Actividad inmunoestimuladora de polisacáridos extraíbles con agua de Cistanche Deserticola como adyuvante vegetal in vitro e in vivo

Introducción

Las vacunas son importantes para controlar o prevenir enfermedades. Las vacunas recién generadas y en desarrollo son antígenos recombinantes altamente purificados con mayor seguridad, pero los antígenos purificados no pueden estimular una respuesta inmune satisfactoria en comparación con las preparaciones de patógenos atenuados o inactivados. Con la ayuda de adyuvantes, las vacunas pueden inducir respuestas inmunes persistentes [1,2]. Nuevos y potentes adyuvantes están muy presentes en ambas vacunas.desarrollo y salud humana. Hasta la fecha, se han identificado y estudiado exhaustivamente varios adyuvantes. Estos adyuvantes confieren a las vacunas varias ventajas, incluida la disminución de la cantidad necesaria de antígenos, la minimización del número de inmunizaciones necesarias para respuestas inmunitarias normales y la inducción de respuestas inmunitarias más rápidas, más amplias y más potentes.3–5]. Aunque se han desarrollado muchos adyuvantes potentes, como el lipopolisacárido (LPS) y el adyuvante completo de Freund (FCA), no se aplican ampliamente debido a su toxicidad. Por lo tanto, sólo unos pocos adyuvantes, como el alumbre, están autorizados para uso clínico.6]. En general, se deben desarrollar adyuvantes más eficaces y seguros para promover mejores vacunas profilácticas y terapéuticas contra enfermedades infecciosas y no infecciosas.

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La seguridad es un factor de consideración importante en el desarrollo de adyuvantes. Los componentes herbáceos chinos incluyen nutrientes e importantes compuestos activos, como compuestos fenólicos y polisacáridos, que pueden actuar como potentes inmunoestimulantes [7–9]. Entre ellos, los polisacáridos de las hierbas tradicionales chinas se han explorado ampliamente debido a sus actividades inmunoestimulantes y su baja toxicidad. Por ejemplo, la inulina es un adyuvante inmunológico sin la toxicidad de otros adyuvantes como el FCA. El adyuvante de inulina delta AdvaxTM también ha mejorado con éxito la inmunogenicidad de la vacuna [10,11]. El astrágalo, también conocido como Huangqi en chino y Radix Astragali en latín, está ampliamente distribuido por todo el mundo. El polisacárido es uno de sus principales ingredientes activos responsables de la actividad inmunomoduladora. Los estudios experimentales han demostrado que el polisacárido de astrágalo posee fuertes efectos inmunomoduladores tanto in vitro como in vivo [12, 13]. Los polisacáridos de Lycium barbarum como adyuvantes de vacunas también mostraron buenas mejoras y efectos estimulantes [14, 15]. Estos estudios sugirieron que los polisacáridos herbales chinos eran candidatos ideales para el desarrollo adyuvante.

Cistanche deserticolaYC Ma (CD, "Rou Cong Rong" en chino) es una valiosa hierba tradicional china y comúnmente se considera como "Ginseng de los desiertos" debido a sus efectos tónicos superiores. Se distribuye en regiones áridas o semiáridas de Xinjiang. En China, su tallo carnoso seco se ha utilizado como alimento tónico durante cientos de años [16, 17]. Durante muchos años, el CD hervido se ha utilizado como alimento tónico para tratar el deterioro inducido por el exceso de esfuerzo, lo que sugiere que es seguro para la administración oral. Esta planta es ampliamente considerada debido a sus amplias funciones medicinales. Estudios fitoquímicos y farmacológicos recientes demostraron que los polisacáridos eran los principales componentes biológicamente activos y tenían varios efectos biológicos, incluidosActividad inmunomoduladora, efecto antioxidante y efectos antiinflamatorios.[18-21]. Sin embargo, rara vez se informó sobre la actividad de mejora inmune de los polisacáridos extraíbles con agua de C. deserticola en Xinjiang.

Es bien sabido que las CD son importantes células presentadoras de antígenos (APC) que proporcionan las señales necesarias para iniciar respuestas inmunes y modular las células innatas y adaptativas. Algunos adyuvantes que mejoran la captación de antígenos por parte de las CD pueden aumentar las moléculas coestimuladoras o MHC ymejorar la inmunidad. Cuando comienza la maduración de las CD, se producen más moléculas coestimuladoras y citoquinas y las CD muestran fenotipos distintos [22, 23].

