Combinaciones de fármacos sinérgicos de detección basadas en silico a partir de hierbas medicinales: un caso con el uso de Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Módulo de Neuroprotección

La neuroprotección son los mecanismos y estrategias utilizados para proteger contra la lesión neuronal o la degeneración en el SNC después de trastornos agudos (por ejemplo, accidente cerebrovascular o lesión/trauma del sistema nervioso) o como resultado de enfermedades neurodegenerativas crónicas (por ejemplo, Parkinson, Alzheimer, esclerosis múltiple). El objetivo de la neuroprotección es limitar la disfunción/muerte neuronal después de una lesión del SNC e intentar mantener el nivel más alto.

posible integridad de las interacciones celulares en el cerebro, lo que resulta en una función neuronal intacta. Como puede verse en la Fig. 4, algunos objetivos de la vía de la sinapsis serotoninérgica están involucrados en la función de neuroprotección. Por ejemplo, la producción de prostaglandinas a través de PTGS1 y PTGS2 (también conocidas como COX-1 y COX-2) es un mediador esencial para provocar mecanismos antiinflamatorios y novedosos de resolución56. Un estudio reciente ha demostrado que la expresión genética de ADCY5, una enzima que cataliza la generación de cAMP57, se reduce mediante la metilación del promotor en líneas celulares de HCC humano inducidas por COX-2-58. Con base en el análisis anterior, especulamos que la acumulación de COX-2 puede influir en la secreción de sAPP, la escisión de APP escindida por la -secretasa que es modulada por cAMP y ejerce además el efecto neuroprotector59,60. Nuestros resultados muestran que la neuroprotección juega un papel importante en el tratamiento de la neuroinflamación.

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Validación experimental

La viabilidad de las células de microglía BV2 tratadas con los compuestos.

Se alimentan células de microglía BV2 (8 x 104 células/ml) con concentraciones de 37,5 a 300 µM por mililitro de medio de cultivo sin suero de los cuatro compuestos durante 24 h. Consideramos que la viabilidad celular del grupo de control cultivado en ausencia de suero con menos del 0,1% de DMSO es del 100% (Fig. 5 (a – d)). No se observa citotoxicidad celular significativa con las dosis prescritas de los grupos.

Validación de la sinergia de fármacos y el posible efecto antiinflamatorio in vitro

Para evaluar más a fondo los resultados obtenidos in silico, se seleccionan cuatro compuestos que cubren tres pares sinérgicos, a saber, isoacteosido, 2′-acetilacteosido, echinacósido y verbascosido, para examinar sus efectos sinérgicos farmacológicos y su posible efecto antiinflamatorio utilizando células BV2 tratadas con LPS. En particular, realizamos análisis de transferencia Western para la expresión de las proteínas iNOS y COX-2 para confirmar la sinergia y los efectos antiinflamatorios de las combinaciones de fármacos previstas.

Como se muestra en la Fig. 5 (e – g), se informan los niveles de proteínas iNOS y COX -2 en el panel de líneas celulares BV2 analizadas. Observamos que en el tratamiento con isoactósidos o 2′-acetilactósidos, las expresiones de proteínas de iNOS y COX-2 en células BV2 disminuyeron significativamente a diferentes niveles de dosis. Sin embargo, el tratamiento con la combinación de isoactósido y 2′-acetilactósido induce un aumento significativo de los factores inflamatorios iNOS y COX-2 (Fig. 5(e)). La Figura 5(f) ilustra quetratamiento con equinacósido o verbascósido, como agente único, provoca una disminución en la expresión iNOS y COX-2. Además, como se esperaba, el tratamiento con equinacósido en combinación con verbascósido a una concentración de 150 µM dio como resultado una disminución más pronunciada en la

niveles de expresión de proteínas (iNOS y COX-2), lo que indica los efectos antiinflamatorios sinérgicos de esta combinación de medicamentos. De manera similar, como se indica en la Fig. 5 (g), la combinación de equinacósido y 2′-acetilactósido muestra un efecto sinérgico significativo sobre la inhibición de COX-2 a una concentración de 75 μM o 300 μM. Sin embargo, para iNOS, en dosis de 300 μM, la combinación representa una marcada supresión de la proteína. Por el contrario, encontramos que no hay efectos de inhibición obvios tanto en iNOS como en COX-2 acerca de la combinación de isoacteosido y 2′-acetilacteosido o echinacósido y verbascosido a una concentración de 75 μM (Figura 2 complementaria), además, el tratamiento con otros pares muestra un efecto mucho más débil en comparación con los agentes únicos en dosis de 150 o 300 μM que se puede ver en la Fig. 5 (e-g).

