Fondo.Agudolesión renal(IRA) es una complicación frecuente de la cirrosis descompensada con aumento de la mortalidad. Los biomarcadores tradicionales, como la creatinina sérica, no son sensibles para detectar lesiones sin cambios funcionales. Nuestra hipótesis es que los exosomas urinarios pueden llevar marcadores que diferencian el tipo delesión renalen pacientes cirróticos.

Métodos.Este es un estudio prospectivo, de un solo centro y observacional de pacientes adultos con cirrosis. Los grupos de pacientes incluyeron controles normales sanos, cirrosis compensada con normalFunción del riñón, cirrosis descompensada con normalidadFunción del riñóny cirrosis descompensada con LRA. Los datos se extrajeron de la historia clínica electrónica, incluida la etiología de la enfermedad hepática, la puntuación MELD, el historial de descompensación, la puntuación de Child-Turcotte-Pugh, el historial de LRA y la exposición a medicamentos. Se recogieron muestras de orina en el momento del consentimiento. Se analizó el contenido de proteínas de exosomas en orina y los datos proteómicos se validaron mediante inmunotransferencia. El análisis estadístico incluyó un análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales junto con la importancia variable en la identificación de la proyección.

Resultados.Se inscribieron dieciocho sujetos cirróticos y se extrajeron seis sujetos de control sanos de nuestro biorepositorio. Se aislaron exosomas de orina y se identificaron 1572 proteínas. La maltasa-glucoamilasa fue la principal proteína discriminante confirmada por Western Blot.

Conclusiones. Los pacientes con cirrosis y LRA tienen una regulación al alza de la disacaridasa del borde en cepillo renal, MGAM, en los exosomas urinarios, lo que puede diferenciar el tipo delesión renalen cirrosis; sin embargo, la importancia clínica de esto requiere una mayor validación.

Para obtener más información, póngase en contacto:joanna.jia@wecistanche.com

Lesión renal agudaser tratado porcistanche

1. Introducción

Agudolesión renal(AKI) ocurre en aproximadamente el 20 por ciento de los pacientes hospitalizados con cirrosis [1, 2]. La LRA en pacientes cirróticos hospitalizados suele ser progresiva, grave y un predictor negativo independiente de mortalidad [3]. *La causa más común de AKI en la cirrosis es hemodinámica, que representa el 70 por ciento de los casos. La necrosis tubular aguda (NTA) representa el 30 por ciento de los casos, y las causas posrenales son raras y representan menos del 1 por ciento de los casos. El síndrome hepatorrenal (SHR) es hemodinámico sin una característica identificable.lesión renalo enfermedad y ocurre en aproximadamente el 20 por ciento de los pacientes con cirrosis [4, 5].

La creatinina sérica (Scr) es el biomarcador más utilizado para evaluarFunción del riñóne identificarlesión renal. Sin embargo, la SCR es subóptima en pacientes cirróticos según Hindawi Critical Care Research and Practice Volume 2019, por numerosas razones, entre ellas, disminución de la producción hepática, atrofia muscular con reservas disminuidas, mayor volumen de distribución y desnutrición proteico-calórica. Los valores promedio de Scr son más bajos en pacientes cirróticos en comparación con la población general, lo que resulta en un diagnóstico tardío de LRA según la definición actual de LRA [6]. Además, Scr es un biomarcador deFunción del riñóny no es un marcador sensible de lesión. Han surgido nuevos biomarcadores de lesión renal para mejorar la detección de AKI y ayudar a diferenciar la etiología de AKI.Daño en el riñónbiomarcadores que incluyenlesión renalmolécula-1 (KIM-1), lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL), interleucina-18, proteína de unión a ácidos grasos del hígado (L-FABP), proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina -7 (IGFBP-7), y el inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2 (TIMP-2) pueden estar elevados antes de un aumento en la detección mejorada de Scr deDaño en el riñónsin cambio funcional [7]. Los estudios han demostrado que estos biomarcadores pueden diferenciar la etiología de la LRA [8, 9]. Los biomarcadores mejorados para detectar y diferenciar AKI representan importantes necesidades clínicas no satisfechas en pacientes con cirrosis.

