Información in vitro e in silico sobre los inhibidores de la tirosinasa

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a

Resumen

La tirosinasa es una enzima clave responsable de la biosíntesis de melanina y es eficaz para proteger la piel del daño causado por la radiación ultravioleta. Como parte de los esfuerzos en curso para descubrir potentes inhibidores de la tirosinasa, diseñamos y sintetizamos sistemáticamente trece derivados de (E)-bencilideno-1-indanona (BID1–13) y determinamos sus actividades inhibidoras contra la tirosinasa. Entre los compuestos evaluados, BID3 fue el inhibidor más potente de la tirosinasa de hongos (IC50=0.034 mM, actividad de micofenolato; IC50=1.39 mM, actividad de difenoles). Los estudios cinéticos revelaron que BID3 demostró un tipo mixto de inhibición de tirosinasa con un valor de Ki de 2,4 mM usando L-DOPA como sustrato. Las simulaciones de acoplamiento molecular in silico demostraron que BID3 puede unirse a los sitios catalíticos y alostéricos de la tirosinasa para inhibir la actividad enzimática, lo que confirmó los estudios experimentales in vitro entre BID3 y la tirosinasa. Además, el contenido de melanina disminuyó y la actividad de la tirosinasa celular se inhibió después del tratamiento con BID3. Estas observaciones revelaron que BID3 es un potente inhibidor de la tirosinasa y potencialmente podría usarse como agente blanqueador para el tratamiento de trastornos relacionados con la pigmentación.

Cistanche: hierba agente blanqueador de la piel

1. Introducción

La melanina es sintetizada por los melanocitos en la capa vasalla de la epidermis, generalmente se refiere a la familia de pigmentos comúnmente conocidos por proteger la piel de los mamíferos del daño causado por la radiación ultravioleta dañina al eliminar los radicales libres o dispersar la luz ultravioleta entrante [1]. Sin embargo, la generación abundante de melanina puede causar una hiperpigmentación visible de la epidermis, que puede manifestarse como melasma, pecas, manchas de la edad o lentigos seniles[2].

La tirosinasa (EC 1.14.18.1), una metaloenzima que contiene cobre, es una enzima clave involucrada en los procesos melanogénicos. La tirosinasa cataliza los dos pasos limitantes de la melanogénesis; hidroxilación de tirosina (actividad cresolasa o micofenolato) para producir 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y la posterior oxidación de L-DOPA (actividad catecolasa o difenoles) a la correspondiente DOPA-quinona. Cuando la L-tirosina es el sustrato, el producto de la reacción catalizada por tirosinasa es DOPA-quinona, que luego se convierte en melanina [3]. Estos pasos son cruciales para la protección de la piel contra los rayos UV. El hongo Agaricus se utiliza por su alta homología disponible comercialmente con la enzima tirosinasa de mamíferos, lo que lo convierte en un modelo muy adecuado para estudios sobre la melanogénesis [4]. En los humanos, la melanina ayuda a defender la piel del daño causado por los rayos UV [5]. Sin embargo, el nivel excesivo de melanina puede causar varios trastornos dermatológicos que incluyen hiperpigmentaciones, melasma, pecas y manchas de la edad [6]. Por lo tanto, se requieren inhibidores de la tirosinasa nueva que muestren propiedades blanqueadoras de la piel y similares a las de los fármacos para inhibir la pigmentación excesiva de la piel.

1-La indanona, con un esqueleto de benzoil-ciclopentanona, se considera como los primos rígidos de las chalconas, incorporando el sistema de cetonas insaturadas de las chalconas que forman un anillo cíclico de 5 miembros, que es un componente natural presente en diversas fuentes de plantas comestibles [7 ]. Varios estudios han demostrado que los compuestos que poseen una fracción 1-indanona tienen importancia farmacológica, ya que muestran varias actividades biológicas beneficiosas, que incluyen antiinflamatorio [8–10], anticancerígeno [11,12], antioxidante [13], anti-Parkinson [14], contra la enfermedad de Alzheimer [15–17], antimicrobiana [18], antiinmune supresora [19] y antitirosinasa [20].