En resumen, el estudio in vitro proporciona información adicional para la detección de combinaciones de fármacos con efectos potencialmente antiinflamatorios y demuestra la confiabilidad de la estrategia de detección in silico.

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Discusión

La neuroinflamación está implicada en la mayoría de enfermedades neurológicas, psiquiátricas y del neurodesarrollo, por lo que no sólo es una consecuencia sino que podría ser un desencadenante de la patología. Sin embargo, los tratamientos actuales para la neuroinflamación son en su mayoría monoterapias, limitadas por efectos secundarios bien conocidos, como sabemos, los inhibidores de la COX-2 pueden provocar defectos cardiovasculares en respuesta al tratamiento a largo plazo, y el tratamiento dirigido al TNF podría causar infección a través de inmunosupresión. Los enfoques terapéuticos combinatorios pueden ser imperativos para mejorar el tratamiento de enfermedades complejas con las siguientes ventajas: la solidez de la red contrarrestada y la compensación de derivación, la mayor eficacia clínica manteniendo una toxicidad humana mínima y la dosis reducida de cada compuesto63. Sin embargo, la exploración de combinaciones de fármacos sinérgicas entre compuestos derivados de hierbas medicinales basadas en la farmacología del sistema está restringida por la posible razón principal de las grandes cantidades de compuestos.

En el trabajo, primero obtenemos 63 compuestos bioactivos potenciales delhierba Cistanche tubulosa, cumpliendo los criterios (DL mayor o igual a 0.18) para análisis posteriores con la ayuda de la predicción que es indispensable para descartar moléculas más prometedoras con propiedades deseables. Después de mapear los 133 objetivos de los 63 compuestos bioactivos potenciales en la base de datos, obtenemos 43 objetivos relacionados con la neuroinflamación, y luego el análisis de agrupamiento GOBP de los objetivos previstos probablemente pueda contribuir al tratamiento de la neuroinflamación. El resultado analítico de la red CT mostró un grado promedio por compuesto de 11,209 y 7,651 por objetivo, respectivamente, y 38 de ellos ajustaron más de 7 objetivos (mayores que el grado promedio). Por ejemplo, el echinacósido (mol41) predicho con 7 objetivos, el verbascósido (mol33), con 9 objetivos, o el B (mol57), con 8 objetivos, podrían desempeñar funciones clave en la neuroprotección, de acuerdo con la creciente literatura.

Conseguimos dianas terapéuticas directas como APP, MAPT (también conocido como Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 y HTR2A (también conocido como 5-HT2A), GRIN2B (subunidad 2B del receptor ionotrópico de glutamato tipo NMDA) y GRIA1. (subunidad 1 del receptor ionotrópico de glutamato AMPA) o objetivos potenciales posteriores como PTGS274 o NOS275 que están asociados con neuroinflamación o diversas enfermedades del sistema nervioso.

El análisis de la red Compound-Target-Pathway muestra 12 compuestos de los 10 principales pares de fármacos a través del algoritmo PEA, conectados con los 43 objetivos potenciales y las vías relacionadas con la neuroinflamación, por ejemplo, la vía de señalización del calcio, la interacción ligando-receptor neuroactivo o Vía de señalización de TNF, etc. En el sistema, estos compuestos predichos podrían actuar no solo en las proteínas de las vías ascendentes sino también descendentes asociadas con la neuroinflamación y los biomarcadores inflamatorios, en particular. Además, se proporciona información adicional para la detección de combinaciones de medicamentos con efectos potencialmente antiinflamatorios y la confiabilidad de la estrategia de detección in silico se verifica mediante validación experimental. La vía de la neuroinflamación se compone de la vía de la enfermedad de Alzheimer, la vía de señalización del calcio, la vía de señalización de la GnRH, la vía de señalización del VEGF y la sinapsis serotoninérgica. Los resultados analíticos nos explicaron claramente que los módulos de muerte celular, inflamación y neuroprotección se ejemplifican para descifrar el mecanismo deCistanche tubulosa para el tratamiento de la neuroinflamación..

La neuroinflamación acompaña a diversas enfermedades neurodegenerativas que podrían ser no solo una consecuencia sino también un desencadenante de la patología, por lo que se sugiere que las terapias antiinflamatorias sean un enfoque de tratamiento prometedor. Para nuestra decepción, aunque nos hemos dado cuenta de las limitaciones de las monoterapias, la evaluación y los mecanismos subyacentes de las terapias combinadas siguen siendo los principales desafíos en el desarrollo de la nueva estrategia alternativa. Por tanto, este trabajo podría ofrecer nuevas oportunidades terapéuticas para la neuroinflamación y abrir una nueva vía para descubrir combinaciones de fármacos a partir de productos naturales.