Los exosomas son nanovesículas que se liberan de las células vivas como mecanismo de comunicación intercelular [10]. *Se ha demostrado que el contenido de proteínas de los exosomas se modifica notablemente en condiciones patológicas o de estrés [11–13]. En elriñón,los exosomas se entregan a la orina desde todos los tipos de células [14, 15], y los exosomas urinarios pueden considerarse potencialmente como la firma bioquímica del sujeto. Dado que los exosomas urinarios no se analizan de forma rutinaria, pueden proporcionar información adicional no reconocida sobre biomarcadores proteicos de LRA en pacientes con cirrosis.

El objetivo de este estudio fue evaluar la proteómica del exosoma urinario en pacientes con cirrosis y LRA en comparación con sujetos sanos. Presumimos que el contenido de proteína del exosoma urinario difiere en pacientes con cirrosis compensada o descompensada que experimentan AKI en comparación con sujetos de control sanos normales. Además, postulamos que el contenido diferencial de proteínas exosomales en la orina ofrecería información sobre los mecanismos delesión renalen cirrosis.

2. Materiales y métodos

Este es un estudio prospectivo, de un solo centro y observacional de pacientes adultos con cirrosis. Todos los pacientes del estudio fueron reclutados del sistema de salud de UC San Diego entre el 1 de julio de 2013 y el 1 de junio de 2014 y dieron su consentimiento informado. Los pacientes eran elegibles para la inclusión si tenían un diagnóstico de cirrosis y podían proporcionar una muestra de orina. La cirrosis se determinó mediante biopsia hepática, imágenes transversales o clínicamente (a través de la identificación de un evento de descompensación según lo determinado por un hepatólogo). Los datos se extrajeron de los registros de salud electrónicos, incluidos datos demográficos, antropométricos, signos vitales, problemas médicos comórbidos, etiología de la cirrosis, complicaciones de la cirrosis (ascitis, várices, encefalopatía hepática y carcinoma hepatocelular), antecedentes de LRA oenfermedad renal cronicay exposiciones a medicamentos dentro de los 30 días posteriores a la inscripción. Solo los pacientes con datos clínicos completos y pruebas de laboratorio dentro de los 30 días posteriores a la inscripción fueron elegibles para su inclusión en este estudio. Los pacientes fueron clasificados en grupos de la siguiente manera:

(1) Grupo 0: controles sanos normales

(2) Grupo 1: cirrosis compensada (Child-Turcotte-Pugh clase A, MELD 10) sin antecedentes de LRA y normalFunción del riñón

(3) Grupo 2: cirrosis descompensada (Child-Turcotte-Pugh clase B o C) sin antecedentes de LRA y normalFunción del riñón

(4) Grupo 3: cirrosis descompensada (clase B o C de Child-Turcotte-Pugh) y LRA

NormalFunción del riñónse definió como una TFG estimada > 60 ml/min/1,73 m2 (fórmula MDRD), sin albuminuria y sin antecedentes de LRA. La LRA se definió de acuerdo con los criterios de AKIN: aumento de Scr de 0,3 mg/dl en 48 horas o aumento del 50 por ciento en Scr desde el inicio [16]. Los pacientes con LRA fueron reclutados durante las admisiones y consultas del servicio de hepatología para pacientes hospitalizados si tenían muestras de sangre y orina obtenidas durante el episodio de LRA. El cuarto grupo de controles sanos se extrajo de un biodepósito normal y sano en el Centro O'Brien de UCSD para la Investigación de AKI en la Facultad de Medicina de UC San Diego. *Este trabajo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California, San Diego.