Las calconas (1,3-diaril-2-propias-1-onas) son cetonas aromáticas que constan de dos anillos aromáticos unidos a un sistema de carbonilo a,b-insaturado de tres carbonos como núcleo central [21, 22]. Estos son componentes naturales que se encuentran en varias plantas naturales comestibles y se consideran compuestos precursores de una ruta sintética de flavonoides e isoflavonoides como pirazolinas, pirimidina, flavanol, flavonas, flavanonas, isoflavonas, auronas, antocianidinas, dihidroflavonoides y dihidrocalcona [23–25]. El sistema de carbonilo insaturado a,b es fundamental para el tipo de actividad biológica, ya que estos sistemas se distribuyen en muchos productos naturales como las chalconas y la indanona, donde las moléculas son relativamente más planas y la transmisión de los efectos electrónicos de los sustituyentes arilo está dirigida. al grupo carbonilo [7]. Muchos investigadores anteriores informaron que las chalconas se destacaron como una nueva clase de inhibidor de la tirosinasa en varias publicaciones [26–29]. tirosinasa y actividades antimelanogénicas contra melanocitos murinos.

De acuerdo con nuestros datos informados anteriormente, los derivados con un andamio de carbonilo (E)-b-fenil-a,b-insaturado mostraron inhibición de la potentirosinasa [32-34]. Las (E)-benciliden-1-indanonas pueden ser un agente antimelanogénico atractivo ya que los compuestos tienen el andamiaje de carbonilo (E)-b-fenil-a,b-insaturado en su estructura química. En particular, Radhakrishnan et al. (2015) [20]diseñó y sintetizó una serie de derivados de bencilideno-1-indanona con una configuración (Z) y evaluó su actividad anti-tirosinasa. Aunque estos derivados de (Z)-bencilideno-1-indanona se han investigado, las actividades anti-tirosinasa y antimelanogénicas de los derivados de (E)-bencilideno-1-indanona aún no se han analizado.

Por lo tanto, diseñamos y sintetizamos trece compuestos (BID1–13) del esqueleto de 1-indanona que contiene un bencilideno en forma (E). Entre estos compuestos sintéticos, un grupo 2,4-dihidroxi en el anillo B de 1-indanona mostró la mayor inhibición de la tirosinasa (aproximadamente 400-veces más eficaz que el ácido kójico, control positivo). Además, evaluamos aún más la actividad inhibidora de la tirosinasa BID3 y caracterizamos su papel regulador en la síntesis de melanina utilizando células de melanoma B16F10. En experimentos extensos, evaluamos el potencial antimelanogénico de BID3 y buscamos identificar la cinética enzimática y los estudios de acoplamiento molecular. En experimentos sucesivos, también se exploró el potencial de tirosinasa celular BID3 y la producción de melanina en células de melanoma B16F10 inducidas por a-MSH e IBMX.

ANTIOXIDACIÓN Y APARIENCIA DE LA PIEL: EXTRACTO DE CITANCHE

2. Materiales y métodos

2.1. reactivos

Tirosinasa de hongos (EC 1.14.18.1), hormona estimulante de melanocitos alfa (a-MSH), 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), L-tirosina, L-3,{{ Se compraron 11}}dihidroxifenilalanina (L-DOPA), dimetilsulfóxido (DMSO), ácido kójico, ácido ftálico y ácido trans-cinámico de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero bovino fetal (FBS), la estreptomicina y la anfotericina se adquirieron de WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, Corea del Sur). Todos los demás reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich.

extracto de cistanche tubulosa

2.2. Química

2.2.1. Métodos generales

Todos los reactivos se obtuvieron comercialmente y se usaron sin purificación adicional. La cromatografía en capa fina (TLC) y la cromatografía en columna se realizaron en placas 60F245 prerrecubiertas de Merck y MP Silica 40–63, 60 Å, respectivamente. Los datos de espectroscopia de masas de alta resolución (HR) se obtuvieron en un espectrómetro de masas de cromatografía líquida (LC) de tiempo cuádruple de vuelo (Q-TOF) Agilent AccurateMass (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) en modo positivo ESI. Los espectros de resonancia magnética nuclear (NMR) se registraron en un espectrómetro Varian Unity INOVA 400 o un espectrómetro Varian UnityAS500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) para 1H NMR (400 y 500 MHz) y para 13C NMR (100 MHz), respectivamente . Se usaron DMSO d6, CD3OD y CDCl3 como disolventes de RMN para muestras de RMN. La constante de acoplamiento (J) y los valores de desplazamiento químico se midieron en hercios (Hz) y partes por millón (ppm), respectivamente. Las abreviaturas utilizadas en el análisis de los datos de RMN 1H son las siguientes: s (singlete), bs (singlete amplio), d (doblete), dd (doblete de dobletes), t (triplete), TD (triplete de dobletes), q ( cuarteto), andm (múltiple).