En este estudio, primero explotamos si WPCD podría promover la activación de las CD a través de la vía de señalización TLR4 in vivo. Dado que las CD eran el vínculo entre las respuestas inmunes innatas y adaptativas, planteamos la hipótesis de que la activación de las CD estimulada por WPCD influiría en el resultado de la inmunidad adaptativa. Examinamos la respuesta inmune específica a la ovoalbúmina (OVA) en ratones tratados con WPCD, incluidos los títulos de las subclases IgG, IgG1 e IgG2a, la proliferación T y B y la producción de citoquinas. Investigamos si el tratamiento con WPCD aumentaría la actividad de las CD y las células Treg en el bazo de estos ratones. Nuestros hallazgos demostraron la potencial actividad inmunomoduladora de los polisacáridos naturales de C. deserticola y ampliaron su alcance de aplicación.

Materiales y métodos

animales

Se compraron ratones hembra C57BL/6, BALB/c o ICR de ocho a diez semanas de edad en el Primer Hospital de la Universidad Médica de Xinjiang (Urimuqi, Xinjiang, China). Los ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) de la Universidad de Xinjiang para la Salud y el Bienestar Animal. Los procedimientos de experimentación con animales habían sido aprobados por la AUCC de la Universidad de Xinjiang.

Extracción de extractos acuosos.

C. deserticola es una planta en la provincia de Xinjiang en China. El polisacárido crudo se obtuvo mediante extracción con agua y precipitación con etanol. Brevemente, se molieron 100 g de C. deserticola seca hasta obtener un polvo y luego se filtraron. El polvo se sometió a reflujo con éter de petróleo a temperatura ambiente repetidamente y luego se sometió a reflujo con etanol anhidro durante 1 h para eliminar los ingredientes coloreados y los lípidos. Los residuos se extrajeron con agua hirviendo tres veces y los extractos se combinaron, se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 minutos y se sometieron a reflujo a 60ºC durante 4 h. Se añadió a la solución cuatro veces el volumen de etanol al 95% para precipitar los polisacáridos brutos. Los polisacáridos crudos se redisolvieron en agua destilada y se trataron con reactivo Sevage para eliminar las proteínas. Los extractos se disolvieron en PBS y se esterilizaron a través de un filtro de 0,22-μm. Finalmente, el contenido total de azúcar de WPCD fue del 59,58%, como lo indica el análisis de fenol-ácido sulfúrico [24].

Generación de DC

Los BM-DC se generaron de acuerdo con el método descrito anteriormente con ligeras modificaciones [25]. Las CD de médula ósea de ratones C57BL/6 se eliminaron con medio completo RPMI-1640 (Gibco) suplementado con suero de ternera fetal al 10 % (Hyclone). Las células recolectadas se resuspendieron en medio RPMI-1640 con -mercaptoetanol 50 μM (Sigma, St Louis, MO) y GM-CSF murino 20 ng/mL (Peprotech, Rocky Hill, NY) y se incubaron a 37˚. C en atmósfera con 5% de CO2. La mitad del medio de cultivo se reemplazó por medio nuevo que contenía GM-CSF cada 1 a 2 días. Las células se recogieron el día 6, se trataron con diferentes dosis de WPCD y LPS (100 ng/ml) (Sigma, St Louis, MO) durante 24 h y luego se evaluaron mediante citometría de flujo.

Detección de maduración de CD y activación de células T in vitro.

El efecto de maduración in vitro de WPCD en BM-DC se evaluó en función de los resultados del análisis fenotípico realizado por FAC. El día 7, se indujeron BM-DC de C57BL/6 en presencia de GM-CSF y luego se trataron con diferentes concentraciones de WPCD (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0,1 y 0,2 mg/ml) durante 12 h por triplicado. Se utilizó LPS (100 ng/ml) como control positivo. Después de lavar las BM-DC en PBS y utilizar Fc Block (BD Biosciences, CA) para evitar la unión de anticuerpos no específicos, las células se tiñeron en PBS utilizando el CD40, CD11c, CD{ conjugado con FITC, PE o APC apropiado. {23}}, CD80 y anticuerpos MHC-II (BD) durante 20 min a 37˚C. Las células teñidas fueron detectadas por FAC Calibur (BD). El análisis de los datos se realizó con el software FlowJo (Tree Star).