2.1. Muestreo y procesamiento de orina para el aislamiento de exosomas.

La orina se centrifugó a 3000 ×g durante 30 min. El pH del sobrenadante se ajustó a 7, se dividió en alícuotas y se congeló a -80 grados C. Los exosomas se prepararon utilizando precipitación inducida por polietilenglicol (PEG-) [17]. * Las muestras de orina mezcladas con PEG se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 horas y se centrifugaron a 10 000 × g durante 30 minutos. * El sedimento se resuspendió en Tris 10 mM con sal EDTA-Na 1 mM. *Este paso se repitió dos veces para eliminar las impurezas. Se realizó SDS PAGE unidimensional de las proteínas del exosoma antes de la tripsinización en gel para evitar la confusión [18].

2.2. Análisis Proteómico.

El gel se cortó a 1 mm × 1 mm y se destiñó 3 veces usando 100 µL de bicarbonato de amonio 100 mM durante 15 minutos, seguido de 100 µL de acetonitrilo (ACN) durante 15 minutos [19 ]. *El sobrenadante se liofilizó y el sedimento resultante se redujo con 200 µL de bicarbonato de amonio 100 mM-10 mM DTT y se incubó a 56 grados durante 30 minutos. Después de eliminar el líquido, se añadieron piezas de gel a 200 µl de bicarbonato amónico 100 mM-55 mM yodoacetamida. *Se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. *Se eliminó el sobrenadante y se lavó con bicarbonato de amonio 100 mM durante 15 min. *es, se añadieron 100 µL de ACN para deshidratar los trozos de gel, y se liofilizó la solución. A continuación, se añadió tripsina helada (0,01 µg/µL) en solución de bicarbonato de amonio 50 mM para cubrir las piezas de gel para el proceso de digestión y se colocó en hielo durante 30 minutos. Una vez que se completó la rehidratación, se añadió bicarbonato de amonio 50 mM fresco para reemplazar el exceso. tripsina y se dejó durante la noche a 37 grados. La extracción de los péptidos se realizó dos veces mediante la adición de 50 µl de ácido fórmico al 0,2 por ciento y ACN al 5 por ciento y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar el sobrenadante, se añadieron a la muestra 50 µl de ácido fórmico ACN al 50 por ciento-0,2 por ciento, y se volvió a agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente. *Se eliminó este sobrenadante y se combinó con el sobrenadante anterior de la primera extracción. Las muestras se analizaron usando Eksigent nano-LC-Ultra® 2D con el sistema cHiPLC-nano flex (Eksigent, AB SCIEX Dublin, CA, EE. UU.) en un modo de elución de trampa en combinación con espectroscopia de masas en tándem usando el espectrómetro de masas QExactive (Thermo Fisher Scientific, San Jose´, CA, EE. UU.) con ionización por electrospray [17].

2.3. Gestión de datos.

En el análisis se utilizó el motor de búsqueda SEQUEST (software Thermo Scientific Proteome Discoverer, versión 1.4). *Se utilizó la base de datos de proteínas para secuencias de péptidos trípticos para Homo sapiens del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) para comparar nuestros espectros MS/MS experimentales. Para identificar secuencias de péptidos y proteínas relacionadas, utilizamos criterios publicados previamente [17]. Para evaluar la significación estadística, se utilizaron búsquedas separadas de objetivos y señuelos y el cálculo de las tasas de descubrimiento falso (FDR) basadas en puntajes clásicos. Finalmente, filtramos los datos de salida de SEQUEST para asignar una puntuación final a las proteínas. Se eligieron valores mínimos de puntuación de correlación (Xcorr) de 1.5, 2.0, 2.25 y 2.5 para iones con carga simple, doble, triple y cuadripolar, respectivamente. Se utilizaron parámetros publicados anteriormente para garantizar un alto rigor [20], y la proporción de péptidos falsos positivos fue inferior al 3 por ciento.