2.2.2. Procedimiento para la síntesis de BID1–13

Se agitó a temperatura ambiente una solución de benzaldehído (1,1-1,2 equivalentes) y 1-indanona (100 mg, 0,76 mmol) en ácido acético HCl 1 M (0,4 ml). durante 4 a 48 horas. Tras la adición de agua, los precipitados se filtraron y lavaron con agua y hexano:acetato de etilo (1:1), hexano:diclorometano (4:1-1:1) o una mezcla de diclorometano y metanol, según las propiedades de los benzaldehídos restantes. para dar (E)-bencilideno-1-indanonas (BID1–13) en rendimientos de 32,8–99,1 por ciento. La caracterización estructural (RMN de 1H y 13C y datos de masa de todos los BID) de los compuestos sintetizados se proporciona en Información complementaria.

2.2.2.1. (E)-2-(4-Hidroxibencilideno)-2,3-dihidro-1H-inden-1-uno(BID1).

Sólido amarillo; rendimiento, 93,4 por ciento; tiempo de reacción, 6 h; fórmula molecular, C16H12O2; pf, 224,7–225,9 C; RMN 1H (400 MHz, DMSO d6) d 10,10 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,64–7,58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7,43 (s, 1H, vinílico H), 7,39 (t,1H, J=7,2 Hz, 6-H), 6,87 (d, 2H, J=8,0 Hz, 30-H, {{46 }}H), 3,99 (s, 2H,CH2); RMN de 13C (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 160,1, 150,4, 138,3, 135,1, 134,0, 133,6, 132,2, 128,2, 127,2, 126,7, 124,1, 116,7, 32,6; HRMS más m3O C1 (6) H) más calcd 237.0910, obsd 237.0911.

2.2.2.2. (E)-2-(3,4-Dihidroxibencilideno)-2,3-dihidro-1H-inden-1-ona (BID2).

Sólido amarillo; rendimiento, {{0}}.6 por ciento; tiempo de reacción, 5 h; fórmula molecular, C16H12O3; pf, 251,2–252,4 C; RMN 1H (400 MHz, DMSO d6) d 9,65 (s, 1H, OH), 9,24 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H,J=7 0,6 Hz, 7-H), 7,66–7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7,42 (t, 1H,J {{35 }}.2 Hz, 6-H), 7.35 (s, 1H, vinilo H), 7.19 (s, 1H, 20-H), 7.08 (d,1H , J=8.0 Hz, 60-H), 6.83 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 3.98 (s, 2H,CH2 ); RMN de 13C (100 MHz, DMSO d6) d 193,8, 150,4, 148,7, 146,3, 138,3, 135,1, 134,5, 132,0, 128,2, 127,3, 127,1, 125,0, 124,0, 118,2, 316,7; HRMS (ESI más ) m/z C16H13O3 (M más H) más calcd253.0859, obsd 253.0857.

2.2.2.3. (E)-2-(2,4-Dihidroxibencilideno)-2,3-dihidro-1H-inden-1-uno (BID3).

Sólido amarillo; rendimiento, 5{{20}}.9 por ciento; tiempo de reacción, 10 h; fórmula molecular, C16H12O3; pf, 198,5–199,9 C (diciembre); RMN 1H (500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, vinílico H), 7,82 (d, 1H, J=8,0 Hz,60-H), 7,67–7,63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7,45 (t, 1H, J=7,0 Hz, 6-H), 6,45 (d , 1H, J=8,5 Hz, 50-H), 6,39 (s, 1H, 30-H), 4,01 (s, 2H,CH2); RMN de 13C (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 161,6, 160,4, 150,3, 138,6, 134,8, 131,7, 130,3, 128,7, 128,1, 127,2, 123,9, 114,3, 108,6, 103,7;, 3 HRMS (ESI más) m/z C16H13O3 (M más H) más calcd253.0859, obsd 253.0858.

2.2.2.4. (E)-2-(4-Hidroxi-3-metoxibencilideno)-2,3-dihidro-1Hinden-1-ona (BID4).

Sólido amarillo; rendimiento, 52.0 por ciento; tiempo de reacción, 4 h; fórmula molecular, C17H14O3; pf, 186,9–187,4 C; RMN 1H (400 MHz, DMSO d6) d 9,71 (s, 1H, OH), 7,73 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,67–7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7,43(t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 7,31 (s, 1H, vinílico H), 7,24 (dd, 1H, J=8.0,2.0 Hz, 60-H), 6.87 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 4.05 (s, 2H, CH2 ), 3,84(s, 3H, OCH3); RMN de 13C (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 150,5, 149,7, 148,5, 138,3, 135,2, 134,4, 132,3, 128,2, 127,3, 127,1, 125,7, 124,1, 116,6, 116,5, 4, 35,3 HRMS (ESI plus) m/z C17H15O3(M plus H) plus calcd 267.1016, obsd 267.1016.