En el experimento de maduración de CD in vitro, también se recolectaron sobrenadantes de cultivos celulares para analizar IL-12 y TNF- mediante kits de ensayo de citoquinas (Boster, Wuhan, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia a 450 nm se midió con un lector de placas ELISA (Bio-Rad, EE. UU.). Las cantidades de citocinas en las muestras se calcularon con curvas estándar de citocinas recombinantes según el método de regresión lineal.

Para probar su actividad estimulante alogénica, se realizó el experimento de reacción mixta de linfocitos (MLR) de acuerdo con el método anterior [26] mediante el ensayo MTT (Sigma, St Louis, MO). Brevemente, las BM-DC de ratones C57BL/6 utilizadas como células estimuladoras se recuperaron el día 7 en medio RPMI-1640 más GM-CSF y se trataron con diversas concentraciones de WPCD durante 12 h a 37˚C. Las células se lavaron y se resuspendieron en medio RPMI-1640 antes de colocarlas en la placa de pocillos 24-. Se aislaron células respondedoras en suspensión de plenocitos individuales de ratones BALB/c. Las BM-DC se mezclaron con esplenocitos según proporciones de 1:5 y 1:10. Las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante tres días por triplicado. El tratamiento con LPS se utilizó como control positivo. Posteriormente se agregaron a los cultivos 20 μL de MTT para las últimas 4-h de cultivo. Se midieron las absorbancias a la longitud de onda de medición (490 nm) y a la longitud de onda de referencia (650 nm) para el análisis de la proliferación de células T. Todas las muestras se midieron frente a un control de fondo.

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Tratamiento con inhibidor de TLR4 in vitro.

Las BM-DC se trataron previamente con TAK-242 5 μM (inhibidor de TLR4, Medchemexpress Inc. EE. UU.) durante 1 h y luego se cultivaron conjuntamente con diversas concentraciones de WPCD (100 y 200 ug/mL) durante 12 h. en presencia o ausencia de Golgi Stop por triplicado. En el control positivo se añadió LPS. Las células y los sobrenadantes se detectaron mediante FAC para analizar los marcadores de superficie CD86 y CD40 y mediante ELISA para analizar las citocinas TNF-a e IL-12, respectivamente.

Protocolo de vacunación

Prueba de toxicidad aguda

En la prueba de toxicidad aguda oral de este estudio, se utilizaron 40 ratones ICR adultos sanos. Los ratones ICR estuvieron en ayunas (comida pero no agua durante la noche) antes de la dosificación. WPCD se administró por vía oral respectivamente en dosis de 0, 50, 500 o 5000 mg/kg de peso corporal a cada animal durante 7 días. En el grupo de control se incluyeron ratones tratados con solución salina y tratados con alumbre. Los animales fueron observados diariamente durante 14 días consecutivos. Los ratones fueron observados individualmente para registrar la mortalidad y los signos clínicos. Además, durante todo el experimento se midieron el peso corporal y el consumo de alimentos y agua. El día 14, el índice del bazo o del timo se calculó como (peso del bazo o del timo/peso corporal) × 10.

Detección de actividad inmunomoduladora de WPCD in vivo.

Para investigar si WPCD tenía actividad inmunomoduladora, se utilizó ovoalbúmina (OVA) (Sigma) como antígeno modelo y se separaron aleatoriamente ratones ICR hembras en 7 grupos (grupo de control negativo (0.9 % de NaCl y WPCD 400 ug ) y el control positivo (Alumbre 200 ug con OVA)). A los ratones se les administró por vía subcutánea dos veces 10 ug de OVA sola o WPCD con OVA según la dosis de 20, 100 o 400 ug con un intervalo de 2-semanas. Se obtuvieron muestras de sangre y de bazo después de la vacunación de refuerzo para detectar títulos de IgG, subclases de IgG, proliferación de esplenocitos y citoquinas, marcadores de superficie de CD y frecuencia de Treg.

Detección de anticuerpos específicos de OVA.