2.4. Análisis estadístico.

El factor de abundancia espectral normalizado (NSAF) se utilizó para calcular la abundancia relativa de polipéptidos [21]. La transformación logarítmica y el escalado de los recuentos de péptidos se realizaron antes del análisis estadístico. Se utilizó el portal web MetaboAnalyst 2.0 para realizar la prueba t de Student, el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) y la importancia variable en la proyección (VIP) con una p a priori < 0.="" 05="" [22].="" *="" la="" proporción="" de="" proteína="" individual="" a="" concentración="" total="" se="" evaluó="" utilizando="" la="" prueba="" t="" de="" student="" pareada="" para="" cada="" grupo.="" pls-da="" y="" vip="" se="" utilizaron="" para="" identificar="" proteínas="" discriminatorias="" [23].="" seleccionamos="" proteínas="" con="" una="" tasa="" de="" descubrimiento="" falso="" (fdr)="" de="" menos="" o="" igual="" al="" 10="" por="" ciento="" para="" validar="" mediante="" transferencia="">

2.5. Inmunotransferencia y cuantificación de Western.

El anticuerpo contra MGAM se adquirió de Proteintech Group, Inc., (Chicago, IL, EE. UU.) y se usó para resolver 100 ug de proteína de exosomas de orina de cada sujeto. Después de la separación, las proteínas se transfirieron a papel de nitrocelulosa, se bloquearon, se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche antes de lavarlas con solución salina tamponada con Tris, se incubaron durante 1 h con conjugado de HRP-anticuerpo secundario y se visualizaron revelando como se describe en publicaciones anteriores de nuestro laboratorio. 24, 25]. Se utilizó el software ImageJ (NIH) para cuantificar las bandas de inmunotransferencia occidental [24] y se representó gráficamente (GraphPad Prism, San Diego, CA, EE. UU.).

3. Resultados

3.1. Características clínicas de sujetos con cirrosis y controles sanos.

Se analizaron seis pacientes de cada grupo con datos clínicos completos y se compararon con seis controles sanos. Los datos demográficos y la etiología de la enfermedad hepática se resumen en la Tabla 1. Como se anticipó según el diseño del estudio, las puntuaciones de Child Turcotte-Pugh y MELD variaron significativamente entre los grupos de pacientes.

3.2. Análisis proteómicos de exosomas en orina de pacientes cirróticos y controles sanos.

En total, en los 4 grupos, se identificaron 1572 proteínas únicas. Había 360 proteínas que eran comunes a todos los grupos. Encontramos 83 proteínas exosomales únicas para el grupo 0 (controles), 250 para el grupo 1, 84 para el grupo 2 y 212 para el grupo 3 (Figura 1). Además, realizamos PLS-DA multivariante en proteínas, que mostró una clara separación entre el grupo de control sano y diferentes subgrupos de sujetos cirróticos, como se muestra en la Figura 2. Sujetos cirróticos compensados ​​y descompensados ​​sinlesión renal(grupos 1 y 2) mostraron una superposición considerable, mientras que los sujetos cirróticos con AKI (grupo 3) mostraron una clara separación de los otros sujetos cirróticos y los sujetos de control sanos. Un ANOVA separado de proteínas entre los cuatro grupos mostró que 126 proteínas estaban significativamente alteradas (p < 0.05),="" de="" las="" cuales="" 13="" alcanzaron="" el="" límite="" de="" tasa="" de="" descubrimiento="" falso="" (fdr)=""><10% (table="" 2).="" maltase-glucoamylase="" (mgam)="" was="" the="" top="" discriminant="" protein="" with="" a="" vip="" score="" of="" 4.35="" for="" the="" entire="" study="">

3.3. La proteína maltasa-glucoamilasa aumenta en los exosomas de orina cirróticos descompensados.

Los datos proteómicos mostraron una mayor concentración de MGAM en los exosomas de orina de pacientes cirróticos descompensados, con y sinlesión renal(grupos 2 y 3). Esta fue la proteína individual más discriminatoria entre los cuatro grupos con una puntuación VIP de 4,35 (Figura 3). El western blot confirmatorio de estos exosomas demostró proteína detectable solo en pacientes cirróticos conlesión renal(grupo 3) (Figura 4).