2.3. Evaluación biológica

2.3.1. Ensayo inhibidor de tirosinasa de hongos

El ensayo de actividad inhibitoria de tirosinasa se realizó utilizando tirosinasa de hongo como se describió anteriormente, con modificaciones menores [35,36]. Brevemente, se agregaron 10 mL de una concentración específica de cada compuesto (0.0005–50 mM) y 20 mL de tirosinasa de hongo (1000 unidades/mL) en un tampón de fosfato 50 mM (pH 6.5) a una reacción de 170 mL. mezcla en una microplaca de 96-pocillos (Corning, EE. UU.). La proporción de solución de L-tirosina o L-DOPA 1 mM, tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 6,5) y agua destilada fue de 10:10:9. Las mezclas de reacción se incubaron a 37 °C durante 30 min. Después de eso, se midió la cantidad de dopacromo producido en cada pocillo mediante análisis espectrofotométrico a 492 nm (OD492) utilizando un lector de microplacas. La tasa de inhibición de tirosinasa (porcentaje) se calculó como (1 Absmuestra/Abscontrol) 100 por ciento. El grado de inhibición de la muestra se expresó como la concentración requerida para una inhibición del 50 por ciento (IC50).

2.3.2. Análisis cinético enzimático con tirosinasa

Para determinar los mecanismos cinéticos de inhibición, se utilizaron dos métodos cinéticos complementarios: Lineweaver-Burk y Dixonplots [37-39]. Mediante gráficos de Lineweaver-Burk (gráficos recíprocos dobles), se determinó el tipo de inhibición de BID3 utilizando varias concentraciones de L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 y 1 mM), como sustratos, en ausencia y presencia de varias concentraciones de BID3 (1, 2 y 4 lM). Se obtuvo una inhibición de cuarentasinasa en un gráfico de Dixon (gráficos recíprocos simples) en presencia de varias concentraciones de L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 y 1 mM ). Las concentraciones de BID3 fueron 1, 2 y 4 mM. Los procedimientos enzimáticos consistieron en los métodos de ensayo de tirosinasa descritos anteriormente. La constante de inhibición (Ki) se determinó a partir de la interpretación de las gráficas de Dixon.

2.3.3. Simulaciones de acoplamiento molecular de tirosinasa

Para determinar la estructura del complejo enzima-inhibidor y garantizar la precisión, la repetibilidad y la confiabilidad de los resultados del acoplamiento, empleamos el software AutoDock 4.2. Para los estudios de dicking, las estructuras cristalinas de la proteína tirosinasa de hongo objetivo se obtuvieron a partir de la alineación de secuencias de proteínas (Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Se realizaron simulaciones de acoplamiento automatizadas entre tirosinasa y ácido kójico, ácido ftálico, ácido cinámico o BID 3. Para el procedimiento de acoplamiento: conversión de 2D en estructuras 3D, cargas calculadas y átomos de hidrógeno agregados usando el programa ChemOffice (http://www.cam bridgesoft.com) [41 ] Se utilizó LigandScout 4.1.5 para la predicción de posibles interacciones entre ligandos y tirosinasa y la identificación de farmacóforos.

2.3.4. Ensayo de cultivo celular y viabilidad celular.

Se compraron células B16F10 de melanoma murino del Korean Cell Line Bank (KCLB, Seúl, Corea) y se cultivaron en DMEM complementado con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de estreptomicina, y luego se incubaron a 37 °C, se humidificaron con 5 por ciento de CO2 atmosférico. Los análisis de viabilidad celular se realizaron como se describió anteriormente [42]. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 1 104 células/pocillo en una placa de 96-pocillos durante 24 h. Al día siguiente, las células se expusieron a diferentes concentraciones de BID3 y se incubaron durante 24 o 48 h, respectivamente. Luego, se agregaron 10 ml de solución EZ-Cytox a cada pocillo y las células se incubaron durante 2–4 h. La absorbancia se determinó mediante ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Cada ensayo se realizó por triplicado.