Materiales y métodos

Colección de compuestos

Un total de 66 ingredientes químicos de Cistanche tubulosa se obtienen manualmente del TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, incluidos 26 glucósidos feniletanoides, 22 iridoides, 4 lignanos, 7 glucósidos monoterpénicos, 2 sustancias nitrogenadas, 3 azúcares de benceno acriloilo, 1 esterol, 1 cetol. Dado queglucósidos en Cistanche tubulosaGeneralmente se hidrolizan para liberar aglicona que luego se absorbe en la mucosa intestinal, por lo que tomamos en consideración las moléculas sin glicólico, que están etiquetadas como _qt. Esto llevó a la generación de los 103 compuestos. Estas moléculas se proporcionan en la Tabla complementaria S1.

Evaluación de semejanza con los medicamentos

Para obtener los compuestos bioactivos potenciales de Cistanche tubulosa, evaluamos la similitud con los medicamentos de estos ingredientes calculando la similitud de Tanimoto entre los compuestos herbales y las propiedades moleculares promedio de todos los productos químicos en la base de datos del Drugbank. Y el modelo de predicción DL se ha aplicado con éxito en muchos estudios para seleccionar compuestos bioactivos. En el trabajo, el índice DL Mayor o igual a 0.18 de los candidatos se define como el valor umbral para adaptarse mejor al análisis posterior.

Predicción del objetivo farmacológico

La identificación de los objetivos de eficacia de los compuestos líderes sigue siendo un paso clave para hacer avanzar los compuestos hacia el desarrollo de fármacos. Aquí, se utilizan dos herramientas internas: SysDT y WES para derivar la información molecular objetivo para la pesca de fármacos. SysDT es un modelo en solitario que se realiza con la combinación de información química, genómica y farmacológica basada en dos poderosas herramientas matemáticas: Random Forest (RF) y Support Vector Machine (SVM) para abordar el problema de la identificación de objetivos de manera efectiva. El modelo obtenido sirvió como una plataforma valiosa para la predicción de interacciones fármaco-objetivo con una precisión general del 97,3%, una precisión de predicción activada del 87,7% y una precisión de predicción inhibida del 99,8%. Para capturar componentes más prometedores, los criterios de filtrado se definen como valor de RF mayor o igual a 0.7 o SVM mayor o igual a 0.8 en este estudio.

La similitud de conjunto ponderado (WES) es un nuevo y poderoso modelo computacional para identificar los objetivos directos del fármaco de los ingredientes bioactivos reales. Como herramienta novedosa, el modelo obtenido funciona bien en la predicción de la unión con una sensibilidad promedio del 85% (SEN) y los patrones no vinculantes con el 71% (SPE) con las áreas promedio bajo las curvas operativas del receptor (ROC, AUC) del 85,2% y una concordancia promedio del 77,5%. Los objetivos obtenidos se asignan a Uniprot para normalizar sus nombres y organismos posteriormente. Aquí, sólo elegimos los objetivos del Homo sapiens para su posterior análisis. Los objetivos candidatos de los compuestos seleccionados se asignan a la base de datos CTD para obtener sus enfermedades relacionadas y finalmente seleccionamos objetivos potenciales relacionados con la neuroinflamación.

Enriquecimiento y análisis de GO para objetivos

Para sondear los procesos biológicos involucrados de los objetivos obtenidos, asignamos los objetivos a DAVID y en esta sección se eligen los términos con un valor P menor que 0.05.

Análisis de combinación de medicamentos

En nuestro trabajo anterior, se aprovechó un marco de farmacología de sistemas para predecir combinaciones de medicamentos en un modelo recientemente diseñado, denominado Enfoque de conjunto de probabilidad (PEA) para analizar la eficacia clínica y los efectos adversos de las combinaciones de medicamentos. En detalle, se desarrolló una red bayesiana que se integra con un algoritmo de similitud para modelar las combinaciones de efectos moleculares y farmacológicos de compuestos. Luego se presentó la evaluación combinada que cubrió la eficacia clínica y los efectos adversos para los pares previstos. Brevemente, muestra que la PEA podría predecir la eficacia de los pares con alta especificidad y sensibilidad (AUC=0.90) en nuestro trabajo. En este trabajo, seleccionamos las diez mejores combinaciones de fármacos en función de sus probabilidades de sinergia, que representan la posibilidad de inducir sinergia entre dos compuestos.