Los títulos y subclases de IgG específicos de OVA se examinaron mediante ELISA según el método anterior [27]. Se recubrieron placas ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) durante la noche y luego se bloquearon. Las muestras de suero se diluyeron en serie para el análisis del título de IgG o la detección de IgG1 e IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Luego, las placas se incubaron con PBST que contenía IgG, IgG1 e IgG2a anti-ratón conjugadas con HRP durante 1 hora a 37ºC. La reacción colorimétrica se desarrolló con tetrametilbencidina (TMB) y luego se midieron las absorbancias a 450 nm/655 nm y se expresaron como unidades de densidad óptica (OD).

Detección de proliferación de esplenocitos y citocinas.

La proliferación de esplenocitos se determinó mediante el ensayo MTT. El día 21 después de la primera vacunación, se obtuvo una única suspensión de esplenocitos. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 en placas de 96-pocillos según la concentración de 1 x 106 células/pocillo por triplicado. Los cultivos se estimularon con OVA (concentración final 10 ug/mL), ConA (concentración final 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) y LPS (concentración final 100 ng/mL) durante 48 h a 37˚C. . Las células se cultivaron durante 48 h y se agregaron 20 μL (5 mg/mL) de MTT (Sigma, St Louis, MO) a cada pocillo y se incubaron durante otras 4 h. Después de agregar 50 μL de DMSO en cada pocillo para detener el desarrollo del color (Sigma), las placas se leyeron a 570 nm mediante un lector de placas de microtitulación (BioRad, CA, EE. UU.). La proliferación de esplenocitos se expresó como índice de estimulación (SI), que era la relación DO570 nm de un pocillo estimulado con respecto a uno no estimulado.

Los rendimientos de IL-4 e IFN- en células T se midieron mediante tinción con citocinas intracelulares según un protocolo publicado con modificaciones menores [27, 28]. Se preparó una suspensión de esplenocitos únicos el día 21 después de la primera vacunación. Después de la lisis de los glóbulos rojos, los esplenocitos (2 x 106 células/ml) se incubaron con OVA (10 ug/ml) durante 4- h de estimulación y se añadió la parada de Golgi (BD) durante 12 h de incubación, PMA fue positiva. control. Las células se recogieron, se lavaron con PBS, se tiñeron con CD4-FITC/CD8-FITC y se fijaron y permeabilizaron con el kit Cytofix/Cytoperm (BD) según las instrucciones del fabricante. La tinción de citoquinas intracelulares se realizó con la concentración adecuada de anticuerpos IL-4-PE o IFN- -APC a 4˚C durante 20 minutos. Las células teñidas fueron detectadas por FAC. El análisis de datos se realizó en FlowJo.

Evaluación de la maduración de las CD y las células Treg en el bazo.

Para el análisis de la maduración de DC de esplenocitos en ratones, la tinción de la superficie celular se realizó con anticuerpos CD11c-PE, CD40-FITC y CD80-APC. El día 3 después de la primera vacunación, se obtuvo una suspensión de esplenocitos únicos (1 x 106 células/ml) y las células se sometieron a doble tinción. Las intensidades fluorescentes fueron medidas por los FAC Calibur y los datos medidos fueron analizados por FlowJo.

Observar si WPCD podría regular negativamente la frecuencia de las células CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg. Se preparó una suspensión de esplenocitos únicos el día 7 después de la segunda vacunación. El esplenocito (2 x 106 células/ml) se sometió a tinción de la superficie celular con anticuerpo CD4-APC, seguida de tinción con citoquinas nucleares con los anticuerpos CD25-FITC y Foxp3-PE apropiados. con el kit de tinción de células T reguladoras de ratón (eBiosciences) según las instrucciones del fabricante. La frecuencia de las células Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ se probó en FAC. El análisis de datos se realizó en FlowJo.

análisis estadístico

Se realizaron pruebas de análisis de varianza unidireccional (ANOVA) (prueba de comparación múltiple de Tukey) para analizar las diferencias entre múltiples grupos experimentales. Todos los valores se expresan como media ± DE. PAG< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Resultados WPCD promovió la maduración y función de BM-DC in vitro