2.3.5. Ensayo de contenido de melanina

El contenido de melanina se determinó como se describió previamente [43]. Se sembraron células de melanoma B16F10 (2 x 105 células/pocillo) en 6-placas de cultivo de pocillos. Para determinar el efecto inhibidor de BID3 en la melanogénesis, se reemplazó el medio fresco con medio que contenía BID3 (1, 5 y 10 lM) o ácido kójico (10 mM) como control positivo durante 1 h, y luego se estimuló con a-MSH (5 lM ) e IBMX (200 mM) durante 48 h. Después de lavarlas dos veces con PBS, las células se separaron mediante incubación en tripsina/EDTA y los sedimentos se disolvieron en 100 ml de NaOH 1 N y luego se incubaron a 60 °C durante una mano mezclada para solubilizar la melanina. Los contenidos de melanina se determinaron midiendo la absorbancia a 405 nm utilizando el lector ELISA (TECAN, Sunrise, Austria). El contenido de melanina se calculó usando la siguiente ecuación: (muestra/control) - 100 por ciento. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

2.3.6. Actividad de tirosinasa celular

La actividad de la tirosinasa celular se evaluó como se describió anteriormente, con ligeras modificaciones [44,45]. Brevemente, 2 105/células se sembraron en 6-placas de pocillos y se incubaron durante la noche. Las células se expusieron a varias concentraciones de ácido orcójico BID3 (1, 5 y 10 mM) (10 mM) durante 1 h y, posteriormente, se estimularon con a-MSH (5 mM) e IBMX (200 mM) durante 48 h. Después de lavarlas dos veces con PBS, las células se lisaron con 100 ml de solución de lisis que contenía tampón de fosfato 50 mM (pH 6,5), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM y Triton X al 1 %-100 y se congelaron a 80 °C durante 30 min. Los lisados ​​se descongelaron y centrifugaron a 12,000 rpm durante 30 min a 4 C. Luego, el sobrenadante (80 ml) se combinó con 2 mg/ml de L-DOPA (20 ml) en una placa de 96-pocillos . Después de la incubación a 37 C durante 30 min, se midió la densidad óptica a 492 nm utilizando un lector ELISA (TECAN, Salzburgo, Austria). La concentración de proteína se determinó usando un reactivo de ensayo de proteína BCA usando BCA como estándar (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.).

Beneficio del extracto de Cistanche: inhibe la tirosinasa.

2.3.7. análisis estadístico

Todos los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM). Los datos fueron analizados por análisis de varianza de una vía (ANOVA) para determinar diferencias entre tratamientos, seguido por la prueba posthoc de Bonferroni. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p <>

3. Resultados y discusión

3.1. Química

Los derivados de (E)-bencilideno-1-indanonas (BID1–13) se sintetizaron de acuerdo con el esquema general 1. En este estudio, se sintetizaron trece derivados de (E)-2-bencilideno-1-indanona y sus Se examinaron las propiedades inhibidoras de la tirosinasa. Los derivados de la (E)-2-bencilideno-1-indanona se sintetizaron empleando condiciones ácidas (HCl 1 M en ácido acético). Estas reacciones generaron el (E)-2-bencilideno-1- objetivo derivados de indanona en rendimientos de 32,8 a 99,1 por ciento. Parece que solo los isómeros E de 2-bencilideno-1-indanonas se generaron debido a la cepa A conocida como cepa 1,3-alílica. La tensión A (esterihidrancia) entre el anillo fenilo y el grupo carbonilo en el isómero Z es aparentemente mayor que la existente entre el anillo fenilo y el grupo metileno en el isómero E. Las estructuras de los compuestos sintéticos se verificaron mediante RMN de 1H y 13C y espectrometría de masas como se describe en la sección experimental (Figs. S1–S38). En particular, el desplazamiento químico del protón olefínico está protegido en el isómero E de 2- bencilideno debido al efecto anisotrópico del grupo carbonilo y aparece campo abajo (por encima de 7 ppm) en comparación con el isómero Z (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">

Esquema 1. Síntesis de (E)-2-benciliden-1-indanonas.

3.2. Propiedades inhibidoras de la tirosinasa de los compuestos.

El potencial inhibidor de la tirosinasa de los derivados de (E)-bencilideno-1-indanonas se examinó utilizando tirosinasa de hongo. El micofenolato (L-tirosina) y los difenoles (L-DOPA) se utilizaron como sustratos para estos experimentos [35]. Se realizaron reacciones enzimáticas con tirosinasa, sustrato e inhibidores de prueba. Todos los compuestos probados demostraron una inhibición dependiente de la concentración. Los valores IC50 de los derivados de (E)-bencilideno-1-indanonas se muestran en la Tabla 1.