4. Discusión

Realizamos un análisis proteómico del contenido de exosomas urinarios de pacientes con cirrosis compensada, cirrosis descompensada y cirrosis descompensada con LRA y los comparamos con controles sanos. El análisis proteómico de exosomas urinarios en pacientes cirróticos identificó varios biomarcadores potencialmente importantes delesión renal, más notablemente MGAM, una enzima bifuncional. Encontramos las concentraciones más altas de MGAM en los exosomas urinarios de los pacientes con cirrosis y LRA. Además, la MGAM aumentó en pacientes con cirrosis pero no tanto como en aquellos con AKI. MGAM estuvo ausente en el grupo de control sano, lo que destaca su papel potencial como biomarcador de enfermedades críticas.

Este estudio tiene varios otros hallazgos importantes. En primer lugar, hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre el análisis descriptivo del contenido de proteína exosómica urinaria en sujetos cirróticos bien caracterizados. En segundo lugar, este es el primer estudio que informa un aumento de la disacaridasa epitelial tubular en ellesión renal cirróticaparadigma. Los datos proteómicos del exosoma en orina de los 4 grupos diferentes mostraron que la regulación positiva de MGAM en el grupo con cirrosis AKI era sólida y constante. La maltasa es la principal disacaridasa en las membranas del borde en cepillo renal [26, 27], pero la función precisa de esta enzima no está claramente aclarada; sin embargo, se ha postulado un posible papel para las disacaridasas relacionadas, sacarasa-isomaltasa y trehalasa en el transporte de azúcar [28]. En diez especies de mamíferos, se han encontrado disacáridos relacionados con MGAM en el borde en cepillo renal [27]. Farquhar et al. han demostrado que la maltasa está presente en las microvellosidades del túbulo contorneado proximal, tal vez actuando en la reabsorción y el transporte de glucosa; y esta capacidad de absorción disminuye hacia las porciones más distales de la nefrona [29]. Se demostró que MGAM estaba presente en exosomas y micropartículas en un modelo de ratón con esteatohepatitis no alcohólica (NASH) [30], una causa común de cirrosis. Dado que los pacientes cirróticos tienen varias condiciones subyacentes que contribuyen a una disminución de Scr, la detección de AKI es problemática. Además, a menudo se desconoce la etiología de la lesión y es difícil diferenciar entre el síndrome hepatorrenal y otras etiologías de AKI. Además, la fisiopatología de la cirrosis descompensada con LRA no está clara, ya que puede reflejar cambios hemodinámicos o mediadores inflamatorios en el caso de insuficiencia hepática aguda o crónica [31]. Razonamos que los cambios estructurales y funcionales que provocan la cirrosis y la hipertensión portal enFunción del riñónvarían en gravedad según la gravedad de la cirrosis. Estas diferencias entre la enfermedad hepática compensada y descompensada conlesión renalpuede entenderse mediante el estudio de los productos aguas abajo de lariñón, como la orina. Dada la carga específica del estado de las células de la nefrona del exosoma urinario, planteamos la hipótesis de que el análisis del exosoma en orina contiene información clave que es relevante para la diferenciación de AKI en la cirrosis. Este informe es el primer paso para probar esta hipótesis.