La inmunidad adaptativa está determinada por la activación de las CD, incluidos los tipos de moléculas coestimuladoras y citocinas [29, 30]. Inicialmente, investigamos si WPCD podría promover la expresión de moléculas coestimuladoras. Según diferentes dosis de WPCD, BM-DC

de C57BL/6. Se analizaron los niveles de expresión de CD11c, CD86, CD80, CD40 y MHC-II en células (Fig. 1). Las células marcadas con SSC y FSC mostraron que el tratamiento con diferentes dosis de WPCD no cambió la morfología de las BM-DC (datos no mostrados). Los niveles de expresión de CD86, CD80 y CD40 aumentaron significativamente de manera dependiente de la dosis en comparación con el grupo no tratado y alcanzaron la meseta con la dosis de 20 ug/ml de WPCD, pero la diferencia fue no significativo en comparación con el grupo de LPS (Fig. 1A-1C). El nivel de expresión de MHC-II aumentó significativamente hasta su valor máximo con la dosis de 50 ug/ml (Fig. 1D). Los resultados del análisis de los marcadores de superficie celular demostraron que las CD tratadas con LPS o WPCD mostraron niveles de expresión significativamente mayores de CD86, CD80, CD40 y MHC-II y promovieron la maduración fenotípica.

Algunos adyuvantes podrían aumentar las moléculas coestimuladoras en las CD o inducir directamente la secreción de citoquinas. IL-12 y TNF- son las principales citoquinas para activar la respuesta inmune Th1. Analizamos los rendimientos de citocinas en BM-DC tras el tratamiento con WPCD. Después de que las BM-DC se trataron con diferentes contenidos de WPCD durante 12 h, se recogió el sobrenadante para detectar los contenidos de IL-12 y TNF- con un kit de ELISA. WPCD podría aumentar de forma dosis-dependiente la producción de IL-12 (Fig. 2A) y TNF- (Fig. 2B). Los resultados demostraron que WPCD podría inducir la maduración funcional de las CD.

En una respuesta inmune, es necesario activar funcionalmente las CD. Luego, las CD completamente maduras indujeron el mayor nivel de proliferación de células T alogénicas. Por lo tanto, MLR investigó la respuesta funcional de las CD a WPCD. La capacidad aloestimuladora de las CD inducidas por WPCD, similar al LPS, mejoró dramáticamente de manera dosis dependiente en la proporción indicada (Fig. 2C y 2D). Los resultados indicaron que WPCD mejoró la presentación del antígeno y optimizó la respuesta de las células T mediante MLR in vitro.

WPCD promovió la maduración de las CD a través de la vía TLR4

Se podría inferir de los resultados anteriores que las BM-DC activadas por WPCD indicaron expresiones de moléculas de superficie de DC similares a las del LPS (un ligando de TLR4). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las BM-DC son activadas por WPCD a través de la vía TLR4. Después de que las BM-DC se trataron previamente con TAK-242 (inhibidor de TLR4) y se cultivaron conjuntamente con WPCD y LPS durante 12 h, la expresión de CD40, CD86, TNF-a o IL{{12 }} fue detectado por FAC o ELISA. Como se muestra en las figuras 3A y 3B, el tratamiento con TAK-242 dio como resultado expresiones significativamente reguladas a la baja de CD40 y CD86 inducidas por LPS o WPCD, y la producción de citocinas de IL-12 o El TNF-a también disminuyó significativamente (Fig. 3C y 3D). Los resultados indicaron que WPCD podría activar la maduración de DC a través de la vía TLR4.

WPCD mejoró la inmunidad humoral y celular

A modo de comparación, evaluamos los efectos de WPCD sobre la provocación de una respuesta inmune humoral en ratones inmunizados con OVA. Antes de la vacunación y los días 14, 21,

35 y 49 después de la primera vacunación, se recogió sangre para detectar el título de IgG y las subclases de IgG en suero mediante ELISA. La respuesta de anticuerpos IgG a OVA aumentó con el aumento de la dosis de administración de WPCD (100 y 400 ug) de manera dosis dependiente (Fig. 4). La concentración óptima fue 100 ug/ml de WPCD y aumentó las respuestas de IgG dos veces en comparación con la OVA sola en los días 21, 35 y 49 (Fig. 4A). Se obtuvieron aumentos considerables en los niveles de anticuerpos IgG1 e IgG2a específicos de OVA por debajo de 20 y 100 ug de administración de WPCD en comparación con el grupo de OVA en suero el día 35 (Fig. 4B). Mientras tanto, Alum promovió solo los niveles de expresión de anticuerpos IgG e IgG1 específicos de OVA en los ratones inmunizados. El WPCD por sí solo no desencadenó anticuerpos específicos de OVA. Los resultados anteriores indicaron que WPCD generó títulos de anticuerpos más altos y respuestas Th1/Th2 más equilibradas que Alum.