Tanto en sustratos de L-tirosina como de L-DOPA, BID3 exhibió una fuerte actividad inhibidora con valores de IC50 de 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM y 1,39 ± 0.00004 mM, respectivamente, en comparación con el control positivo ácido kójico, que tenía valores de CI50 de 13,77 ± 0,20 mM y 33,14 ± 0,93 mM, respectivamente (Fig. 1A). Además, BID6 mostró una potente actividad hacia L-tirosina y L-DOPA con valores de IC50 de 5,00 ± 0,91 mM y 53,11 ± 2,79 mM, respectivamente. BID1 mostró una inhibición significativa contra la tirosinasa a través de las vías L-tirosina y L-DOPA, con valores IC50 de 39,74 ± 3,71 mM y 130,0 ± 5,39 mM, respectivamente. BID4 y BID11 mostraron actividad inhibidora de tirosinasa moderada. Otros derivados fueron inactivos. Asimismo, BID2 mostró actividad significativa hacia L-tirosina y L-DOPA, con valores de IC50 de 41.27 ± 3.03 mM y 52.93 ± 2.62 mM. Además, los inhibidores de tipo mixto reportados, ácido ftálico y ácido cinámico no mostraron inhibición. efecto a la concentración de 200 mm [47].

En consonancia con los resultados de los estudios de relación estructura-actividad (SAR), los derivados que contienen sustituyentes de (E)-bencilideno-1-indanona en el anillo de fenilo influyeron notablemente en la inhibición potencial de la tirosinasa. BID3, que inhibía la tirosinasa con la potencia más alta, lleva un grupo hidroxi 2- en presencia de un grupo hidroxi 4- e inhibía en gran medida la actividad de la tirosinasa (BID1 frente a BID3). Estos resultados sugirieron que el grupo 2,4-dihidroxi (resorcinol) en la estructura del anillo de fenilo puede ser responsable de la inhibición mejorada de la tirosinasa. Curiosamente, en un estudio anterior sobre posibles inhibidores sintéticos de la tirosinasa, demostramos que la sustitución 2,4-dihidroxi inhibía potentemente la actividad de la tirosinasa [48,49]. Además, nuestros datos de SAR también indicaron que la introducción de un grupo hidroxi 3-en presencia de un grupo hidroxi 4- afecta a la inhibición de la tirosinasa. Estos fenómenos fueron demostrados por el hallazgo de que un 4-anillo de metoxi-3-hidroxifenilo aumentaba la actividad inhibidora contra la tirosinasa, mientras que la introducción de un grupo 3,4-dihidroxi (resto de catecol) disminuía la actividad inhibidora de la tirosinasa ( BID2 frente a BID6) [35]. Estos resultados sugieren que el grupo 3-hidroxi-4-metoxi también es responsable de la actividad inhibidora de la tirosinasa. Sin embargo, en nuestro presente estudio, BID9 y BID11, que contienen grupos 2,4-dimetoxifenilo o 3,5-dimetoxifenilo, mostraron una actividad inhibitoria moderada de la tirosinasa. Según los valores de IC50 a través de la vía L-tirosina y L-DOPA, BID3 demostró la actividad inhibidora de tirosinasa más potente, por lo tanto, estudiamos más a fondo el mecanismo subyacente a este efecto inhibidor. Radhakrishnan et al. (2015) [20] informaron que los compuestos de (Z)-bencilideno-1-indanona sustituidos con hidroxilo son potentes inhibidores de la tirosinasa. Aunque estudios previos han demostrado que los derivados de (Z)-bencilideno-1-indanona sustituidos con hidroxilo poseen actividad anti-tirosinasa, hasta donde sabemos, no ha habido informes de inhibición de la tirosinasa por (E)-bencilideno-1- derivados de indanona utilizando experimentos basados ​​en células.

Tabla 1. Potencial inhibitorio de la tirosinasa de hongos de la 2,3-dihidro-1H-inden-1-ona (1-indanona) sustituida similar a la chalcona

derivados (BID1–13).

Fig. 1. Inhibición dependiente de la concentración de la actividad de tirosinasa de hongos por BID3 y ácido kójico (control positivo) (n=3).

3.3. Análisis cinético enzimático de la inhibición de la tirosinasa

Dado que BID3 era el inhibidor más potente, estudiamos más a fondo el mecanismo subyacente a su efecto inhibidor. En un intento de explicar el modo de inhibición enzimática, se realizaron análisis cinéticos a varias concentraciones de L-DOPA y varias concentraciones de BID3. Los diagramas de Dixon y Lineweaver-Burk se dibujaron utilizando los datos obtenidos de los estudios cinéticos para confirmar el patrón de inhibición y las constantes de inhibición (Ki) se determinaron mediante la interpretación de los diagramas de Dixon (Fig. 2A y B). La concentración de L-DOPA se indica como sigue: 1, 2, 4 mM. La intersección se encuentra en el lado izquierdo, lo que indica una inhibición de tipo mixto contra la tirosinasa con un valor de Ki de 2,4 mM (Fig. 2B). El valor de Ki representa las concentraciones requeridas para formar un complejo enzima-inhibidor, por lo que un inhibidor con un valor de Ki más bajo indica una mayor actividad de inhibición de la tirosinasa.