Este diseño de estudio tenía varias limitaciones. Primero, el número de sujetos analizados por grupo es pequeño. El tamaño de muestra más grande puede haber aumentado aún más la solidez de estos datos, y las proteínas adicionales pueden haber alcanzado el umbral de un FDR aceptable de<10%. however,="" despite="" this="" small="" sample,="" these="" data="" demonstrating="" mgam="" as="" a="" unique="" exosomal="" protein="" in="" cirrhotic="" patients="" with="" aki="" is="" robust.="" second,="" we="" used="" 1d="" gel="" electrophoresis="" to="" resolve="" the="" exosome="" proteins="" prior="" to="" lc/ms-ms="" analysis="" that="" resulted="" in="" the="" identification="" of="" 1572="" proteins="" overall.="" if="" we="" had="" conducted="" direct="" exosome="" protein="" trypsinization="" instead="" of="" following="" this="" method,="" perhaps="" the="" number="" of="" identified="" proteins="" might="" have="" increased.="" in="" our="" experience,="" exosomes="" are="" packaged="" with="" nonfull="" length="" peptides="" from="" proteolytic="" action="" as="" well="" as="" endogenous="" peptides="" and="" may="" have="" con-founded="" the="" analysis.="" by="" following="" the="" gel="" electrophoresis="" method,="" we="" ensured="" that="" we="" only="" compared="" full-length="" protein="" differences="" between="">

En resumen, hemos caracterizado las diferencias de proteína exosómica en orina en controles sanos y sujetos cirróticos compensados ​​y descompensados ​​con y sin AKI mediante métodos proteómicos. El trabajo del grupo de Knepper muestra que muchas proteínas renales importantes (p. ej., acuaporinas, policistinas y podocina) se eliminan en el exosoma de la orina [32, 33]. Nuestro informe actual agrega MGAM a este grupo de proteínas renales funcionalmente importantes identificadas en exosomas de orina. Nuestros hallazgos sugieren que la MGAM puede diferenciar la lesión tubular proximal de otros tipos de LRA en pacientes cirróticos. Sin embargo, la importancia clínica de la regulación positiva de MGAM en sujetos con cirrosis y AKI debe establecerse en estudios futuros.

Disponibilidad de datos

Los datos clínicos y proteómicos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están restringidos por la junta de revisión institucional de UCSD para proteger la privacidad del paciente. * Los datos están disponibles a través de la Dra. Linda Awdishu (lawdishu@ucsd.edu) para los investigadores que cumplen con los criterios para el acceso a datos confidenciales.

Conflictos de interés

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Expresiones de gratitud

Investigación apoyada a través de NIH NIDDK UAB/UCSD O'Brien Center Grant DK0793337.

Autor

linda awdishu,^1,2 shirley tsunoda,¹ michelle perlaman,³ chantel Kokoy-Mondragón,²Majid Ghasemian,⁴Roberto K. Naviaux,⁵Heather M. Patton,³Ravindra L. Mehta,²bhavya vijay,⁶y satisfacer P.Ramachandra Rao ^2,6,7

1UC San Diego Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, San Diego, EE. UU.

2Laboratorio de Biomarcadores, Centro O'Brien paraLesión renal agudaInvestigación, Nefrología-Hipertensión, UC San Diego, Departamento de Medicina, San Diego, EE. UU.

3UC San Diego, Departamento de Medicina, División de Gastroenterología, San Diego, EE. UU.

4UC San Diego, Departamento de Química y Bioquímica, Centro de Espectrometría Biomolecular y Proteómica, San Diego, EE. UU.

5UC San Diego, Departamentos de Medicina, Pediatría y Patología, San Diego, EE. UU.

Laboratorio de biomarcadores 6I-AIM, Re University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology (TDU), Bangalore, India

7UC San Diego, Departamento de Medicina, División de Enfermedades Infecciosas, San Diego, EE. UU.

La correspondencia debe dirigirse a Satish P. Ramachandra Rao; Recibido el 30 de octubre de 2018; Revisado el 31 de diciembre de 2018; Aceptado el 19 de febrero de 2019; Publicado 16 abril 2019 Editor Académico: Antonio Artigas

Derechos de autor © 2019 Linda Awdishu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la,que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite correctamente la obra original.

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