La proliferación de esplenocitos es otro indicador de la inmunidad celular. ConA estimula las células T y LPS estimula la proliferación de células B. El día 21 después de la primera vacunación, se obtuvo una suspensión de esplenocitos únicos y se estimuló respectivamente con OVA (10 ug/mL), péptido OVA323-339 (10 ug/mL), ConA (5 ug/mL) y LPS ( 5 ug/ml) durante 48 h. Luego se midió la proliferación de células T mediante el método MTT. WPCD podría promover significativamente la proliferación de esplenocitos estimulada por antígeno OVA, mitógeno Con A y mitógeno LPS en los ratones inmunizados con OVA y WPCD (Fig. 5) y la concentración óptima de WPCD fue de 100 ug/ml. Estos datos indicaron que WPCD como adyuvante de vacuna en ratones inmunizados con OVA podría inducir de manera más efectiva la activación de células T y células B que Alum.

Todos los adyuvantes de WCPD probados formulados con vacunas OVA generaron inmunidad humoral y celular igualmente fuerte (Figs. 4 y 5). Con base en estos datos, para evaluar más a fondo las influencias de WPCD en la respuesta de las células T colaboradoras (Th) específicas de OVA, analizamos más a fondo las expresiones de citocinas en células T CD8+ y CD4+ mediante citometría de flujo (Fig. 6). . El día 21 después de la primera vacunación, se aisló un único esplenocito de ratones y luego se cocultivó con OVA (10 ug/ml). El rendimiento de IL-4 en células T CD4+ en el grupo administrado con 100 ug de OVA/WPCD fue significativamente mayor que el del grupo OVA/Alum y el grupo OVA y similar al de PMA (Fig. 6A). Además, el rendimiento de IFN- en células T CD8+ y CD4+ también mejoró significativamente en los ratones a los que se les administró OVA/WPCD (20, 100 y 400 ug) (Fig. 6B y 6C). En comparación con el adyuvante de alumbre, WPCD mostró una mejor capacidad de inducir secreciones de IL-4 e IFN- de las células T.

La maduración de las CD estimulada por WPCD y la disminución de la frecuencia de Treg en las CD in vivo se reconocen como las APC más potentes involucradas en el inicio de respuestas inmunes primarias. Por lo tanto, el día 3 después de la primera vacunación, también investigamos los efectos de WPCD en CD40 y CD80 en CD en el bazo en ratones (Fig. 7A y 7B). Los ratones del grupo 100-ug OVA/WPCD produjeron niveles significativamente más altos de CD40 y CD80 en las CD que los del grupo OVA/Alum. Estos datos mostraron que WPCD podría activar las CD e inducir la maduración de las DC en ratones. Las células Treg pueden equilibrar la tolerancia y las respuestas inmunes. Para investigar más a fondo cómo WPCD moduló la respuesta inmune, se tiñeron células Treg en el bazo de ratones con un kit de tinción de células T reguladoras de ratón. El día 21 después de la primera vacunación, se observó una frecuencia reducida de células Treg CD25+ Foxp3+ en el total de células T CD4+ (Fig. 7C). En comparación con los grupos OVA y OVA/Alum, el grupo WPCD mostró una frecuencia de Treg significativamente reducida.

Evaluación de seguridad de WPCD en ratones.

Para estimar la toxicidad aguda oral, realizamos la prueba de toxicidad aguda. Los ratones a los que se les administró por vía oral 5000 mg/kg de peso corporal no mostraron ningún comportamiento anormal ni efectos secundarios y no se encontró mortalidad en la prueba de evaluación de toxicidad. No se registraron diferencias significativas en el aumento de peso corporal, el índice de timo y el índice de bazo entre varios grupos de ratones a los que se les administraron diferentes dosis de WPCD y no hubo diferencias significativas (Tabla 1). No se observó mortalidad después de 14 días. Por lo tanto, el valor LD50 de WPCD fue superior a 5000 mg por kg de peso corporal.

Para comprobar si WPCD tenía efectos negativos sobre el crecimiento de los ratones, antes y después de la vacunación subcutánea, se determinó respectivamente el peso corporal de cada ratón (Tabla 2). En la observación posterior de los ratones no se observaron efectos secundarios ni comportamientos anormales. Además, el peso corporal de los ratones a los que se les administró WPCD y los ratones a los que se les administró solución salina u OVA/Alum no mostró diferencias significativas. Estos resultados de observación demostraron que la administración de WPCD era segura.