El acoplamiento molecular ha aportado información importante sobre el descubrimiento de fármacos durante muchos años. Sin embargo, los procedimientos de acoplamiento tienen como objetivo identificar las posiciones correctas de los ligandos en el bolsillo de unión de una proteína y predecir la afinidad entre el ligando y la proteína. En otras palabras, el acoplamiento describe un proceso mediante el cual dos moléculas encajan en un espacio tridimensional. Para determinar si BID3 se une al sitio activo de la tirosinasa, se realizó un análisis de acoplamiento molecular para identificar las posibles posiciones de unión de BID3 en la estructura cristalina de la tirosinasa de hongo (PDB ID: 2Y9X) (Fig. 3A). Estos resultados se calcularon utilizando AutoDock4.2. programa. La posición de unión más estable fue la que obtuvo la puntuación más baja [50]. Recientemente, Hassani et al. [47] informaron que el ácido cinámico y el ácido ftálico eran inhibidores de la tirosinasa de modo mixto. Por lo tanto, se utilizaron ayuda, ácido cinámico y ácido ftálico para validar los resultados del acoplamiento [51]. Los modelos de acoplamiento molecular de BID3 y ácido kójico (conocido inhibidor de tipo competitivo) en el sitio catalítico de la tirosinasa se ilustran en la figura 3B [52]. ]. El complejo inhibidor de tirosinasa-BID3 presentó una energía de unión de 6,28 kcal/mol, incluidos dos enlaces de hidrógeno con los residuos de tirosinasa ASN260 y MET280, y se observaron interacciones hidrofóbicas entre BID3 y los residuos de tirosinasa VAL248, PHE264 y VAL283, lo que estabilizó aún más la interacción en el sitio catalítico para tirosinasa de hongo (Tabla 2 y Fig. 3E y H). Además, los modelos de acoplamiento molecular de BID3, ácido ftálico (inhibidor alostérico 1) y ácido cinámico (inhibidor alostérico 2) en los dos sitios alostéricos se ilustran en la Fig. 3C y 3D. El ácido ftálico y el ácido cinámico se tomaron como ligandos de referencia en los sitios alostéricos 1 y 2, respectivamente [47,51]. Como se muestra en las Fig. 3F e I, BID3 y el ácido ftálico exhibieron un enlace de hidrógeno con el residuo TRY140 de la tirosinasa y tres residuos de interacciones hidrofóbicas con LEU24, PHE147 e ILE148 de la tirosinasa en el sitio alostérico 1. Las interacciones de ligando correspondientes de BID3 y ácido cinámico en el sitio alostérico 2 de tirosinasa incluía enlaces de hidrógeno entre ASP312 y LYS376 de tirosinasa, mientras que THR308 interactuaba hidrofóbicamente en el sitio alostérico 2 (Fig. 3G y J). Además, se encontró que la unión de BID3-tirosinasa ejerce energía de unión en ambos sitios alostéricos de la tirosinasa (4,38 y 5,68 kcal/mol, respectivamente), lo que indica una alta afinidad de unión con ambos sitios alostéricos. Sobre la base de estudios enzimáticos, BID3 ejerció una inhibición de tipo mixto, la capacidad de unión de BID3 tanto con el sitio catalítico como con dos sitios alostéricos confirmó su inhibición de tipo mixto de la tirosinasa.

Fig. 2. Gráficos de Lineweaver-Burk (A) y Dixon (B) para la inhibición de la tirosinasa de hongo por BID3 usando L-DOPA como sustrato.

3.4. Actividad biológica

Para explotar los efectos antitirosinasa de BID3 en el modelo de cultivo celular, examinamos sus efectos citotóxicos en las células B16F10. Las células se trataron con diferentes concentraciones de BID3 (1–20 mM) durante 48 h y se evaluaron mediante el ensayo EZ-Cytox. Los resultados indicaron que BID3 no tenía un efecto citotóxico significativo en células de melanoma B16F10 hasta 20 mM (Fig. 4A y B). Por lo tanto, se realizaron experimentos posteriores usando BID3 hasta 20 mM.

Tabla 2 Sitios de unión y puntajes de acoplamiento de BID3 en tirosinasa de hongo (PDB ID: 2Y9X) según lo determinado usando el programa AutoDock4.2.

