1 y 2). Entre estos genes, se aislaron dos homólogos de genes de la vía de biosíntesis PeG como se esperaba: la 4-cumarato coenzima A ligasa (llamada Cs4CL1: Contig03) y la cinamato 4-hidroxilasa (llamada CsC4H1: Contig14). Además, se realizó RT-qPCR para confirmar las expresiones inducidas de genes de la biblioteca después del tratamiento con H2O2.

Para confirmar que los genes esenciales identificados a partir de la biblioteca SSH respondían al tratamiento con H2O2, las expresiones de dos PeG(feniletanoideglucósidos)Los genes relacionados con la vía de la biosíntesis (Cs4CL1, CsC4H1), dos genes inducidos por ROS (CsSOD1: Contig 16, CsHSP1: CISTH099) y un gen similar al factor de transcripción de la familia WRKY (CsWRKY1: Contig 07) se midieron mediante RT-qPCR después del tratamiento con H2O2 (Fig. 1). Las expresiones CsC4H1, Cs4CL1, CsSOD1 y CsWRKY1 se regularon al alza más de 15 veces, 3 veces, 45 veces y 4 veces, respectivamente 2 h después del tratamiento con H2O2. La expresión de CsHSP1 se alteró sólo 1,8 veces después del tratamiento con H2O2.
El curso temporal de las expresiones de CsWRKY1, CsC4H1 y Cs4CL1 después del tratamiento con H2O2 se analizó más a fondo mediante RT-qPCR (Fig. 2). Las expresiones de CsC4H1 y Cs4CL1 aumentaron mucho (más de 80 veces y 50 veces, respectivamente) después del tratamiento de 16 h y luego se regularon a la baja después de 32 h. La expresión de CsWRKY1 se reguló al alza más de 20 veces a las 4 h y luego disminuyó a partir de las 8 h posteriores (Fig. 2).

Figura 2. La expresión relativa de CsWRKY1 (A), CsC4H1 (B) y Cs4CL1 (C) en diferentes momentos después del tratamiento con 80 μg dm-3 H2O2. Las expresiones se normalizaron a un control; (tratado con agua). Medias +- SD de tres repeticiones biológicas; * - P< 0.05,="" **="" -="" p=""><>

Discusión

El peróxido de hidrógeno es un conocido elicitor vegetal que muestra diversos efectos en las plantas. Al igual que ros, puede inducir el sistema de eliminación de ROS compuesto de superóxido dismutasa, catalasa, peroxidasas, etc., y sirve como la señal aguas abajo de sal, osmótica y deshidratación.

(Wi et al. 2006, Kar 2011, Furlan et al. 2013, Sathiyaraj et al. 2014). Se sugirió que la generación de H2O2 en las plantas se acompaña de biosíntesis inducida de metabolitos secundarios en elCistanchesalsacultivo celular. Como era de esperar, nuestros resultados revelan que los PeGs(feniletanoideglucósidos)biosíntesis en elSalsa cistancheel cultivo celular fue inducido después del tratamiento con H2O2 (Tabla 1). El contenido de tres PeG principales(feniletanoideglucósidos)aumento después del tratamiento con H2O2, lo que indica su papel fundamental en la biosíntesis de PeG. Los genes enriquecidos en la biblioteca SSH sugirieron además su efecto sobre los PeG(feniletanoideglucósidos)inducción de biosíntesis enSalsa cistanche.