Discusión

Los adyuvantes son componentes clave de las vacunas [31]. Debido a los avances en genómica y proteómica, cada vez se identifican más moléculas de vacunas recombinantes y sintéticas. Por tanto, se requieren más adyuvantes y formulaciones. Algunos adyuvantes potentes generalmente están relacionados con una mayor toxicidad, por ejemplo, FCA. Por lo tanto, es necesario encontrar una formulación segura que contenga diferentes componentes sinérgicos que eventualmente impulsen la respuesta inmune deseada.Los polisacáridos de las hierbas chinas no son tóxicos.y no muestran efectos secundarios significativos [32,28]. Se requiere un adyuvante seguro para una determinada vacuna.

Cistanche deserticola es una hierba tónica importante y existe ampliamente en tierras áridas y desiertos cálidos del noroeste de China. Cistanche deserticola está muy preocupada debido a sus bioactividades, incluidos efectos inmunomoduladores, antioxidantes, antibacterianos y antitumorales [20,21]. Se han logrado algunos avances en la caracterización estructural y la actividad inmunológica de Cistanche deserticola, que es un buen candidato para desarrollar adyuvantes. Evaluamos experimentalmente los efectos adyuvantes y el mecanismo de WPCD in vitro e in vivo. La administración subcutánea de WPCD promovió significativamente las respuestas inmunitarias humorales y celulares al aumentar los anticuerpos séricos y la proliferación de linfocitos, mejorar la expresión de citocinas, regular positivamente la maduración de las CD y regular negativamente la frecuencia de CD4+ CD{{5} } Foxp3+ Células Treg.

Las CD son APC clave para preparar células T vírgenes. La activación de las CD es importante para los adyuvantes. Las CD, especialmente las derivadas de médula ósea murina, se utilizan a menudo para evaluar adyuvantes y vacunas. La citometría de flujo puede distinguir las células que se han activado después de capturar un antígeno de las células circundantes. En el análisis FCM, el grado de agregación de estimulados

Las células son un indicador indirecto de la evaluación de la seguridad de los inmunomoduladores [3]. Por lo tanto, los datos de actividad del adyuvante WPCD en CD in vitro pueden proporcionar información valiosa para modelos animales. Según el modelo BM-DC, los niveles de expresión de MHC-II, CD86, CD80 y CD40, la producción de citocinas y la proliferación de células T alogénicas se detectaron en el rango de concentración óptimo de WPCD. Los niveles de expresión de MHC-II, CD86, CD80 y CD40 se regularon positivamente en BM-DC y los rendimientos de TNF-a e IL-12 aumentaron de manera dependiente de la dosis. Se observó la proliferación de células T alogénicas. La morfología de los BM-DC no cambió. Al inducir la activación de las BM-DC y la secreción de citocinas inflamatorias in vitro, el adyuvante de WPCD podría aumentar significativamente la cantidad de antígeno y la cantidad de APC y estimular las células T para que secreten IFN-, lo que contribuye a mejorar la actividad inmunomoduladora.

VariosPolisacáridos herbáceos chinosson capaces de activar el sistema inmunológico y poseen excelentes capacidades adyuvantes mediante la estimulación de la maduración de las CD por la vía TLR4 [33,28]. Por lo tanto, asumimos que TLR4 participa en la vía de señalización de la maduración de las CD inducida por WPCD. Como se esperaba, los tratamientos con inhibidores de TLR4 dieron como resultado una disminución significativa de TNF-a e IL-12. Además, la inhibición de la vía TLR4 también obstaculizó la expresión de CD40 y CD80 en las CD, lo que indica que la maduración de las CD dependía de TLR4. Por lo tanto, es obvio que TLR4 participa en la maduración de las CD inducida por WPCD.