La melanogénesis está regulada por una cascada enzimática de tirosinasa. Por esta razón, se han desarrollado varios compuestos blanqueadores de la piel para disminuir la actividad de la tirosinasa. El ácido kójico, un inhibidor de la tirosinasa, se utilizó como control positivo [53]. Por lo tanto, para investigar los efectos de BID3 en la hiperpigmentación inducida por la elevación de AMPc, se trataron células B16F10 con a-MSH e IBMX en presencia de BID3 (1, 5 y 2{{20}} mM) durante 48 h, y se determinaron los contenidos de melanina y las actividades de tirosinasa celular (Fig. 4C y D). El tratamiento con a-MSH e IBMX indujo un aumento significativo (P < 0.001#)="" en="" el="" contenido="" de="" melanina="" (fig.="" 4c)="" y="" la="" actividad="" de="" tirosinasa="" celular="" (fig.="" 4d)="" en="" células="" b16f10="" en="" comparación="" con="" el="" control="" no="" tratado.="" sin="" embargo,="" el="" tratamiento="" con="" bid3="" significativamente="" (p="">< 0,01**;="" p="">< 0,001***)="" y="" una="" disminución="" dependiente="" de="" la="" concentración="" del="" contenido="" de="" melanina="" y="" la="" actividad="" de="" la="" tirosinasa="" celular="" de="" las="" células="" b16f10="" en="" comparación="" con="" las="" células="" tratadas="" con="" a-msh="" o="" ibmx,="" lo="" que="" indica="" que="" la="" disminución="" de="" la="" melanina="" celular="" podría="" deberse="" a="" la="" inhibición="" de="" la="" actividad="" de="" la="" tirosinasa="" .="" por="" lo="" tanto,="" estos="" hallazgos="" muestran="" claramente="" que="" bid3="" ejerció="" efectos="" antimelanogénicos="" al="" inhibir="" la="" actividad="" de="" tirosinasa="" y="" la="" síntesis="" de="" melanina="" en="" células="" b16f10="" sin="" inducir="">

La indanona es una de las estructuras privilegiadas de la química médica y generalmente se asocia con una variedad de compuestos farmacológicamente activos [54]. El resto de indanona está presente en una variedad de productos naturales fisiológicamente activos. En vista de esto, Okpekonet al., [55] informó que un nuevo compuesto de 1-indanona se aísla de las raíces de Uvaria. Este compuesto es el primer 1-derivado de indanona aislado de plantas. Nagle et al., [56] informaron que se aisló un nuevo indano-aldehído metilado a partir de cianobacterias marinas como regulador de la angiogénesis tumoral. Del mismo modo, debido a la importancia biológica del núcleo de indanona, en los últimos años los investigadores se han centrado en desarrollar análogos de indanona farmacológicamente activos como agentes terapéuticos. La diversidad estructural de las 1-indanonas implica una variedad de respuestas biológicas y estos compuestos se pueden aplicar en agricultura y medicina. Se han desarrollado varios compuestos basados ​​en indanona como anti-Alzheimer [16,57–59], 62], agentes antimicrobianos [63,64] y antivirales [65,66]. Debido al amplio potencial de aplicación, las 1-indanonas fueron objetos interesantes para futuras investigaciones y es deseable diseñar nuevas clases para su síntesis.

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4. Conclusión

Para identificar nuevos inhibidores potentes de la tirosinasa, hemos diseñado y sintetizado trece (E)-bencilideno-1-derivados de indanona. Entre estos compuestos, (E)-2-(2,4-dihidroxi-bencilideno){ {6}},3-dihidro-1H-in-1-ona (BID3) inhibió potentemente la actividad de tirosinasa (IC50=0.034 y 1,39 mM, para L-tirosina y L-DOPA, respectivamente), que fue mejor que el compuesto de referencia, ácido kójico (IC50=13.77 mM y 33.14 mM, respectivamente). La relación estructura-actividad reveló que la presencia del grupo dihidroxilo en la posición 2 y 4-del esqueleto de (E)-bencilideno-1-indanona mejoró la actividad contra la tirosinasa. El modo de inhibición enzimática de la enzima, determinado por gráficos de Lineweaver-Burk y Dixon, indicó que BID3 es un inhibidor de tipo mixto. Los estudios de acoplamiento molecular demuestran que la unión en el sitio activo y en los sitios alostéricos son mecanismos importantes hacia la actividad inhibidora de la tirosinasa. Según estos resultados, BID3 parecía ser un potente inhibidor de la tirosinasa para el tratamiento de trastornos de la piel como la hiperpigmentación.

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