Construcción y análisis de redes/vías

Para investigar las relaciones entre los ingredientes activos y las enfermedades inflamatorias, Cytoscape 2.8.1, un popular paquete de bioinformática para la visualización de redes biológicas y la integración de datos, genera una red de objetivo compuesto (CT) y una red de vía de objetivo compuesto (CTP). Las propiedades cuantitativas de la red se analizan mediante los dos complementos siguientes Network Analyzer y CentiScaPe 1.2. En la red gráfica, los nodos indican compuestos, objetivos o vías, mientras que los bordes codifican la interacción fármaco-objetivo. Para explorar más a fondo los efectos biológicos de cómo funcionan los objetivos celulares mediante la modulación de múltiples vías metabólicas, se ensambla una "vía" incorporada a partir de la información actualizada sobre la patología de la neuroinflamación. En primer lugar, al mapearlos en la base de datos KEGG, los perfiles objetivo logrados se agregan en varias rutas. Después de abandonar las secciones indirectas, se integra manualmente una vía relativamente sintetizada en función de los datos patológicos y clínicos.

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Validación experimental

Preparación de muestras

Echinacósido, verbascósido, isoactósido y 2′-acetilactósidose compran en Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, China). Las muestras de prueba se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, EE. UU.) para obtener 100 mM, como solución madre, y luego se almacenan a 4 grados. Las diluciones finales de DMSO añadidas al medio de cultivo nunca superaron el 0,1%, lo que aseguró que no hubiera ningún efecto sobre la viabilidad celular.

Cultivo de células

Las células de microglía de ratón BV2 fueron desarrolladas originalmente por el banco de células de la Academia China de Ciencias de Shanghai y cultivadas en tareas de 25 o 75 cm2 con medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM/HEPES 25 mM) (Gibco BRL, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %. (Gibco BRL, EE. UU.), penicilina G (100 unidades/mL) y estreptomicina (100 mg/mL) en una incubadora humidificada con 5% CO2/95% O2 a 37 grados.

Ensayo de viabilidad celular

Se siembran células de microglía BV2 en una placa 96-de pocillos a una densidad de 1 x 105 células/ml, después de incubarlas durante 18 h, las células se tratan con 100 ul de medio nuevo con o sin diversas concentraciones indicadas de muestras de prueba para 24 h adicionales. El ensayo CCK-8 (BestBio, Shanghai, China) es un método conveniente y confiable para determinar la viabilidad de las células. Para eliminar el fondo de las muestras de prueba, descartamos todo el medio de cultivo, después de lo cual se agregan 100 ul/pocillo de medio fresco que contiene una solución de CCK-8 al 10 %. Los valores de DO a 450 nm se leen en un lector de microplacas (Molecular Devices, California, EE. UU.) después de una incubación de 3 h a 37 grados y 5 % de CO2.

Análisis de Western Blot

La proteína celular se extrae de líneas celulares utilizando un kit de preparación de proteínas de mamíferos Qproteome™ (Qiagen, Alemania) después de los procedimientos indicados por el protocolo del fabricante. El kit de ensayo de proteínas Quick Stari Bradford (Bio-Rad, EE. UU.) se aplica a la cuantificación de proteínas. Se desnaturalizan cantidades equivalentes de proteína (50ug) hirviendo a 100 grados durante 10 minutos con tampón de carga de muestra 2*laemmli (Bio-Rad, EE. UU.) más mercaptoetanol al 5 % en una proporción de 1:1 y cargado por carril en SDS-PAGE al 12% (minigeles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio), electrotransferido a membranas de fluoruro de polivinilideno (PDVF) de 0,45 μm (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.) durante 150 min a 200 mA. Posteriormente, las membranas se bloquean en albúmina sérica bovina (BSA) al 3% a temperatura ambiente y se incuban con los anticuerpos primarios iNOS y COX-2 (Abcam) a 4 grados durante la noche. Después de tres lavados minuciosos en solución salina tamponada con Tris (TBST) cada uno durante 5 minutos, las membranas se sondan con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (diluciones 1:10000; Abcam) durante 1,5 h a temperatura ambiente. Luego, las bandas inmunorreactivas se visualizan utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, EE. UU.) después de lavar dos veces en TBST y una vez en TBS, cada vez durante 5 minutos. Los valores densitométricos se normalizan utilizando -actina como control interno de carga.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como medias ± error estándar y el análisis de transferencia Western se repite en tres experimentos independientes con el mismo resultado. El análisis de varianza unidireccional se utiliza para comparar las diferencias de medias para tres o más grupos, la significación estadística se analiza con la prueba t de Student entre dos grupos.

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