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La dosis óptima de adyuvantes y formulación de vacuna se determina empíricamente en muchos experimentos. Para explorar la relación dosis-respuesta del adyuvante WPCD y los antígenos OVA en ratones, seleccionamos diferentes dosis de WPCD según los datos informados previamente de BM-DC in vitro para administrar por vía subcutánea ratones ICR dos veces. Descubrimos que WPCD aumentó significativamente el rendimiento de anticuerpos específicos de OVA e indujo una respuesta inmune Th1/Th2 equilibrada con una mejora de los niveles de IgG1 e IgG2a. Especialmente, el nivel de IgG2a fue más alto que el tratado con alumbre en la dosis óptima. Por lo tanto, WPCD dio como resultado niveles más altos de anticuerpos específicos y una mayor eficacia con las inyecciones más bajas.

Las nuevas vacunas requieren la inducción de fuertes respuestas celulares, que involucran anticuerpos, células T colaboradoras (Th) y linfocitos T citotóxicos (CTL). La vacuna terapéutica tiene como objetivo inducir respuestas de células T más fuertes. El adyuvante ideal mejora la potencia de la vacuna y promueve la inmunidad mediada por células sin causar efectos tóxicos [34]. Entre las observaciones en modelos de ratones inmunizados, WPCD condujo a un aumento en la proliferación de esplenocitos específicos y no específicos de OVA en comparación con Alum. Algunos adyuvantes regulan positivamente las citoquinas y el sistema inmunológico. Por ejemplo, las saponinas pueden estimular respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno que normalmente induce sólo anticuerpos. Seleccionamos IL-4 e IFN- como indicadores para evaluar indirectamente los niveles de inmunidad en ratones. WPCD podría inducir más secreciones de IL-4 e IFN- que el alumbre. Por lo tanto, se observaron fuertes respuestas de células T colaboradoras y secreciones de citoquinas como resultado de la vacunación con WPCD, lo que sugiere que WPCD podría estimular más eficientemente a los linfocitos para secretar la citocina de tipo Th1-y la citocina de tipo Th2-que Alumbre.

Los adyuvantes que influyen en la presentación de antígenos pueden afectar procesos inmunitarios complejos. Las células Treg pueden modular las respuestas Th1 y Th2 [35]. Una dosis adecuada de WPCD puede promover la maduración de las CD en ratones al aumentar los niveles de expresión de CD80 y CD40 y amplificar la capacidad de presentación del antígeno OVA en la respuesta inmune temprana. Los resultados experimentales de la activación de las CD y la frecuencia de Treg demostraron que WPCD indujo la maduración de las CD y disminuyó la frecuencia de Treg en el bazo en ratones. Estos resultados demostraron que WPCD mejoró la eficacia de las vacunas OVA al aumentar la focalización de las células presentadoras de antígenos y promover la activación específica de las células T.

En el desarrollo de adyuvantes resulta difícil inducir selectivamente la respuesta inmune adecuada contra la infección correspondiente. El adyuvante adecuado debería tener efectos secundarios y toxicidad bajos para los seres humanos o los animales. Por lo tanto, se debe considerar la seguridad del WPCD, incluidos los efectos secundarios inmediatos y a largo plazo. En este estudio, exploramos la toxicidad aguda de WPCD y el efecto negativo de WPCD sobre el crecimiento de ratones durante 110 días. Los resultados de toxicidad aguda de WPCD mostraron que el peso corporal, el índice de timo o el índice de bazo no tuvieron diferencias significativas. El valor LD50 de WPCD fue superior a 5000 mg por kg de peso corporal. Durante la observación experimental posterior de los ratones, no se encontraron efectos secundarios ni comportamientos anormales en los ratones. Estos resultados indicaron que WPCD era seguro.

En conclusión, en este estudio, WPCD, un polisacárido crudo extraído de C. deserticola de Xinjiang, exhibió algunas propiedades de adyuvantes. Por ejemplo, WPCD mejoró las respuestas Th1 y Th2 activando las CD, aumentando las respuestas de anticuerpos y mejorando la producción de citoquinas. Además, exploramos el mecanismo de eficacia de WPCD analizando la maduración y la función de las CD a través de la vía TLR4 in vitro. En los ratones tratados únicamente con WPCD, no se observó ningún efecto secundario evidente. Por lo tanto, WPCD poseía una mayor actividad inmunoestimuladora en las respuestas inmunes celulares y humorales. Los adyuvantes son una mezcla de varios compuestos. Una mezcla de varios extractos crudos puede tener mayores efectos beneficiosos que un solo extracto de planta. Es necesario explorar sistemáticamente los extractos de WPCD, probar su eficacia y seguridad y dilucidar los mecanismos de sus efectos.

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