Muchos genes conocidos sensibles al H2O2, como la ascorbato peroxidasa (CISTH069, Karyotou y Donaldson 2005), la h-quinona oxidorreductasa (CISTH125, Bello, et al. 2001), CsSOD1, CsHSP1 (Baruah et al. 2014) y los genes de respuesta a la resistencia a la enfermedad (Contig10, Nanda, et al. 2010), se enriquecieron en la biblioteca SSH (Tabla 3, Tabla 2 Suppl.). Algunos de estos genes sensibles a ROS típicos con una expresión inducida después del tratamiento con H2O2 fueron confirmados por RT-qPCR (Figs. 1 y 2), lo que indica que aquí se construyó una biblioteca SSH calificada. Dos genes de la vía de biosíntesis de PeG, CsC4H1 y Cs4CL1, también se encontraron en esta biblioteca y estas dos expresiones génicas fueron inducidas por el tratamiento con H2O2 de manera dependiente del tiempo (Fig. 2). Sugiere que el tratamiento con H2O2 indujo PeGs(feniletanoideglucósidos)biosíntesis a nivel genético a través de la regulación de genes de la vía PAL. Sin embargo, PAL y otros genes de biosíntesis de PeG aguas abajo (Wang et al. 2012) no se identificaron en la biblioteca SSH; puede deberse a que la biblioteca no se ha secuenciado lo suficiente. Una relación entre las expresiones inducidas por CsC4H1 y Cs4CL1 y un aumento de la biosíntesis de PeG después del tratamiento con H2O2 debe aclararse mediante un análisis adicional.

Además de los genes de la vía PAL inducidos por el tratamiento con H2O2, se encontraron dos factores de transcripción de la familia WRKY (CsWRKY1, CsWRKY2) en la biblioteca SSH (Tabla 3 y Tabla 2 Suppl.), y se confirmó una expresión inducida por CsWRKY1 mediante RT-qPCR. Su expresión fue sensible al tratamiento con H2O2 antes de la expresión de dos genes de la vía PAL, Cs4CL1 y CsC4H1 (Fig. 2). A partir de estudios previos, se ha observado la coexpresión de algunos factores de transcripción WRKY y genes de la vía PAL en el arroz (Gupta et al. 2012). Además, la expresión del gen PAL está regulada al alza en un mutante de sobreexpresión OsWRKY03 (Liu et al. 2005). Los dos factores de transcripción de la familia WRKY mencionados anteriormente también podrían estar involucrados en PeGs(feniletanoideglucósidos)biosíntesis enCistanchesalsa. Curiosamente, se encontraron EST relacionadas con la deshidratación (CISTH067, CISTH064) en la biblioteca de SSH, lo que puede sugerir que el tratamiento con H2O2 estaba relacionado con la expresión de genes sensibles a la deshidratación enCistanchesalsacomo se observa en otras plantas (Schmidt et al. 2013, Zhou et al. 2013). Un gen relacionado con la señalización de giberelina (GA), el receptor de giberelina gid1b-like (CISTH092), se identificó en la biblioteca SSH que implica la conexión de la señalización de GA y el tratamiento con H2O2 enCistanchesalsa, que también se informó en cebada (Bahin et al. 2011). Sin embargo, se necesitan más estudios para confirmar si estos genes están relacionados con los PeG.(feniletanoideglucósidos)biosíntesis. Aparte de los genes mencionados anteriormente, la biblioteca SSH construida aquí también presenta genes con o sin golpes BLAST. Mejora nuestra comprensión del efecto H2O2 sobre C. salsa y, en primer lugar, proporciona la información de sus genes involucrados en la biosíntesis de PeGs.

En conclusión, se evaluó el efecto del H2O2 sobre los PeG(feniletanoideglucósidos)inducción en elCistanchesalsacultivo celular. La biblioteca SSH se construyó después del tratamiento con H2O2, y la expresión de genes seleccionados se confirmó mediante RT-qPCR. Se identificaron dos genes relacionados con la vía de biosíntesis de PeG y otros genes sensibles al H2O2. Estos hallazgos ampliarán nuestra comprensión de los PeG inducidos por H2O2(feniletanoideglucósidos)biosíntesis enCistanchesalsaa nivel molecular, proporcionando la información para la manipulación génica deCistanchesalsacultivos celulares para mejorar los PeGs(feniletanoideglucósidos)producción.

De: 'Identificación de EST sensibles al peróxido de hidrógeno implicados en la biosíntesis de glucósidos feniletanoide en cultivo celular de salsa cistanche' porJ. CHEN et al.

--- BIOLOGIA PLANTARUM 59 (4): 695-700, 2015 J. CHEN et al. DOI: 10.1007/s10535-015-0541-y

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